后使用ICS分析对于T细胞评估细胞因子表达。
[0224] 酶抑制实验
[0225] 为了评估参与CMV多表位蛋白处理的各种蛋白酶的作用，LCL预先用不同的抑 制剂处理，然后用作抗原提呈细胞。这些抑制剂被特异性靶向以抑制溶酶体/内含体酸 化（80 μ M氯喹和IOmM巴弗洛霉素 Al)、再循环途径（200 μ M伯氨喹）、半胱氨酸蛋白酶 (100μΜ亮肽素和100μΜ E64)、酸性蛋白酶（胃蛋白酶抑制剂A)、自噬介质（IOmM 3-甲 基腺嘌呤（3-MA))、蛋白酶体复合物（IOyM乳酸胱氨酸、IyM环氧酶素和MG132)、高尔基 转运子（1 μ g/mL布雷菲德菌素 A和0. 7 μ g/mL莫能菌素（monensin))或氨肽酶（30 μΜ硫 醇亮氨酸（Ieucinethiol)以及0.5mM二硫苏糖醇（DTT))。使用这些抑制剂进行预处理， 然后细胞与25 μ g CMV多表位蛋白在37°C、6. 5% CO2中一起孵育两小时，用RPMI 1640介 质洗涤两次，再悬浮于生长介质中，并在37°C、6. 5% C0J?育过夜。过夜孵育后，在37°C、 6. 5% CO2中在反应物对刺激物比率4:1下将细胞暴露至CMV特异的T细胞达四小时，然后 使用ICS分析对于T细胞评估细胞因子表达。
[0226] 使用短发夹 RNA (shRNA)沉默 Atgl2 或 Sec61
[0227] 编码 ATG12shRNA(克隆 ID ΝΜ_004707· 2-485slcl，（CCGGTGTTGCAGCTTCCTACT TCAACTCGAGTTGAAGTAGGAAGCTGCAACATTTTT ;SEQ ID NO :59)或 Sec61shRNA 的（克隆 ID NM_006808. 2-410slcl, CCGGCCCAACATTTCTTGGACCAAACTCGAGTTTGGTCCAAGAAATGTTGGGTTTTT TG;SEQIDN0 :60)的大肠杆菌宿主中的基于慢病毒的载体购自Sigma-AldriCh。使用大 规模的质粒纯化试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）纯化编码shRNA的质粒。通过在HEK293T 细胞中将shRNA载体或对照载体（pLKO. Ipuro)与包装载体pHR 8.2 Λ R、以及包膜载体， pCMV-VSV-G (水泡性口炎病毒糖蛋白G)进行共转染来产生慢病毒。转染之后48和72小 时，收获含有慢病毒的上清，〇. 45 μ m过滤，并储存在-80°C。通过在ImL含有慢病毒的上清 中重悬3X IO5CEM. Tl、CEM. T2细胞或LCL，并在800g和32°C下离心30分钟进行转导。在 转导后48小时加入嘌呤霉素（1 μ g/mL)。使用相同的慢病毒载体在第十天再次感染细胞以 产生完全敲除（knock down)，在转导后5-7天细胞用于下游分析。
[0228] Western 印迹
[0229] 如前所述（Ausubel 1995)，进行Western印迹分析。简言之，将慢病毒shRNA 感染的细胞在PBS中洗涤，并根据制造商的说明用RIPA缓冲液在冰上裂解（Thermo Scientific, Rockford, IL,美国）。使用DC蛋白质分析试剂盒（(Bio-Rad实验 室，Hercules，CA，美国）对蛋白质进行定量。裂解物与SDS-PAGE上样缓冲液进行混合并 在12-15%的SDS-PAGE凝胶中分离，然后转移到硝酸纤维素膜（在预冷转移缓冲液（含 20% 甲醇的 IX Tris-甘氨酸）使用 Mini Trans-Blot 装置（Bio-Rad, CA,美国）在 IOOV 持续1小时。转移后，在洗涤缓冲液（含〇. 05% V/V吐温20的PBS)洗涤硝酸纤维素膜 三次，然后在封闭缓冲液孵育（含5%脱脂乳的PBS)中，在室温下在振荡器上1小时。将 膜孵育在兔抗 Sec61 (Thermo Scientific,澳大利亚）或兔抗 ATG12((Cell Signaling Technology, Danvers, MA)的一抗溶液（在封闭缓冲液稀释）在4°C下在摇床上中过夜。 用洗涤缓冲液将膜洗涤6次，每次10分钟，然后与缀合到辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗 (Chemicon，澳大利亚）（在封闭缓冲液中稀释）于室温下孵育1小时。将硝酸纤维素膜在 洗涤缓冲液中洗涤，使用ECL试剂（Merck，Darmstadt，德国）孵育，然后蛋白质在X射线胶 片上可见。
[0230] 统计分析
[0231] 统计分析，使用Graph Pad软件或Microsoft Office Excel 2007进行。对于CD8+T 细胞应答，计算平均值土SD并用学生t检验来确定p值。误差条表示S.E. Μ。用*、**和 ***标示之处表示与对照相比分别代表ρ〈0. 05、Ρ〈0. 01和Ρ〈0. 001统计学显著性。
[0232] 结果
[0233] CMV多表位蛋白的纯化和表征
[0234] 编码13、14、15或20个最小的⑶8+T细胞表位的CMV多表位插入体如图1中所示进 行设计。在表1中显示这些多表位序列中每个所包含的CMV表位的综合列表。这些CMV多 表位构建体转化到大肠杆菌中，蛋白表达的条件进行了优化，并在SDS-PAGE上进行分析。 从这些实验中获得的结果表明，CMV多表位蛋白（13、14、15和20mer)可以在37°C下使用在 IPTG诱导启动子下的细菌表达系统成功表达（图2A&2B)。因为线性CD8+T细胞表位的疏水 性，CMV多表位蛋白以包涵体（IB，数据未显示）的形式聚集。溶解这些IB和使用Ni-NTA 基质来纯化来自编码13、14或15个表位的构建体的CMV多表位蛋白。这一步纯化方法使 我们能够纯化这些CMV多表位蛋白至同质性（图3A-C)。然而，尽管使用两种不同的变性 剂：8M尿素和6M盐酸胍溶解IB，CMV多表位20mer的纯化并未成功。溶解CMV多表位后， 20mer蛋白质仍留在沉淀级分中；在洗脱级分中没有检测到蛋白质（图3D)。从鉴别维持的 兼容缓冲系统的溶解度试验得到的数据表明CMV多表位蛋白需要在酸性pH的MES或甘氨 酸缓冲液保持溶解（图4A)。CMV多表位纯化之后，在SDS-PAGE上分析不同浓度的蛋白以 检查完整性。在图4B-D提供的数据，显示了最少杂质和重组多表位蛋白的分子量分别为约 19、21和251^^，其分别与13、14和1511161'多表位的理论计算分子量匹配。这种一步纯化步 骤使我们从2L培养物中得到80mg的13mer、4mg的14mer和15mg的15mer蛋白质。
[0235] 使用多表位蛋白刺激后，体外扩大来自PBMC的CMV表位特异性的CD8+T细胞
[0236] 为评估CMV多表位蛋白的免疫原性，我们使用各种HLA型的CMV血清阳性供体 PBMC进行几个体外实验来扩大CMV特异性的CD8+T细胞。用纯化的CMV多表位蛋白体外刺 激来自健康供体的PBMC，然后使用ICS分析来评估抗原特异性，并与体外应答做比较。从这 些实验中获得的数据表明，13、14和15mer CMV多表位蛋白诱导对包含在多表位中的表位 特异的CMV特异性的CD8+T细胞的快速扩张（图5A)。在大多数情况下，占主导地位的CD8+T 细胞应答是针对包含在CMV多表位中的多个表位的。例如，在图5A中提供的数据显示在针 对来自个体供体PBMC的多个表位的CMV特异性的CD8+T细胞百分比上显著增加。此外，我 们还表明，CMV多表位之内的所有表位都有能力从PBMC中扩大CMV特异性的CD8+T细胞， 这些应答范围从CD8+T细胞的2至40% (图5B和5C)。特别令人感兴趣的是QIK表位，我 们的体外扩大的研宄表明，对此表位特异的T细胞在使用多表位蛋白刺激后可以扩大（图 5B)。相反，观察到极少的QEF特异性的T细胞扩大，表明该表位可能无法由人类细胞进行 有效处理。这些结果清楚地表明，包含在所述多表位蛋白的CD8+T细胞表位可以由人类细胞 有效的处理，并提呈，使用多表位蛋白致敏人类PBMC诱导CMV特异性T细胞的快速扩大。
[0237] 使用多表位蛋白刺激之后的扩大⑶8+T细胞显示多功能谱（profile)
[0238] 大量的文件证据表明，多功能CD4+和CD8 +T细胞应答在提供针对各种病毒和微 生物病原体的预防上是至关重要的（Betts，Gray等人2006 ;Darrah, Patel等人2007 ; Millington, Innes等人2007)。另外，在CMV的上下文中，多功能CD8+T细胞在肝脏移植后 防止高水平病毒复制（Nebbia, Mattes等人2008)。这些观察结果清楚地显示所述多功能 性的CD8+T细胞应答是强效CMV疫苗开发的先决条件。在我们的后续实验中，我们分析由 多表位蛋白扩大的CMV特异性的CD8+T细胞的效应物功能。设计这些分析以用来评估这些 效应细胞进行细胞溶解功能（CD107a动员）的能力和表达多种细胞因子（IFN-γ、TNF和 MIP-I β)的能力。在图6中显示来自这些分析之一的代表性数据。使用多表位扩大的大多 数CMV特异性CD8+T细胞显示强的细胞溶解功能（如CD107a动员所示），并表达多种细胞 因子（IFNy+、TNF +和 MIPl β +)。
[0239] 具有或不具有接头（linker)的CMV多表位构建体的合理设计、蛋白表达和纯化
[0240] 为了描述间隔序列在多表位蛋白的处理和提呈中的精确作用，我们设计了编码不 具有蛋白酶体接头的13个最小CD8+T细胞表位（CMVpoly)和具有蛋白酶接头的13个最小 CD8+T细胞表位（CMVpoly-PL)(图7A&7B)。将CMV多表位构建体转化到大肠杆菌，优化蛋 白表达的条件，并使用Ni-NTA色谱纯化多表位蛋白。从这些实验中获得的结果表明，无论 是CMVpoly和CMVpoly-PL都可以成功地表达并可使用细菌表达系统纯化至均质。
[0241] 体外评估具有和不具有接头的CMV多表位蛋白的免疫原性
[0242] 为调查CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL蛋白的处理和提呈，我们将人类淋 巴母细胞系（LCL)与CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL过夜孵育，然后使用细胞内的 IFN- γ分析来评估CMV特异性T细胞组的活化。在图8A呈现的代表性FACS图显示：来自 CMVpoly-PL 或 PTL 的 HLA Α2 限制性的 NLV(pp65)、HLA Al 限制性的 VTE(pp50)、HLA Β7 限 制性的RPH和TPR (pp65)比CMVpoly脉冲刺激的LCL能更有效地被处理和提呈给CMV特异 的T细胞。更重要的是，使用CMVpoly-PL或者CMVpoly-PTL脉冲刺激的LCL刺激之后，CMV 特异性的T细胞活化比CMVpoly刺激后显著更高（图8B)。总的来说，这些数据表明，为促 进对外源递送的多表位蛋白处理和提呈至抗原特异性的CD8+T细胞，需要表位之间的蛋白 酶体和/或TAP接头。
[0243] 通过TAP-非依赖性途径但是涉及蛋白酶体和自噬依赖性途径交叉提呈来自多表 位蛋白的CD8+T细胞表位
[0244] 为准确的确定来自外源加载的多表位蛋白的CD8+T细胞表位的处理和提呈途经， 在下一组实验中，我们在TAP+ (CEM. Tl)和TAP^CEM. T2和CEM. T2-HLA B7) LCL中脉冲刺激 多表位蛋白，然后暴露这些细胞至CMV特异性T细胞。在图9中的数据表示，TAP+和TAP _B 细胞都能有效地提呈来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位。为了描述多表位提呈的机制，我们 使用CEM. Tl和CEM. T2细胞作为抗原提呈细胞来刺激HLA A2限制性的NLV特异性⑶8+T细 胞。首先用抑制剂来预处理这些抗原提呈细胞，所述抑制剂针对溶酶体/内含体酸化（氯 喹和巴弗洛霉素 Al)中、再循环途径（伯氨喹）、半胱氨酸蛋白酶（亮肽素和E64)以及酸性 蛋白酶（胃酶抑素 A)，然后使用多表位蛋白脉冲刺激。在图IOA中的数据显示，不是阻断提 呈多表位蛋白，而是溶酶体、再循环途径和半胱氨酸蛋白酶抑制剂显著增加使用多表位蛋 白脉冲刺激的CEM. Tl和/或CEM. T2细胞的T细胞识别。这些观察结果表明，使用亮肽素、 E64或胃蛋白酶抑制剂A进行预处理可以保护多表位蛋白中的CD8+T细胞表位免受半胱氨 酸和酸性蛋白酶的降解。出乎意料的是，氯喹和巴弗洛霉素 Al对多表位蛋白的交叉提呈显 示出相反效果。虽然氯喹增强了在CEM. T2细胞中的抗原提呈，而使用巴弗洛霉素 Al进行 预处理则显著降低了多表位脉冲刺激的抗原提呈细胞的T细胞识别（图10A)。以前的研宄 已经表明，巴弗洛霉素 Al也是空泡H+ATP酶的强效和特异性抑制剂，并通过抑制自噬体和 溶酶体之间的融合来防止自噬泡的成熟。为探索多表位蛋白处理是否可能涉及自噬途径， 我们使用PI3K抑制剂、3-甲基腺嘌呤（3-MA)预处理抗原提呈细胞，然后暴露于CMV特异性 T细胞。呈现在图IOA中的数据显示3-MA处理也影响来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位的 呈递。这些观察结果表明，有可能多表位蛋白的交叉提呈是通过自噬依赖性途径。
[0245] 在下一组实验中，我们研宄了蛋白酶体复合物在多表位蛋白交叉提呈中的潜在作 用。使用蛋白酶体抑制剂乳胞素、环氧酶素和MG132预处理CEM. Tl和CEM. T2细胞，然后 用多表位蛋白脉冲刺激。然后，对这些细胞评估CD8+T细胞表位的提呈。在图IOB中表示 的数据表明，所有三种蛋白酶抑制剂完全阻断了来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位的提呈。 要注意的是CD8+T细胞表位的提呈不取决于免疫蛋白酶体的表达，因为不表达蛋白水解复 合物的这些成分的CEM. T2细胞，能有效地处理来自多表位蛋白的CD8+表位。我们接下来 集中在分泌途径及ER驻留氨基肽酶在提呈来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位中的潜在作 用。在图IOC中表示的数据表明，使用布雷菲德菌素 A和莫能菌素进行预处理能显著阻断 提呈给⑶8+T细胞，而硫醇亮氨酸处理对CEM. Tl和CEM. T2的T细胞识别影响极小。这些 结果表明，多表位蛋白经由蛋白酶体依赖性而ER非依赖性途径处理，其可能涉及逆转位 (retrotranslocation)途径，降解错误折叠的ER蛋白。
[0246] 为进一步阐明逆转位和自噬介导的途径在多表位交叉提呈中的影响，使用慢病毒 感染CEM. Tl和CEM. T2细胞，所述慢病毒表达shRNA用于沉默Sec61 β亚基和ATG12 (自噬 调节子12)基因。在图IlA-C中提供的数据表明，尽管shRNA表达大大减少Sec61f3亚基的 表达，这种表达的缺失对来自多表位蛋白的T细胞表位提呈影响极小。相反，在CEM. Tl和 CEM. T2细胞两者中ATG12表达的下调显著降低对CMV多表位蛋白致敏的细胞的识别。总之， 这些观察结果表明多表位蛋白的交叉提呈是通过新的途径发生的，其同时涉及蛋白酶体和 自噬途径。
[0247] 实施例2
[0248] 结合佐剂的CMV多表位蛋白的免疫原性
[0249] 材料和方法
[0250] 具有MPL和CpG 0DN1826的CMV多表位疫苗制剂
[0251] 通过在 100 μ L 体积中每剂量混合 20 μ g 的 CMVpoIyXMVpoly-PL 或 CMVpoly-PTL 与25 μ g的MPL (TLR4激动剂）和50 μ g的CpG 0DN1826 (TLR9激动剂）来配制CMV多表位 疫苗。TLR激动剂从InvivoGen (San Diego, CA,美国）·购得。
[0252] 小鼠免疫
[0253] 含有具有破坏小鼠 MHC I类的人HLA-A*0201的HHD 1小鼠进行饲养并在QMR下 保持在无特定病原体的条件下。所有协议都遵照QMR动物伦理委员会。使用上述特定的 佐剂组合配制的CMV多表位疫苗对每组中至少5个（M1-5)六到八周龄小鼠在尾巴的基部 进行皮下免疫（s. c.)。使用相同的疫苗制剂在第21天对小鼠进行加强，以及在第35天处 死小鼠，用细胞内细胞因子染色（ICS)分析来确定多表位特异性CD8+T细胞应答。
[0254] 脾细胞的制备
[0255] 通过CO2窒息处死小鼠，并将脾脏收集在3mL的小鼠 T细胞培养介质（补充有10% FBS、100IU/mL青霉素、200 μ8/ιΛ硫酸链霉素、β巯基乙醇、非必需氨基酸和丙酮酸钠的 DMEM)中。单细胞悬浮液通过用注射器的柱塞轻轻捣碎脾脏制备。将细胞以1200rpm离心5 分钟，重新悬浮于3mL的氯化铵和Tris缓冲液（0. 017M Tris碱在0. 89%氯化铵，pH7. 4)， 在室温下孵育5分钟以耗尽红细胞。将细胞离心，用含2% FBS的PBS洗涤两次并重新悬 浮于5mL的小鼠 T细胞培养介质中。为除去多余的组织和细胞碎片，最终细胞悬浮液通过 70 μ m的细胞过滤网（Becton Dickinson, San Diego,美国）过滤。然后用台盼蓝排除法测 定细胞存活率。
[0256] 体外刺激和扩大来自免疫小鼠的CMV特异性T细胞
[0257] 在37°C、6. 5 % CO2，在100 μ L小鼠 T细胞培养介质中，使用1 μ g的HLA A2限制 的NLV和VLE肽刺激来自接种小鼠的约5 X IO6个脾细胞达2小时。孵育后，加入ImL小鼠 T细胞培养介质，将细胞转移到24孔板并在37°C、6. 5% CO2中培养10天。在第三天和第 六天，对培养物补充ImL的含100U的重组IL-2的T细胞培养介质。使用标准的IFN- γ ICS 分析评估这些体外扩大细胞的T细胞特异性。此外，使用多参数流式细胞仪对这些培养物 中的T细胞也评估多功能能力。
[0258] 细胞内细胞因子染色以评估在小鼠 T细胞中的IFN-γ应答
[0259] NLV和VLE的体外刺激后，50 μ L的小鼠 T细胞培养介质中大约2 X IO5小鼠脾细 胞加入到所需的孔中。为刺激这些细胞，加入0. 2 μ g NLV和VLE肽，然后含有0. 3 μ L布雷 菲德菌素 A的150 yL DMEM(BD Pharmingen公司，圣地亚哥，CA)加入到每个孔中，并孵育 在37°C、10% CO2四小时。用含2% FCS的PBS(洗涤缓冲液）洗涤细胞两次，染色由APC 缀合的抗⑶3, FITC缀合的抗⑶4和PerCP-Cy5. 5缀合的抗⑶8单克隆抗体的表面重新悬 浮在洗涤缓冲液并在4°C孵育30分钟。将细胞用洗涤缓冲液洗涤两次，用100 μ L/孔的 Cytofix/Cytoperm固定并用Perm/Wash缓冲液洗绦两次。然后，用PE缀合的抗IFN-γ单 克隆抗体在4°C下对细胞进行30分钟细胞内染色，用Perm/Wash缓冲液将细胞洗涤两次，并 在 BD FACSCanto II 上获得。
[0260] 多参数流式细胞仪评估在疫苗接种小鼠中的免疫应答
[0261] 疫苗接种后，如上所述离体刺激脾细胞。将细胞用FITC-缀合的抗CD4和 PerCP-Cy5. 5缀合的抗⑶8在4°C进行表面染色30分钟。在洗涤后，固定和透化后，使用PE 缀合的抗IFN-γ、PE-Cy7缀合的抗TNF以及APC缀合的抗IL2抗体对细胞进行细胞内染 色。在BD FACSCanto II上获得细胞，使用FlowJo软件和Boolean gate分析对数据进行 分析。
[0262] 结果
[0263] 在最初的研宄中，基于CMV编码的糖蛋白B(gB)和多表位蛋白的亚基疫苗制剂与 人相容的TLR激动剂组合进行了测试。多表位蛋白包含多个来自CMV不同抗原的最小的HLA I类限制性的⑶8+T细胞表位。这种亚基疫苗产生持久的抗病毒抗体，Thl型⑶4+和⑶8 +T 细胞应答。由疫苗诱导的体液免疫应答显示强的中和能力以及抗原特异性T细胞表达保持 长期记忆的多种细胞因子。此外，这种亚基CMV疫苗，通过TLR4和TLR9的激活，激活表达 IL12p70、IFN-α，IL-6和TNF-α的不同树突细胞（DC)子集，其在抗原特异性T细胞的活 化中发挥关键作用。
[0264] 具有和不具有接头的CMV多表位蛋白的免疫原性的体内评价
[0265] 为了确定CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL的免疫原性，我们接下来评价 了结合TLR4和TLR9激动剂的多表位蛋白的免疫原性。使用CMVpo Iy、CMVpo Iy-PL及 CMVpoly-PTL免疫表达人HLA A2MHC I类等位基因的HHD-I转基因小鼠。接种后，使用HLA A2限制性的NLV和VLE肽在体外刺激脾细胞。为分析在体外刺激的脾细胞中建立的CMV多 表位特异的应答，使用细胞内IFN-γ分析来评估CMVpoly特异性（HLA A2限制性表位NLV 和VLE)CD8+T细胞的存在。有趣的是，与体外数据一致的是，与使用CMVpoly疫苗制剂免疫 的小鼠相比，使用CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL疫苗制剂免疫的小鼠显著地更高频率地诱导 CMV多表位特异性的⑶8+T细胞（图12A)。此外，还有大量的证据表明，基于T细胞疫苗的 保护效力与多功能效应的频率相关。因此在随后的实验中，我们评估了 CMV特异性CD8+T细 胞应答的功能质量。在体外扩大来自免疫小鼠的脾细胞之后，使用多参数流式细胞仪来确 定IL-2、TNF和IFN-Y生产的模式。在图12B中表示的数据清楚地表明，⑶8+T细胞显示更 高的多功能性；最重要的是，与使用CMVpoly疫苗相比，在使用CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL 疫苗免疫的小鼠中，更高频率的⑶8+T细胞是IFN-γ和TNF生产者。总之，这些观察结果 清楚地表明，基于佐有TLR4和TLR9激动剂两者的CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL的CMV疫苗 制剂最有效地诱导具有多功能能力的CMV特异性CD8+T细胞。
[0266] 讨论
[0267] 新出现的证据表明在健康CMV血清阳性个体中的CMV特异性CD8+T细胞应答针 对多个CMV抗原，主要为pp65和IE1，但还针对其它结构、早期/晚期抗原和免疫调节剂 (pp28、PP50、ppl50、IE2gH、gB、US2、US3、US6 和 UL18) (Elkington, Walker 等人，2003 ; Elkington, Shoukry 等人，2004 ;Manley, L