用于治疗癌症和病毒感染的免疫受体调节的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及免疫受体CD96。更具体地，本发明涉及CD96的抑制，从而提高免疫系统 靶向肿瘤和其它能逃逸免疫系统的疾病或病症的能力。
【背景技术】
[0002] 有效免疫应答的进展需要通过若干免疫的检查点。通路可能需要兴奋性共刺激信 号的存在，或者负面的或共抑制信号的逃避，负面的或共抑制信号作用于降低或终止免疫 活性。免疫球蛋白超家族在这种免疫应答的协调中占据着核心重要地位，并且⑶28/细胞毒 T淋巴细胞抗原-4((：11^-4):87.1/87.2受体/配体组合代表了这些免疫调节因子的原型实 例。这些检查点的部分作用是监视不需要的和有害的自主(self-directed)活性的可能性。 虽然这是一种必要的功能，有助于自体免疫的预防，但是它可能充当旨在靶向恶性的自体 细胞的成功的免疫治疗的障碍，其中恶性的自体细胞主要显示与它们所衍生来自的细胞相 同的表面分子阵列。旨在克服这些外周耐受机制的治疗，特别是通过封闭在T细胞上抑制性 检查点，提供了产生抗肿瘤活性的潜力，或者作为单一治疗或与其它治疗协同作用，直接或 间接的提高肿瘤表位提呈至免疫系统。此种抗T细胞检查点的抗体在晚期人类癌症的早期 临床试验中显示出前景。
[0003] 此外，自然杀伤(NK)细胞是限制早期肿瘤生长和转移的关键的先天（innate)淋巴 细胞、NK细胞功能同样是通过广泛的激活和抑制受体的信号传递的整合来调节 2。例如，病 原体来源的或压力诱导的配体被激活受体如NCRs、NKG2D、或DNAM-1识别，刺激NK细胞细胞 毒性和促炎介质的分泌，如干扰素 γ (IFN-γ )3。相反地，抑制性受体保护靶细胞免受NK细 胞介导的杀伤4。这些受体主要地识别MHC I类和MHC I类相关分子，以及包括KIR(杀伤细胞 免疫球蛋白样受体)和LIR(白细胞免疫球蛋白样受体)家族，小鼠中Ly49家族和在两物种中 的CD94/NKG2异二聚体。
[0004]最近已描述了免疫球蛋白超家族成员的新出现的组与粘连蛋白和粘连蛋白样 (necl)家族的配体相互作用，影响NK细胞和T细胞功能5。这些包括CD226(DNAM-1)6、CD96 (TACTILE) 7、TIGIT(T细胞免疫球蛋白和Ι??Μ结构域)8'9、和CRTAM(I类限制性T细胞相关分 子） 1(\DNAM-1和TIGIT是该家族最广泛研究的成员，并且它们共享共同的配体，CD 155 (1^(：1-5;?￥10和〇)112(粘连蛋白-2;?￥此2) 8'11。1'1611'还结合额外的配体〇)113(?￥此3)8。据 报道，在NK细胞上DNAM-1和TIGIT的功能是平衡的（counter-balancing) 12。在体外，DNAM-1 加强NK细胞对广泛的肿瘤细胞的细胞毒性13，14,并且在体内对肿瘤的免疫监视至关重 要 13'15'16。相反地，!'1611'携带11'頂基序，并且已经提出与抑制性1^49或1(11?与册1(：1类分子的 相互作用相似地防止自体组织损伤 17。确实，在体外⑶155结合(engagement )TIGIT已经显示 了限制IFNy产生和NK细胞的细胞毒性18'19。然而在体内，NK细胞生物学中TIGIT的作用相对 于其它粘连蛋白受体DNAM-1和⑶96仍有待评估。
[0005] 尽管在20年前已被克隆7,关于⑶96,与DNAM-1和TIGIT共享⑶155配体的其它Ig家 族成员，所知甚少2Q，21。在人类中，CD96表达主要局限于NK细胞、CD8T细胞、和⑶4T细胞 7。 ⑶96的主要配体是⑶155，但是还有报道⑶96与⑶111 (粘连蛋白-1)有关，并且在促进NK和T 细胞粘附中起作用21，22。
【发明内容】
[0006] 出人意料地，本发明人已经发现了⑶96充当Τ细胞和ΝΚ细胞抗肿瘤功能的负调节 因子。相应地，本发明广泛涉及试剂的用途，所述试剂至少部分封闭或抑制CD96,从而减少 或缓解CD96介导的免疫抑制，在哺乳动物中提高或恢复免疫监视。在某些实施方案中，这可 促进至少对CD96部分封闭或抑制应答的疾病或病症的治疗，例如癌症和/或病毒感染。
[0007] 在第一方面中，本发明提供了一种在哺乳动物中减少或缓解免疫抑制的方法，所 述方法包括在一种或更多种哺乳动物的细胞中至少部分抑制或减少CD96活性的步骤，从而 在哺乳动物中缓解免疫抑制以及或提高或恢复免疫监视。
[0008] 适当地，在哺乳动物中抑制或减少CD96活性的步骤不包括或至少不依赖于杀伤哺 乳动物中表达CD96的细胞。优选地，在哺乳动物中抑制或减少CD96活性的步骤包括在一种 或更多种表达CD96的哺乳动物的细胞中抑制或减少CD96结合CD155和/或细胞内信号传导。
[0009] 在一个具体的实施方案中，在哺乳动物中抑制或减少CD96活性的步骤包括增加或 提高一种或更多种细胞因子或趋化因子的表达、产生和/或分泌。优选地，所述细胞因子是 干扰素 γ (IFN-γ )。典型地，一种或更多种哺乳动物的细胞是Τ细胞，包括⑶4+和⑶8+Τ细胞、 γδΤ细胞、ΝΚΤ细胞、以及自然杀伤(ΝΚ)细胞。
[0010] 在一个优选的实施方案中，所述方法在哺乳动物中缓解免疫抑制和/或提高或恢 复免疫监视，从而在哺乳动物中治疗或预防癌症或癌症转移。
[0011] 在其它实施方案中，所述方法在哺乳动物中缓解免疫抑制和/或提高或恢复免疫 监视，从而在哺乳动物中治疗或预防病毒感染。
[0012] 在第二方面中，本发明提供了一种筛选、设计、工程化或者生产CD96抑制试剂的方 法，所述方法包括测定候选分子是否能够至少部分抑制或减少CD96活性、从而在哺乳动物 中缓解免疫抑制和/或提高或恢复免疫监视的步骤。
[0013] 在第三方面中，本发明提供了一种根据第二方面的方法筛选、设计、工程化或者生 产的⑶96抑制试剂。
[0014] 在一个实施方案中，所述CD96抑制试剂是抗体或抗体片段。
[0015] 在一个具体地实施方案中，所述⑶96抑制试剂是一种抗癌症试剂。
[0016] 在另一个具体地实施方案中，所述⑶96抑制试剂是一种抗病毒试剂。
[0017] 在第四方面中，本发明提供了根据本发明第三方面的CD96抑制试剂，其用于根据 本发明第一方面的方法。
[0018] 适当地，根据上述的方面，所述哺乳动物是人类。
[0019] 除非文中另有要求，术语"包括（compr i se )"、"包含（compr i ses )"和"含有 (comprising)"、或类似术语旨在表示非排他性的包括，如此要素和特征的列举不仅包括阐 明的或列举的要素，但可能包括其它未列举或阐明的要素或特征。
[0020]本文所使用的不定冠词"一个(a)"和"一种(an)"指的是包含单数或复数要素或特 征，并且不应作为表示或定义为"单一 (one)"或"单独(single)"要素或特征。
【附图说明】
[0021] 图1:⑶96与DNAM-1竞争结合⑶155。&、13通过流式细胞术分析所示的来自C57BL/ 6WT(浅灰)和⑶96 v_小鼠（深灰）的脾淋巴细胞群的⑶96的表达。显示来自3个实验中的一个 代表性实验的3只小鼠的代表性FACS柱状图（a)和平均值±50卬）。(：、(1在新鲜分离的或使用 IL-2(1000U/ml)激活48小时的野生型脾NK细胞上测定CD96、DNAM-1和TIGIT的表达。e.通过 流式细胞术，在所示的浓度评估偶联有AF-647的小鼠 CD 155-Fc与新鲜分离自WT、CD96+、 DNAM-l+SDNAM-r/TDgel小鼠的纯化的NK细胞的结合。f.在存在抗⑶96和或抗DNAM-lmAb时，在纯化的WT NK细胞上分析偶联有AF-647(10μg/ml)的CD155-Fc的结合。g.在存在 50μg/ml的对照Ig、重组CD96或TIGIT-Fc时，分析在BMDC的细胞表面上标记有AF-647(0.5-l〇μg/ml)的DNAM-1-Fc的结合。c-g.显示来自至少3个实验中的一个代表性实验的一式三份 的孔的代表性FACS柱状图和平均值土SD。林*ρ〈0·001，Τ检验(Student T text)。
[0022] 图2:CD155结合CD96调节NK细胞IFNy的产生。CD96结合CD155-Fc限制通过外源性 细胞因子(a、b、d)和NK细胞受体(c)诱导的NK细胞IFN-γ的产生。a、b、d.使用包被有或没有 CD155-Fc(0.5yg/孔）的板，我们分析了在存在或不存在抗CD96抗体(50μ/πι1)时，新鲜纯化 的CD96- Λ、TIGIT-Λ和WT ΝΚ细胞对IL-12(25-100pg/ml)和IL-18(50ng/ml)应答细胞内产生 的IFN- γ。c.使用包被有抗NK-1.1 (2.5yg/孔)和CD155-Fc(0.5yg/孔）的板，我们分析了被 IL-2激活的来自⑶96-Λ和WT小鼠的NK细胞细胞内产生的IFN- γ。显示来自3个实验中的一 个代表性实验的一式三份的孔的代表性FACS柱状图（a)和平均值土 30(13、〇、(1)。邙〈0.05、** ρ〈0·01、***ρ〈0·001，Τ 检验。
[0023] 图3:CD96限制依赖ΝΚ细胞的肿瘤免疫监视。a、b.CD96和DNAM-1在B16F10转移的控 制中具有相反的作用。a.2xl05B16F10细胞静脉注射至WTXDge^'DNAM-r/lPDNAM-r/- CD96+小鼠，并且在14天后定量在肺中的转移负荷。3个实验中的代表性实验。b.图片显示 在注射2xl05和5xl0 5B16F10细胞两周后WT和⑶96v_小鼠的肺。两个实验中的代表性实验。c. 在B16F10细胞表面⑶96和TIGIT与DNAM-1竞争结合⑶155。存在50μg/ml的对照Ig、重组⑶96 或TIGIT-Fc时，分析在B16F10细胞的细胞表面上标记有AF-647(0.5-20μg/ml)的DNAM-1-Fc 的结合。显示来自3个实验中的一个代表性实验的一式三份的孔的代表性FACS柱状图和平 均值土 SDd.以所示的效靶比，在B16F10细胞和来自WT、DNAM-1V-和CD96-/―小鼠的IL-2激活 的NK细胞之间进行4小时的 51Cr释放试验。实心圆代表WT NK细胞，空心圆代表⑶96V_NK细胞 以及实心方块代表DNAM-1V_NK细胞。e-h.在NK细胞介导的MCA诱导的纤维肉瘤的免疫监视 中，CD96和DNAM-1具有相反的作用。e-h使用MCA(100yg/小鼠）注射15-30只雄性WT、DNAM-和DNAM-l+CDgel小鼠的组。显示具有肉瘤的个体小鼠的生存(e-g)和生长曲 线(h)。f.使用如材料和方法中定义的抗⑶96、抗DNAM-1或者抗⑶155mAb处理WT小鼠。g.使 用100yg MCA注射WT和⑶96+小鼠，并且使用对照抗体、抗IFN- γ抗体、或者抗去唾液酸 (&81&1。）6]\11处理。*卩〈0.05]\&1^61-〇31检验。
[0024]图4:抗⑶96mAb具有单独试剂活性并且提高抗H)1的抗肿瘤应答。使用AT3-0VAdim 肿瘤细胞（106细胞）皮下注射0578176野生型（11')小鼠，并且在第16、20和24天使用抗 CD96mAb(3 · 3，250yg i ·p ·)或者抗PD-1 (RMP1-14，250yg，i ·p ·)腹腔注射处理。显示每组5只 小鼠的平均值土 SEM(mm2) (*: p〈0 · 05通过Mann-Whitney检验与单独clg对比）。
[0025] 图5:抗⑶96mAb提高通过阿霉素(D0X)化疗产生的抗肿瘤应答。使用AT3-0VAdim肿 瘤细胞（1〇 6细胞)皮下注射C57BL/6野生型(￥1')、0嫩1-1_/_和〇)96_/_小鼠，并且在第14天使 用对照PBS或者D0X (50微升，2mM，瘤内）处理。WT小鼠的一些组还在第12、14、18、21、24和28 天接受抗CD96mAb(3.3，250yg，i . p.)或者抗DNAM-1 (480.1，250yg，i . p.)的腹腔注射。显示 每组5只小鼠的平均值土 SEM(mm2)。
[0026] 图6:宿主⑶96缺陷提高阿霉素(D0X)化疗的抗肿瘤应答。使用AT3-0VAdim肿瘤细胞 (1〇 6细胞)皮下注射C57BL/6野生型(WT)、DNAM-1V1PCD96V_小鼠，并且在第16天使用对照 PBS或者D0X(50微升，2mM，瘤内）处理。显示每组5只小鼠的平均值土标准误(mm2)。
[0027] 图7:抗⑶96mAb提高由阿霉素(D0X)化疗产生的抗肿瘤应答。使用AT3-0VAdim肿瘤 细胞（1〇 6细胞)皮下注射C57BL/6野生型(WT)小鼠，并且在第16天使用对照ros或者D0X(50 微升，2mM，瘤内）处理。WT小鼠的一些组还在第16、20和23天接受抗CD96mAb (3.3，250yg， i . P.)的腹腔注射。显示每组5只小鼠的平均值土 SEM(mm2) (*: p〈0.05通过Mann-Whitney检 验与单独clg对比）。
[0028] 图8:早期抗CD96mAb提高由抗PD-1和抗CTLA-4mAb产生的抗肿瘤应答。使用B16-0VA黑色素瘤细胞（105细胞)皮下注射C57BL/6