中使用的合适的载体的例子包括口六〇120、？几1(^5、?61111^、?八〇117和类似物。
[0039] 在本文中使用的术语"转化"指将外源的DNA引入细胞。转化可以通过多种本领域 已知且在本文中描述的方式完成。
[0040] 当术语"分离的"使用于核酸或蛋白时，指在通常与其天然环境相关的从至少一种 污染的核苷酸或氨基酸中被鉴别和分离的序列。即分离的核酸或蛋白是以与其天然存在的 不同的形式或设置存在的核酸或蛋白。
[0041] 本文中使用的术语"序列同一性"或"氨基酸同一性"用以描述两个或多个核酸或 氨基酸序列当在特定的比较窗之间进行最大相关的比对时序列之间的关系。"同一性"的百 分比通过在比较窗比较两个最佳比对的序列来确定。对于两个序列的"最佳比对"，可以理 解为，在比较窗口中的序列部分可以包括缺口（例如，缺失或添加），相比于不包含添加或缺 失的参考序列。比对之后，匹配位置（即其中相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中都 出现的位置）的数目被确定，然后除以比较窗中位置的总数。这个结果再乘以1〇〇来计算的 序列或氨基酸同一性的百分比。应该理解为，与参考序列具有一定百分比的序列同一性的 序列不一定要具有相同的核苷酸或氨基酸总数(参见例如，如上所讨论的微小RNA)。因此， 具有一定水平"同一性"的序列包含对应于参考序列的仅一部分（即5'非编码区，3'非编码 区，编码区等)的序列。
[0042]如本文所使用，在两个或多个项目中使用的短语"和/或"是指所列出的项目中的 任何一个可以单独使用或两种或多种列出的项目的任意组合使用。例如，如果组合物被描 述为含有或不含有组分A，B和/或C，则组合物可以含有或仅排除A;含有或仅排除B;含有或 仅排除C;含有或仅排除A和B组合;含有或仅排除A和C组合;含有或仅排除B和C组合;或含有 或仅排除A，B和C的组合。
[0043]本说明书也使用数值范围来量化涉及本发明的各种实施例的某些参数。应当理解 为，当提供数值范围时，这样的范围应被理解为仅记载了该范围的较低值的权利要求和仅 记载了该范围的最高值的权利要求限制提供文字支持。例如，公开的约10至约100的数值范 围是为记载"大于约10"（无上限）的权利要求和记载"小于约100"（无下限）的权利要求提供 文字支持。
[0044] 实施例
[0045] 下列实施例阐述了根据本发明的方法。然而应当理解为，这些实施例以通过解释 的方式提供且不应看作是对本发明的总体范围的限制。
[0046] 介绍
[0047] 淀粉合成酶(SS)，包括可溶性淀粉合成酶(SSS)，是在淀粉沉积和谷物生长过程中 对高温敏感的关键酶组分之一。在小麦中，高于25°C的气温降低小麦胚乳中可溶性淀粉合 成酶的活性。然而，不同的植物种类的可溶性淀粉合成酶对高温具有显著的灵敏度差异。例 如，水稻可溶性淀粉合成酶能够在35°C下维持高酶促活性，导致在胚乳中产生长的、直链支 链淀粉。因为小麦可溶性淀粉合成酶在升高的温度下失活且水稻可溶性淀粉合成酶承受高 温，小麦中的水稻可溶性淀粉合成酶基因的表达可能增加库强度(sink strength)，并由此 增加热应力下的产量。本研究的目的是调查在热应力条件下水稻可溶性淀粉合成酶基因的 表达对淀粉沉积和小麦粒重产量的影响。小麦中克隆的基因 SSI与水稻SSI具有81%的氨基 酸相似性且生产75kDa的蛋白，而水稻SSI生产57kDa的蛋白。小麦和水稻的SSI是结构是相 似的，由15个外显子和14个内含子组成。这两种基因的所述外显子的长度几乎相同，但小麦 的SSI的内含子1，2，4和10比相应的水稻的内含子更长，内含子6，11和14比相应的水稻的内 含子更短。
[0048] 实施例1
[0049]载体构建体和植物转化 [0050] 1.载体构建体
[0051 ] 不使用Genbank收录号#NM 001063416(SEQ ID N0:21)的水稻mRNA，直接扩增水稻 可溶性淀粉合成酶基因，从使用引物对SSS-AF(SEQ ID N0:24)和SSR-BR(SEQ ID N0:25)由 衍生自水稻植物(Kitakke)的cDNA产生1675bp的PCR产物，并将其克隆入pCR-Blunt质粒 (SEQ ID N0:26)中。这个 1675bp PCR片段（SEQ ID N0:23)与水稻SSS基因 （SEQ ID N0:21) 的后面三分之二对应。对于水稻SSS基因的5'端，质粒41637-1(SEQ ID N0:22)通过 Genscript被合成且含有SEQ ID N0:21的从起始密码子的-3开始并包括用于克隆的额外的 23bp 5'端前导序列的440bp。该前导序列含有Xhol位点，BamHI位点和Pmel位点。
[0052] SSS基因的两个片段通过消化质粒41637-1连接，并用Xhol和Hindlll酶切，并分离 一个486 bp片段。所述pCRBlunt-1675SSR质粒用Xhol消化并用Hindlll部分消化。接着，将 486bp片段连接到PCR-Blunt质粒产生完整的SSS基因（pCRBlunt-SSS)(SEQ ID N0:27)，其 含有编码SSS蛋白的1960bp编码序列。
[0053] 为了在小麦中过度表达，pCRBlunt-SSS质粒用BamHI消化并且亚克隆到pAHC17(包 含玉米泛素启动子）。为了种子特异性表达，pCRBlunt-SSS用BamHI消化，末端用T4DNA聚合 酶填补且平端连接至DY10启动子和终止子之间的Pmel位点。
[0054]使用由玉米泛素-1启动子和胭脂碱合成酶(N0S)终止子控制的水稻(栽培品种为 卡塔克)可溶性淀粉合成酶l(SSI，1960bp)的cDNA制备的构建体pAHC17示于图la中。使用由 HMW-Dy 10启动子和胭脂碱合成酶(N0S)终止子控制的相同的cDNA制成的构建体p JL10P5示 于图lb中。第三个构建体，含有由泛素1启动子和N0S终止子控制的bar基因的pAHC20 (图1 c) 赋予对除草剂草铵膦(商品名为Liberty;拜耳作物科学，研究三角，NC，USA)和双丙氨膦的 抗性。
[0055] 2.转化
[0056] a.转基因植物的生产
[0057] Bobwhite小麦(Triticum aestivumL.品种"Bobwhite"）用于转化。长度为2_3mm的 未成熟胚从10-14天年龄，表面消毒的颖果（caryopses)中收集，并颠倒放置于CM4培养基 (添加有 40g/L的麦芽糖，2 · 2mg/L的毒莠定，0 · 5g/L的 2，4-D，和 2g/L的Gelri te 的 Murashige 和Skoog盐以及Gamborg B5维生素）上，在25°C的暗室中两天到七天用于愈伤组织形成。转 移后的三到五天，在转化之前最初的愈伤组织，在0.4M的甘露醇/山梨醇CM4培养基上预处 理4到18小时或在层流罩中空气干燥30分钟。对于转化，质粒pAHC20与构建体pAHC17或 p几10P5组合使用。使用粒子流入枪（particle inflow gun)进行遗传转化。粒子轰击 (particle bombardment)后，将组织在CM4培养基上保持2至5天以允许更好地恢复。然后将 小麦愈伤组织转移到选择性培养基(含有5mg/L的草铵膦CM4培养基)上，并在黑暗中维持两 个星期。在黑暗中将组织转移至含有l〇mg/L的草铵膦的CM4培养基中，进行每14天为一个周 期的两个周期。然后将该组织转移至含l〇mg/L的草铵膦的MSP培养基(添加有5mM NH4,20mM 的N03，Gamborg B5维生素，4% 的麦芽糖，0 · 2mg/L的2，4_D，和2g/L的Gelrite的Murashige 和Skoog盐），在光照中下生长枝条。将生长枝条的组织(tissue developing shoots)转移 至枝条伸长培养基（shoot elongation media)，含有5mg/L的草铵膦的MSE(添加有5nM的 NH4,20mM的N03，Gamborg B5维生素，4%的麦芽糖，和2g/L的6611'；^6的111抑8]1丨86和31?)〇区 盐），在光照中14天。当枝条伸长到约为3-6_，将整个团块转移至具有含10mg/L的草铵膦的 13mL的MSE培养基的大培养管中。具有良好生长的根和枝条的植物被种植在小泥炭盆中用 高湿度进行抗性锻炼。这些抗性锻炼的植物使用〇. 2% (体积比）的Liberty溶液进行除草剂 抗性选择，通过涂画第三个叶片的标记的区域，接着观察三至五天。
[0058] b.转基因品系的PCR筛选
[0059] 在每一代中，使用基因组DNA进行PCR来筛选转基因小麦植株水稻SSI基因。DNA是 使用改进的CTAB方法从叶片组织中分离出来。取出100-150mg叶片的叶组织样本并放置在 2mL的离心管中，并且在液氮中粉碎。接着，将含4yL的2-巯基乙醇(Sigma公司，圣路易斯，密 苏里州）的800yL的2X CTAB提取缓冲液加入到样本中。试管在65°C的水浴中温育60分钟，接 着在室温下冷却10分钟。然后，加入500yL的氯仿:异戊醇（24:1)并将试管置于旋转振荡器 30到60分钟，随后在1，200rpm下离心20分钟。将上清液转移到干净的试管并加入2yL的RNas 酶以从DNA中去除RNA。在水相中的DNA通过加入约2/3体积的异丙醇并将该试管在-20 °C下 过夜进行沉淀。在每一代中，使用两种引物对进行PCR筛选，以筛选含有SSI基因的转基因植 物。
[0060] 对于第一个PCR靶点，正向引物，SEQ ID勵:28，退火从331的〇0嫩的起始密码子的 下游的1345个碱基开始，而反向引物，SEQ ID N0:29,杂交从SSI cDNA的终止密码子的上游 的145个碱基开始。引物对可扩增来自基因的3'末端的47lbp PCR产物。用于该引物的PCR程 序为在95 °C下5分钟，95 °C下30s进行30个循环，57 °C下30s，72 °C下90s，随后在72 °C下10分 钟。对于第二个PCR靶点，正向引物，退火从起始密码子下游的476个碱基开始，且反向引物 (SEQ ID N0:30)从基因的终止密码子的上游的815个碱基开始，并产生670个碱基对的PCR 产物。PCR的条件与上述相同，除了退火温度为60°C而不是57°C。
[0061] c · Southern 印记分析
[0062] 使用的第二引物对(SEQ ID N0s:32和33)和pAHC17质粒DNA作为模板进行PCLPCR 产物使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒纯化，并使用Megapriming DNA标记系统（安玛西亚，英国） 用dCTP(a-32p)标记。标记的PCR产物用作Southern印迹分析的探针。接着，来自T2植物叶片 的25yg的基因组DNA用BamHI和EcoRI酶消化。消化的DNA在0.8 %琼脂糖凝胶上分离，并转移 到尼龙杂交膜上并与水稻的SSI基因的32p-标记的PCR产物杂交。
[0063] d.逆转录酶(RT)的PCR
[0064]从叶片和20日龄的T2植物的发育种子二者中分离RNA。对于叶片样本，使用QIAGEN RNA分离试剂盒，同时通过使用异硫氰酸胍溶液来完成种子的的分离。收集小麦(Tri ticum aestivum L.)的种子(50-100mg)并在液氮中用预冷研钵和研件研磨至细粉末。然后将粉状 样本转移到预冷的1.5ml的不含RNase的微离心管。将400μ1提取缓冲液KlOOmM的TRIS(pH 为8.0)，150mM的LiCl，50mM的EDTA，1.5 %的SDS和1.5 %的2-巯基乙醇）等分试样立即加入 到种子粉末中。通过剧烈振荡混合内容物后，加入25(^1的苯酚:氯仿（1 :1，？田直为4.7)的混 合物，并且通过倒置将样本混合好。样本随后立即在13000g在4 °C下离心15分钟。将上层水 相小心的转移到新的含有250μ1的提取缓冲液II (4.2M的硫氰酸胍，25mM的柠檬酸钠，0.5% 的月桂醇肌氨酸和1M的乙酸钠(pH4.0))的