热稳定性淀粉合成酶基因的表达提高在热应力下的产量的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年8月14日递交的美国临时专利申请No.61/865,767,名称为热 稳定性淀粉合成酶基因的表达提高在热应力下的产量的优先权，其全部内容通过全文引用 的方式并入本申请中。
[0003] 序列表
[0004] 以下申请包含计算机可读形式(CRF)的序列表，该序列表作为文本文件以ASCII的 格式命名为"序列表"提交，大小为133KB，创建于2014年8月12日。CRF的内容在此通过全文 引用的方式并入本申请。仅示出各核酸序列的一条链，但是互补链应理解为与所示的链通 过任何参考的形式包括在内。
技术领域
[0005] 本发明涉及一种在热应力条件下具有增加的耐受性和产量的遗传修饰植物。
【背景技术】
[0006] 淀粉合成酶(SS)，其包括可溶性淀粉合成酶(SSS)，是在植物中淀粉沉积和储存中 的关键酶。在白天通过光合作用固定碳的过程中淀粉在叶片的质体中合成，其随后在夜间 被转移到贮藏器官。淀粉由两种D-葡萄糖均聚物组成:直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是通 过α(1_4)连接的D-葡萄糖单体的直链，且通常构成淀粉的约30%。支链淀粉通过α(1-6)连 接的高度支链化的单体连接直链。淀粉的生物合成发生在绿色光合作用组织中的叶绿体 中，以及在非绿色组织淀粉体如胚乳中。在种子的胚乳中，支链淀粉的生物合成需要一系列 的协调合适的酶反应，所述酶反应涉及的酶包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP酶），四种不同 的可溶性淀粉合成酶(SSI-IV)，淀粉分支酶(BE)和淀粉脱支酶(DBE)，而直链淀粉的生物合 成仅需要AGP酶和颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)。可能质体淀粉磷酸化酶(Phol)也对淀粉生 物合成反应中的引物形成起重要的作用。在高等植物中，AGP酶从Glc-1-P和ATP产生ADP-Glc和焦磷酸(PPi)。淀粉合成酶通过将ADP-Glc的葡萄糖基单元转移到葡聚糖链的非还原 端生成线性葡聚糖链。在谷类胚乳中，淀粉合成酶的一些亚型已经被确定，包括GBSS、SSI、 SSII、SSIII和SSIVXBSS有两种亚型，大多存在于(confined to)贮藏组织且参与直链淀粉 的合成，而不同的淀粉合成酶亚型，连同一些直连淀粉，主要参与支链淀粉的形成。在水稻 中，在籽粒灌浆期SSIIa和SSIIIa转录是最多的，同时在预贮存阶段发现SSIIb和SSIIIb转 录，这表明SSIIa和SSIIIa相对于其他的SS酶在水稻的淀粉生物合成中起到至关重要的作 用。尽管水稻仅具有一个SSI亚基，存在任何一种SSI或SSIIIa基因都可以在水稻中持续淀 粉生物合成。SSI已经显示出比SSIIIa更高的活性，且构成总SS活性的70%。类似的结果已 经在小麦发育中的胚乳(developing endosperm)和玉米胚乳的可溶性部分中发现。这些观 察提出SSI对淀粉生物合成是关键的。SSI优选合成短链，而支链淀粉合成的进一步链延长 通过其他SS酶进行。
[0007] 小麦(Triticum aestivum L.)是约36%的世界人口的最重要的主要粮作物。在干 燥的小麦种子中，淀粉是占谷物干重75-85%的最丰富的成分。因此，谷物产量(基于每单位 面积的种子数目和单个种子重量)在很大程度上依赖于生长中的胚乳内的淀粉沉积。然而， 高温对不同作物在籽粒灌浆期中胚乳内的淀粉沉积具有显著的不利影响，可能通过高温失 活可溶性淀粉合成酶。例如，温度高于25°C显著降低小麦胚乳中的可溶性淀粉合成酶的活 性。全球40%的小麦总产量受到最终热应力的影响。热应力通常通过降低产量和品质影响 小麦产量。因此，本领域有提高各种植物包括小麦对热应力的耐受性的需要。
【发明内容】
[0008] 本发明广义地涉及与对照植物相比具有对热应力增加的耐受性的遗传修饰植物。 所述遗传修饰植物包含编码具有淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白的外源核酸。
[0009] 还提供了提高植物对热应力耐受性的方法。所述方法包括通过用编码具有淀粉合 成酶活性的热稳定性蛋白的外源核酸转化植物以产生转化的植物，由此提高转化的植物对 热应力耐受性。
[0010] 还描述了一种生产与对比植物相比具有对热应力增加的耐受性的遗传修饰植物 的方法。该方法包括将第一种亲本植物与第二种亲本植物杂交，从而由此产生子代，其中所 述第一种亲本植物或第二亲本植物中的至少一种是如本文所描述的遗传修饰植物。有利的 是，所述子代与对照植物相比，具有对热应力增加的耐受性。还公开了根据所描述的方法生 产的遗传修饰种子。
[0011] 本发明还公开了重组植物细胞。通过用编码热稳定性蛋白的核酸构建体稳定转 化，所述重组植物细胞含有过量表达的具有淀粉合成酶活性的外源性热稳定性蛋白。本发 明的各种实施例的附加特征在下文中更详细地描述。
【附图说明】
[0012] 图1示出：（a)含有Ubip(玉米泛素启动子）的构建体PAHC17,来自水稻可溶性淀粉 合成酶1基因的SSI-CDNA，以及NosT(胭脂氨酸合成酶基因终止子）；（b)具有水稻可溶性淀 粉合成酶1基因的构建体PJL10P5，以及DY10 (高分子量的麦谷蛋白的启动子）；以及(c)具有 BAR基因的构建体pAHC20,其能够赋予对除草剂草铵膦（glufosinate)和双丙氨磷 (bialaphos)抗性。
[0013] 图2是对来自三个T2代转基因小麦事件和非转基因 Bobwhite(BW)对照的Southern 印迹分析的图像，其中Ubl为：具有泛素启动子的事件#1286;Ub2为：具有泛素启动子的事 件#1700 ;DylO:具有DylO启动子的事件#2173;以及BW:非转基因的Bobwhite品种；
[0014]图3是显示以下的图像：（a)叶片样本(左）和种子样本(右）的逆转录酶(RT)-PCR， 其中Pis:具有SSI基因的质粒DNA;Ubl:具有泛素启动子的事件#1286;Ub2:具有泛素启动子 的事件#1700;Dyl0:具有DylO启动子的事件#2173;以及BW:非转基因的Bobwhite品种；以及 (b)叶片样本(左)和种子样本(右)使用微管蛋白基因引物的RT-PCR，其中gDNA为:BW的基因 组 DNA;
[0015] 图4示出使用来自三个T2代转基因小麦事件、一个非转基因 Bobwhite(BW)、以及一 个水稻样本的种子和叶片样本进行Western印迹分析的图像；
[0016] 图5为(a)热处理(32/28Γ)后的对照种子和转基因种子的照片；以及(b)显示转基 因品系的千粒重(TKW)超过对照bobwhite种子的百分比的图，其中，*表示P<0.05;以及
[0017] 图6显示了在升高的温度（32 °C)和最佳生长条件20°C下（a)非转基因对照 Bobwhi te的愈合组织与(b)事件2205M-2的转基因愈合组织的生长比较的照片。
【具体实施方式】
[0018] 更详细地，本发明涉及遗传修饰植物，以及制备其的方法和使用其提高植物的热 应力耐受性的方法。除非上下文另外指出，本文的"植物"或"多个植物"包括植物的组织，器 官，或其部分(例如，叶，莖，块茎，枝条，根，花，芽），果实或其细胞。还提供了制造这种非天 然存在的，遗传修饰植物(又名"转基因"植物）的方法，连同在该方法中有用的核酸构建体 和载体。本发明适用于各种植物，包括单子叶植物（即，具有一个子叶（seed-leaf)的植物， 又名"单子叶植物"）和双子叶植物（即，具有两个子叶的植物，又名"双子叶植物"）二者。适 用于所公开的实施例的非限制性的植物样本包括谷物(例如，小麦，燕麦，大麦，水稻，玉米， 小米，黑麦，高粱，黑小麦，荞麦，藜麦），豆类(例如，大豆，菜豆，豌豆，苜蓿），块茎类(例如， 马铃薯，甘薯，木薯，山药），以及类似物。
[0019] 当植物在短时间例如几小时或几天经受比正常植物生长温度至少高约7°C的升高 的生长温度，以及在较长时间例如几天或几周经受比正常植物生长温度至少高约4°C的升 高的生长温度，发生热应力。本发明特别涉及对植物生长的淀粉合成期间（例如，种子灌浆 期)遭受升高的温度的增强的耐受性。在本发明上下文中的术语"升高的"生长温度，指等于 或高于该植物生长的温度和/或收获的温度，包括在植物中的内源性淀粉合成酶的活性的 降低或失活的温度。"正常的"植物生长条件或温度是指对于大多数本领域已知的物种所提 出的最佳生长和/或收获的条件或温度范围。例如，植物如小麦优选自约15 °C和约20 °C之间 的最佳温度。对于植物例如玉米的最佳温度在约20 °C至约23 °C之间。植物例如高粱优选自 约25°C至约28°C之间用于生殖生长的日间温度。植物例如大豆优选日间温度约为29°C。通 常，用于大多数植物的优选的夜间温度是比日间温度低约2°C至约5°C。
[0020] 根据本发明的遗传修饰植物具有对热应力增加的耐受性，其中术语"耐受性"指植 物在其正常的生长条件外的条件下连续生长和产生产量的能力。当在升高的生长温度下转 基因植物的生长、发育和/或产量优于对照植物的生长、发育和/或产量，甚至转基因植物不 完全抵抗热应力或不受热应力影响，转基因植物的热耐受性被认为是"增加的"。增加的"产 量"将取决于修饰植物的特定种类且其本身可以表现为一个或多个以下内容:a)基于单粒 种子和/或每株植物和/或每亩的总种子重量，大小或体积的增加，b)增加的千粒重(TKW)， 千粒重为一千粒小麦的以克为单位的重量;c)每株植物增加的花数;d)增加的生物质；和/ 或e)增加的收获指数，其表述为可收获的部分例如种子的产量除以总生物量之比。增加的 TKW可以由增加的种子大小和/或种子重量产生，并且也可以由增加的胚芽和/或胚乳大小 产生。本发明特别涉及在在升高的生长温度下植物发育的淀粉合成期间与对照植物相比具 有增加的产量的修饰的植物。
[0021] 有利的是，不同于许多其它的转基因植物，根据本发明的植物具有基本上类似于 并且在一些情况下，几乎等同于相同种类的野生型植物的表型/形态（当该种野生型植物在 非压力条件下生长时）。换句话说，在转基因植物和野生型植物之间，形状，大小和/或种子 的丰度，叶片和/或水果/蔬菜是基本上类似的。当在相同的正常生长条件下生长时，如果本 领域技术人员视觉区别遗传修饰植物和对照植物有困难，这些植物在本文中被认为是"基 本上类似的"。相反的，当在热应力下生长时，根据本发明的各种实施例的转基因植物与在 相同条件下生长的对照植物相比具有显著提高的形态。例如，当在热应力下生长时所述转 基因植物与对照植物相比可以具有一个或多个以下改进的形态或物理特征：旺盛的生长， 丰富的叶片，更长的初生根和高度等。因此，在遗传修饰植物中形态或表型没有不利影响。
[0022] 遗传修饰植物包含编码具有淀粉合成酶活性并优选具有可溶性淀粉合成酶活性 的热稳定性蛋白的外源核酸。术语"可溶性淀粉合成酶活性"或"淀粉合成酶活性"是指淀粉 例如可溶性淀粉的蛋白/酶生物合成。术语"外源的"在本文中指来自宿主植物以外（即外 源）来源的核酸序列（例如，DNA，RNA)，基因或蛋白，其被引入宿主植物以创建转基因的植 物。例如，在此处使用的上述术语涉及到编码核酸的表达，是指以可表达的形式将外源编码 核酸引入宿主植物。换句话说，核酸对特定植物不是天然的，和/或不是从特定植物衍生的。 相反的，在本文中使用的术语"内源的"与"天然的"可互换且指在对照植物或野生型植物中 发现的或与对照植物或野生型植物天然相关的核酸序列，基因，基因产物，蛋白等。
[0023] 在一个或多个实施例中，编码热稳定性淀粉合成酶蛋白的外源核酸也是异源的。 术语"异源的"是指衍生自参考种类之外的来源的遗传材料，且与"同源的"相反，"同源的" 指从宿主植物（尽管不必为宿主植物本身）的种类衍生的，与其天然相关的或源自其 (native to)的遗传材料。例如，在本发明的一些实施例中，转基因植物通过将一个种类的 用于编码淀粉合成酶的遗传物质引入不同种类的宿