人抗苗勒激素的酶联免疫检测试剂的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶联免疫检测试剂，具体涉及人抗苗勒激素的酶联免疫检测试剂。
【背景技术】
[0002]人抗苗勒管激素(ant1-Mulerian hormone，AMH)是由两个相同的70kb亚基组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140000，与抑制素、活化素、骨形态生成蛋白及生长分化因子等构成转化生长因子β超家族。人类AMH基因位于第19号染色体短臂(19ρ13.3)，长
2.4?2.8 kb，有5个外显子，编码560个氨基酸的蛋白前体。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种人抗苗勒激素的酶联免疫检测试剂，该酶联免疫检测试剂可有效检测人抗苗勒激素，检测灵敏度达到0.lng/mlo
[0004]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:人抗苗勒激素的酶联免疫检测试剂，包括固相载体以及包被在固相载体上的抗体，抗体为抗原与孔戚血蓝蛋白藕连，免疫新西兰兔后纯化得到，所述抗体为人抗苗勒激素抗体，所述抗原为人工合成的6条多肽，6条多肽的氨基酸序列如SEQ ID NOl?SEQ ID N06所示。
[0005]与现有技术相比，本发明的优点在于人抗苗勒激素的酶联免疫检测试剂，包括固相载体以及包被在固相载体上的抗体，抗体为抗原与孔戚血蓝蛋白藕连，免疫新西兰兔后纯化得到，该抗体为人抗苗勒激素抗体，该抗原为人工合成的6条多肽，6条多肽的氨基酸序列如SEQ ID NOl?SEQ ID N06所示；该酶联免疫检测试剂可有效检测人抗苗勒激素，由于有6种抗原抗原的抗体，灵敏度较高，检测灵敏度达到0.lng/ml，为人AMH的检测提供了有效的检测手段。
【具体实施方式】
[0006]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例
[0007]一、抗原的设计:从亲水性、可及性、抗原性、可塑性、电荷分布、二级结构预测对AMH蛋白进行表位分析，设计、筛选出6条人工合成的多肽抗原(上海生工合成)，6条多肽抗原的氨基酸序列如SEQ ID NOl?SEQ ID N06所示，分别与孔戚血蓝蛋白(KLH)藕连。
[0008]二、特异性抗体的制备:免疫程序:选13只2月龄、体重1.5?2.0kg的健康新西兰大白兔，取I只作为阴性对照组，剩余12只为试验组；将13只新西兰大白兔子先适应性喂养2周，每只动物免疫前先于一侧耳缘抽取2mL静脉血，4°C静置过夜，取血清作阴性对照试剂；另外在福氏完全佐剂或不完全佐剂加入上述6种KLH偶联的抗原，其中福氏完全佐剂或不完全佐剂V:抗原溶液(6种抗原等量，总浓度SOOyg/ mL)V= 1:1，在漩涡振荡器上乳化，直至将一滴乳剂滴入水中呈现球形而不分散，得到免疫抗原试剂；初次免疫将免疫抗原试剂(抗原+完全弗氏完全佐剂)在大白兔背部多点注射，每只注射I mL。第28天用抗原+完全弗氏不完全佐剂的免疫抗原试剂大白兔肌肉注射I mL加强免疫，以后每14d加强免疫I次，第3次加强免疫后第7d,从大白兔耳缘静脉采血，采用间接酶联免疫法测定抗血清效价，若效价达不到要求，继续饲养，重复加强免疫，直至获得满意的效价；效价达到要求后，颈动脉取血收获抗血清。
[0009]三、抗体的纯化:取12mL上述抗血清，加入等体积12mL PBS (浓度0.01M, pH7.8，下同)，混匀；边搅拌边加入硫酸铵饱和溶液24mL，使成50%饱和度，4°C放60min，1000rpm离心lOmin，弃上清，用饱和硫酸铵12 mL与PBS 12 mL混合后的溶液清洗沉淀二次，去上清；将沉淀溶于12mL PBS中，滴加饱和硫酸铵溶液6mL，4°C放30min，离心去上清，重复该步一次；沉淀中加入2.4mL生理盐水，移入透析袋中，透析至析出液中没有硫酸根离子，用质量百分浓度1%的BaCl2溶液滴定检测，再换一次生理盐水透析，制得纯化抗体2.5mL。
[0010]四、纯化抗体的标记:将1mg辣根过氧化物酶溶于0.2mL戊二醛(终质量百分浓度1.25%) + PBS (终浓度0.1M，pH6.8)溶液中，室温作用18小时，透析去戊二醛。加生理盐水至lmL，加5mg纯化抗体，加入0.1mL IM碳酸盐缓冲液(pH9.6)，4° C放24小时；加入0.1mL赖氨酸(浓度0.2M)，室温作用2小时，于PBS (浓度0.15M，ρΗ7.2)中，充分透析，离心沉淀，上清即为辣根过氧化物酶标记的纯化抗体，即为人抗苗勒激素ELISA检测试剂。
[0011]五、人抗苗勒激素ELISA检测试剂的建立及检测:包被:用pH 9.5碳酸盐缓冲液稀释的人抗苗勒激素ELISA检测试剂(体积比800: 1)，包被96孔的酶标板，100 μ L/孔，共88检测孔，4°C包被过夜，阴性对照孔(用阴性对照试剂与碳酸盐缓冲液稀释包被)设4个/板，空白对照孔(碳酸盐缓冲液)设4孔/板；洗板，用自动洗板机洗板三次，5分钟/次，洗涤液TBS ;封闭:用质量百分浓度1%的BSA封闭酶标板上没有结合上抗体的位点，200 μ L/孔，室温作用I小时，洗板；加入样品或标准蛋白稀释液，10yL/孔，室温作用I小时，检测孔再加入pH 9.5碳酸盐缓冲液稀释的人抗苗勒激素ELISA检测试剂(体积比600: 1)，100 μ L/孔；检测:样品(可以为人血清、尿液、培养细胞及培养细胞上清等，内含3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)滴加入检测孔、阴性对照孔、空白对照孔中，暗处反应20分钟，加入2 N H2SO4，每孔50 μ L，终止反应，10分钟后读取OD49tl,空白管调零，样品测出OD490后查标准曲线得出样品中人抗苗勒激素的含量，由于有6种抗原的抗体共同作用，灵敏度较高，检测灵敏度达到0.lng/ml?
【主权项】
1.人抗苗勒激素的酶联免疫检测试剂，包括固相载体以及包被在固相载体上的抗体，抗体为抗原与孔戚血蓝蛋白藕连，免疫新西兰兔后纯化得到，其特征在于所述抗体为人抗苗勒激素抗体，所述抗原为人工合成的6条多肽，6条多肽的氨基酸序列如SEQ ID NOl?SEQ ID N06 所示。
【专利摘要】本发明公开了人抗苗勒激素的酶联免疫检测试剂，包括固相载体以及包被在固相载体上的抗体，抗体为抗原与孔戚血蓝蛋白藕连，免疫新西兰兔后纯化得到，该抗体为人抗苗勒激素抗体，该抗原为人工合成的6条多肽，6条多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1～SEQ ID NO6所示；该酶联免疫检测试剂可有效检测人抗苗勒激素，由于有6种抗原的抗体，灵敏度较高，检测灵敏度达到0.1ng/ml，为人AMH的检测提供了有效的检测手段。
【IPC分类】G01N33-74
【公开号】CN104865391
【申请号】CN201510226042
【发明人】薛金锋, 曾桥
【申请人】薛金锋, 曾桥
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月6日