专利名称：合成多聚免疫球蛋白受体，受体-抗体复合物，生产及应用的制作方法
技术领域：
本发明是部分地借助于美国政府的资金作出的，因而美国政府对本发明拥有某些权利。
本发明涉及被动粘膜免疫保护的一般领域，以及多聚免疫球蛋白免疫试剂及技术的一般领域。我们用多聚免疫球蛋白抗体-即IgA和IgM-的多聚物类。IgM抗体一般产生于免疫反应的早期，并在保护性粘膜免疫学中不是一个重要因素。因此，本发明一般指的是多聚免疫球蛋白抗体，对于本发明的各个方面来说普通的和优选的抗体是IgA类抗体，这种抗体一般以二聚物形式被分泌，并且很少有聚合度较高的IgA多聚物。
许多致病的细菌和病毒最初是通过穿过胃肠道、呼吸道或生殖道的细胞内壁(上皮细胞)得以进入人体的。一种分化的抗体，IgA抗体，保护这些表面。IgA抗体是由位于上皮细胞表面之下的组织产生的二聚体或多聚体分子。它们由上皮细胞进入粘膜分泌部分，在这里它们与尚未进入人体的病原体交联或将其包覆，阻止这些病原体与上皮细胞接触或粘附在上皮细胞之上。因此，IgA抗体是作用于人体外面的病原体，它们是通过阻止病原体通过上皮细胞进入人体这种方式起保护作用的。
天然出现的IgA反应是通过将抗原输送到粘膜表面而触发的。抗原通过指定取样部位(称为微褶(microfold)或M细胞)进入人体，该部位将影响转上皮细胞抗原输送到含有粘膜免疫系统的特殊的、组织细胞聚集体的粘膜内皮区。更具体说，如
图1所示，在腔1中的抗原A(表示为实点)连接位置2处的M细胞的腔表面。该抗原在3处被内在化和通过细胞(transcytosed)，以便被释放在含有淋巴细胞L(B细胞和T细胞)和抗原处理/提供(antigen-processing/presenting)细胞，例如巨噬细胞(M)的上皮细胞间腔4中。
一种天然免疫的宿主中的IgA抗体通过与遍及呼吸和消化系统生殖道和乳腺的上皮细胞和含腺细胞的基础(里面的)表面上的一专门受体(叫作多聚免疫球蛋白受体)结合被输进分泌物中。见Solari和Kraehenbuhl所著“Receptor-Mediated Transepithe-lial Transport of Polymeric Immunoglobulins”，pp.269-298 in The Mammary Gland，Nelville和Daniel编辑，Plenum Publishing，Cambridge(1987);Mestecky(1987)J Clin.Immunol.7265-276。受体-IgA复合物穿过这些细胞并在胞外分泌出进入腔(表面的)细胞表面，在这里该受体通过酶的促进裂开，将IgA释放出，与被称为分泌成分(SC)的受体碎片一道进入分泌物中。见Mostov et al.(1980)Proc.Nat′l Acad.Scl.U.S.A.777257-7261;Solari，R.and Kraehenbuhl，J.P.Cell 3661-71(1984);Kuhn and Kraehenbuhl，J.Biol.Chem.25612490-12495(1981)。据报导，分泌成分减少了IgA蛋白水解作用的降解。见Lindh，J.，J.Immunol.114284-286(1975);Brown et al.J.Clin.Invest.491374(1974)。
总的来说，涉及注入抗原的现有的免疫策略引起生成IgA类抗体，这些抗体有次序地循环并在它们进入人体后中和病原体。注入抗原一般不含引起实质性IgA反应。
致力利用在粘膜阻档层上的IgA保护作用的优点包括口服免疫，利用免疫哺乳动物的粘膜分泌，或是为了对免疫哺乳动物进行主动保护，或是为了对其他哺乳动物进行被动保护。见Glass et al，NEW Eng.J.Med.，3081389-1392(1983);Fubara et al.，J.Immunol.，111(2)395-403(1973)。单克隆IgA抗体业已生产出来，并直接应用于呼吸粘膜表面，致力于保护，防止病原体的进入。见Mazanec et al.，J.Virol.，612624-2625(1987)。
我们已经发现了各种制造和稳定用于被动粘膜免疫保护的单克隆多聚免疫球蛋白抗体制剂的办法。更具体地讲，这些制剂是一些在专门用于一选定的抗原或抗原族的多聚-Ig和一种至少包括一个该多聚-Ig受体的多聚-Ig键合区域的稳定剂蛋白之间，得到充分分离的复合物。该多聚-Ig稳定剂实质上没有任何C一端的转移膜或细胞内多聚-Ig受体区域。所产生的复合物的特征在于与未复合的多聚-Ig相比较具有蛋白水解稳定性，并且该复合物具有该多聚-Ig的专门的键合特性和免疫保护交联特性。在本发明的第一个方面，该稳定剂蛋白是重组蛋白。在本发明的第二个方面，该多聚-Ig抗体是一种单克隆抗体。
如以下所评述的那样，该复合物的一种优选的形式的特征在于在该多聚-Ig和该稳定剂之间的共价(二硫化物)键。这样的复合物可以用一种可以产生专门用于所选定的抗原或抗原族的所需要的多聚-Ig的细胞来制造设计的这种细胞以产生多聚-Ig稳定剂。这种复合物是利用这种细胞的培养物制取的，并且也是从这种细胞培养物中回收来的。
该多聚-Ig最好是单克隆IgA类抗体。也如以下所详述的那样，该优选的稳定剂的特征是关于天然出现的多聚-Ig受体区，并且该优选的稳定剂包括区域Ⅰ和至少区域Ⅳ或Ⅴ或两者，因区域Ⅵ实质上被截去。区域Ⅰ最好是与区域Ⅴ隔开一个大约100-500个氨基酸的链区。
本发明的第三个方面的特征是包括多聚-Ig受体的多聚-Ig链合区，并且实质上没有C一端转移膜或细胞内多聚-Ig受体区的重组多聚-Ig稳定剂。优选的稳定剂是以上关于具有本发明第一部分二个方面特征的复合物所讨论的那些。
本发明的第四个方面的特征在于测定活体内多聚-Ig单克隆抗体的保护能力的方法，这是通过将待测的单克隆多聚-Ig引入一哺乳动物的循环系统中并测定该哺乳动物的粘膜分泌物中多聚-Ig来实现的。然后，和病原体(或精子)使该哺乳动物免疫性试验并测定抗该病原体或受精的保护作用。该单克隆多聚-Ig最好是采用注射或灌注的方式引入哺乳动物循环系统中。换句话说，一种肿瘤或形成肿瘤的细胞(例如杂交肿瘤(hy-bridoma))可以以皮下方式引入，作为一个连续的单克隆多聚-Ig源。
本发明的第五个方面的特征在于一个通过以下步骤来制造上述巯基交联复合物的方法，所述步骤是提供设计的固着上皮细胞，用来产生多聚-Ig受体的;在某些条件下培养这些上皮细胞，条件是在一种多孔支撑物上形成这种细胞一个单层，这种支撑物被设置用来将该单层底侧上的第一介质与该单层顶侧的第二介质隔离。单克隆IgA被引入该单层的底侧，并且当该抗体穿过单层传递时在该细胞中形成该复合物。该复合物从该单层的顶侧上的介质中加以回收。所述第一介质最好是适用于保证上皮细胞生长的营养介质，而第二介质最好是在回收多聚-Ig复合物时实质上不受蛋白质的干扰。单克隆IgA可以通过在第一介质中共同培养的杂交肿瘤细胞来引入。换句话说，单克隆IgA是首先在杂交肿瘤培养物中产生，然后从培养物中分离出来，最后被引入第一介质。
本发明第一和第二方面的复合物可以直接引入哺乳动物的粘膜表面以保护不受病原体或不受受精作用的影响。该复合物最好是通过口、鼻、阴道、直肠、眼睛引入，或引入中耳。一种优选的给药方法是在第一个哺乳动物的一种粘膜分泌物中提供该复合物，然后将该粘膜分泌物给与第二种动物。例如，可以将含有该复合物的取自第一个动物奶喂给第二个动物。为了产生这种分泌物，将多聚-Ig[例如由杂交瘤(hybridoma)培养物提纯的]引入第一个哺乳动物的循环(例如通过灌注或注射)，并且从该哺乳动物身上收集奶或其他粘膜分泌物。
本发明提供了特别有效和安全的被动免疫，原因在于它是非系统化的。因而，动物(非人哺乳动物)免疫试剂在粘膜免疫保护作用中比对全身免疫接种作用是合法的更有希望被容许。新生儿感染，例如坏死性大小肠结肠炎和B组链球菌感染是特别重要的目标，已知是由于在这个阶段缺乏天然粘膜免疫性。
本发明的第六个方面的特征在于产生一种生成多聚-Ig的杂交瘤(hybridoma)，所使用的方式是以一种抗原给一哺乳动物免疫性试验，并从该哺乳动物的粘膜组织，例如Peyer斑或淋巴细胞丰富的其他粘膜组织中回收淋巴细胞。最好是选用Peyer斑，而其他适用的淋巴细胞丰富的粘膜组织包括扁桃体、腺样组织增殖体、阑尾和直肠淋巴细胞。该淋巴细胞融合到骨髓瘤细胞中。该抗原最好是加到该哺乳动物的一种粘膜表面上。
本发明其他的特征和优点由以下对它的优选的实施例的说明将会更清楚。
最佳实施例图的说明。
图1是用图解法表示抗原横过M细胞的细胞转移。
图2是用图解法表示形成产生多聚IgA的杂交肿瘤的步骤。
图3是用图解法表示用于评价由杂肿瘤所产生的多聚IgA的保护特性的方法。
图4是用图解法表示多聚IgA和改良的多聚-Ig受体之间的复合物的结构。
图5是用图解法表示多聚-Ig受体区域。
图6A和6B显示一个基因编码多聚-Ig受体的核苷酸顺序和推论的氨基酸顺序。
图7是由多聚-Ig受体的两个兔子等位基因的无性繁殖cDNA推断的氨基酸顺序。
图8A-8C显示由图7顺序推论的cDNA图9比较图7的多聚-Ig受体等位基因的区域Ⅰ的顺序。
图10用图表示各种表达传病媒介。
图11用图表示两种专门的表达传病媒介PLK-neo6.8kb和PLM-neo6.8kb的结构。
图12描述了将无性繁殖多聚-Ig受体基因插入图11的传病媒介的情况。
图13描述了在多聚-Ig受体cDNA中的各种限制位置。
稳定剂蛋白质和多聚Ig复合物最佳的稳定剂蛋白质是由多聚-Ig受体，一种作为多聚-Ig转移媒介的转移膜分子衍生的。该受体包括图4和5中所示的以下区域5个胞外区域;一个转移膜观测部分和一个C一端细胞内尾。该受体的蛋白分解裂纹产生了游离的五区域蛋白质“SC”或分泌成分。见Mostov et al.，Nature 30837-43(1984);Kuhu et al.，J.Biol.Chem.，2586653-6659(1983)。在多聚-Ig受体和IgA之间形成二硫化物桥通常如图4所示。
该多聚-Ig受体一般保存于所有哺乳动物中，而我们使用的这一种包括所有这样的受体，不考虑哺乳动物的来说，例如小鼠、鼠、兔、豚鼠、猪、羊、马、母牛或人类。该领域中的技术人员将作出这样的评价，即在这种应用中所提供的兔多聚-Ig受体顺序可以用于标准杂交无性繁殖技术，以便将这种cDNA编码多聚-Ig受体与其他哺乳动物区分开。
如以上所概括的那样，该复合物的稳定剂蛋白质部分可以是至少按二种不同的方法产生的重组稳定剂蛋白。该多聚Ig受体可以进行无性繁殖并且在一个细胞中被表达，该细胞可以将它排出并使其分裂以产生重组稳定剂蛋白。换一句话说，该多聚-Ig受体基因可以按各种方式设计(特别是通过插入一个如下所述的中止密码子)以产生一个直接用该稳定剂蛋白表示的结构。
如以上所指出的那样，制取所述稳定剂蛋白质的两种方法都从所述无性繁殖的多聚-Ig受体基因开始。Mostov et al.，在Nature 30837-43(1984)中报导了这种基因的无性繁殖和它的顺序。图6就取自那篇报导，这在下面要做更详细的说明。
另外的关于无性繁殖该基因的专门文件如下所述。见Schaerer et al.，J.Cell.Biol.110987-998(1990)。细胞质RNA是根据Suard et al.，Biochem.J.20181-90(1982)所述由正在哺乳的新西兰兔的乳腺制备的;而多聚A+RNA是根据Schibler et al.，J.Mol.Biol.14293-116(1980)所述提纯的。所述多聚A+RNA在受体中可翻译活性通过以5-20%的线性蔗糖梯度的大小分级分离加以富集，用作cDNA合成的模板。第一个cDNA链是根据Wahli et al.，Dev.Biol.67371-383(1978)合成的，而第二个链是根据Gubler，Gene 25263-269(1983)所述的DNA多聚酶I-RNaseH法合成的。这种双链绞合的、dc结尾的cDNA在一种1%的低溶点琼脂糖胶上进行分级分离，而大小分布在1.5和7kb之间的cDNA被洗脱并被退火处理成为dc结尾的PBR322，正如Peacock et al.，Biochem Biochem Biophys.Acta 655243-250(1981)中所描述的那样。DH1细胞用根据Hanahan et al.，J.Mol.Biol.166577-580(1983)所述的一般方法进行过退火处理的DNA来转换。变态的细菌被溶解，而DNA被转移到硝化纤维素过滤器上[Thomas，Methods Enzymol，100255-266，(1983)]并且用两种合成低聚核苷酸加以探查。所使用的专用的探针是由Mostov et al.，Nature 30837-43(1984)中所公开的顺序为186-206和2421-2437的核苷酸，并用T4多聚核苷酸激酶和αP32-ATP标记，如Gough，N，et al.，Nutute 309763-767(1984)中所述那样。与两个探针杂交cDNA无性繁殖系其进一步的特征在于杂交选择性转化(Riezman et al.，EMBO J.22161-2168，1983)。两个得到的质粒是PSC-Ⅰ，它对应于缺少区域2和3的低MW形式的多聚-Ig受体(如Deitcher et al.，Mol.Cell Biol.62712-2745，1986中所述)和PSC-Ⅱ，它对应于高MW形式的多聚-Ig受体。
图6A和6B显示了多聚-Ig受体mRNA的顺序和由它预测的氨基酸的顺序，Mosfov等人曾报导过。图6A和6B它们的特性如下。残基，从5′到3′编号，从P21，53中的多聚(dG)尾之后的第一个核苷酸形状。核苷酸号码在右边给出。该复合物的顺序是3517个基长，并含有少见的多聚(A)附加顺序AU-UAAA，从多聚(A)尾部的上游26个基开始，并且以每一个基下面的三角表示。予测出的氨基酸的顺序被表示在该核苷酸的顺序之上。信号肽从-18到-1编号。成熟的多聚-Ig受体(Gln)的第1氨基酸是1号。ASn-键接糖基化作用的二个可能的位置被跨过去。予测的膜观测区用一条虚跨线表示。这五个区域的半胱氨酸时，还包括第六个区域的相应的第一个半胱氨酸，在每一个区的第一个半胱氨酸上面的用实圆圈表示，和在每一个区第二个半胱氨酸之上的虚圆圈来表示。
多聚-Ig受体基因进行了无性繁殖之后，就可以设计要求的稳定剂蛋白质的直接表达式。特别是含有某些SC多聚-Ig-键接区域的重组蛋白质会使多聚Ig稳定，防止蛋白质水解断裂，对多聚IgA的专门键合以及保护功能实际上没有不良影响。具体说，图4和5的那些区域是初始多聚-Ig键合区域(Ⅰ)、二个间隔初始区域(Ⅱ)和(Ⅲ)、C一端区域(Ⅳ)和(Ⅴ)，它们都有助于多聚-Ig的稳定。
所述多聚Ig受体在C-末端被削短以除去该蛋白质的转移膜和细胞内部分，这些部分对于稳定和保护并非是必不可少的。因此，在本发明中很有用的所述被削短的多聚-Ig受体包括(最少)N-末端多聚-Ig键合区域Ⅰ。
提供以下关于特殊的被削短的多聚-Ig受体的讨论是为了说明本发明，而不是限制它。该领域的技术人员将会很容易地懂得以下所提供的特殊的蛋白质顺序，可以通过保守性的代换和删减得以改善，而又保持本发明的功能和精神。
图7描述了由该多聚-Ig受体的二个兔子等位基因的无性繁殖的cDNA(推断的氨基酸顺序。一个等位基因记为“1号”，对应于图6A和6B所示的在Mostov et al.，Nature 30837-43(1984)中所报导的cDNA，其他的等位基因在申请人Kraehen-buhl的实验室中按以上所报导的技术进行无性繁殖，那种等位基因的顺序记为图7中“2号”。在图7中，一个冒号(“”)用来表示相同的残基;一个句号(“.”)用来表示类似的残基-即A，S，T;D，E;N，Q;R，K;I，L，M，V;F，V。
图8A-8C描绘那些无性繁殖系cDNA顺序。还有，冒号表示相同的基。“N”表示一未知的基。
在多聚-Ig受体顺序之中的七个区域如下(号码参看图6)区域 部分Ⅰ 10-118Ⅱ 119-223Ⅲ 224-332Ⅳ 333-441Ⅴ 442-552Ⅵ 553-652
Ⅶ 653-755区域Ⅰ是一个多聚-Ig键合区，它保持在本发明削短的多聚-Ig受体中。
关于两个等位基因(包括氨基酸1-9，它对于多聚-Ig键合来说并非是必不可少的，并因此也并不是关键性的)。区域1的特殊的顺序表示在图9中。
所述多聚-Ig受体顺序可以用保守的氨基酸取代、删除部分和附加部分来改变，而这些部分并不改变多聚-Ig的键合。确实，如图9所示，比较两个区域1顺序只显示出在位置38、70和76的三个氨基酸变动。在本发明(Ⅱ-Ⅴ)结果的其他区域的每一个中，在2和6个氨基酸之间变化，在残基337和358处区域Ⅳ有变化，在残基448、460和513处区域Ⅴ有变化。
简言之，在氨基酸水平有80%以上同源好的，而其顺序在全部五个区域内都可以利用氨基酸取代或利用区域删除部分来改变。
尤其是对于多聚-Ig缔合来说，应该在区域Ⅰ保持充分的同源性，在区域1和Ⅴ之间应该保持适当的间隔(即100-500个氨基酸)，并且区域Ⅴ应该适于保持共价二硫化物的稳定性。因此，在区域Ⅱ-Ⅳ可以容许非常充分的改变。
特别理想的是被截短的多聚-Ig受体还包括区域Ⅴ，该区域借助了一个巯基键，对于该复合物的共价稳定性负责。一般可见Eiffert et al.，Hoppe Seyler′s Z.phys.Chem.3651489-1495(1984)，鉴别在形成二硫化物桥时所涉及的多聚-IgA(人类)的半胱氨酸残基。此外，重要的是包括对应于区域Ⅱ-Ⅴ的一个间隔，确定如图5所示二硫化物桥形成的区域Ⅴ的位置，以及增强抗蛋白水解的保护作用。
为了确定恰当的截尾位置，在该完善受体的区域Ⅴ1中的膜观测部分可以认为是无电荷占优势的疏水残基(例如图6中的630-652)的延伸，而该疏水基在其前面接有带电残基(例如Lys629)，并且在其后接有一个极端基的顺序(例如在图6中的Arg-ALa-Arg-His-Arg)。这种膜观察部分，也包括该分子的C-末端细胞质尾，都通过截尾加以删除。
在一个特殊的实施例中，截尾是通过合成一种16链节寡聚核苷酸来实现的，该寡聚核苷酸为在三个阅读基因内部具终止编码TAG的ACTAGTCTAGACTAG。该寡聚核苷酸是一种旋转对称并且自体杂交。所生成的双显性组合被嵌入上述多聚-Ig cDNA(DNA位置1834，氨基酸554)。
更具体讲，通过这种寡聚物编码的这四个氨基酸(T-S-L-D)被加到区域Ⅴ的C-末端，结果截尾准确地出现在区域Ⅴ和Ⅴ1之间的过渡部位。为寡聚物嵌入而选择的限定核酸内切酶位置是Sall位置，该位置是唯一的，并且靠近假设的自然断裂位置(氨基酸563，597和605)。在区域Ⅴ中其他一些合适嵌入位置是在ASP(1827);KpnI(1831);AccI(1835)。在区域Ⅴ1中没有合适的唯一位置。见图13。
以上所述无性繁殖的多聚-Ig受体cDNA或所设计的(例如截尾的)多聚-Ig受体cDNA一般可以以本领域技术人员所熟知的各种各样的表达系统中的任意一种来表达。例如，理想的表达系统是专门的分泌细胞(即天然分泌大量蛋白质的细胞)，例如成纤维细胞，包括中国田鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)表达系统。可以应用内分泌肿瘤细胞表达系统，例如ATt20细胞(ATCC CRL89和CRL1759)或PC-12细胞。Madin-Darby Ca-nine Kidney(MDCK)细胞也是一种理想的宿主细胞。是以上所引用的Mostov等人1984的著作。表达媒介物的选择将取决于已选定的宿主细胞。
在一个实施例中，被截尾的多聚-Ig受体可以用永久不死的生成IgA的细胞，例如淋巴细胞-骨髓瘤融合物来表达。在这种情况，最佳的表达媒介物是这样一种，即包括一种强的或可引发的启动基因、增强病毒成分(即一种B-淋巴细胞专用的增强病毒例如μ-增强病毒或一种病毒或一种病毒原增强病毒)，一种被引入多聚-IgR-cDNA的所设计的中止编码，这种引入是为了避免区域1-Ⅴ(SC)由细胞膜碇系(区域Ⅴ1-Ⅴ11)的蛋白水解分离的需要。专门的表达系统在下面加以叙述。
一般如图10所述，表达媒介物可以是以下一些例子说明过的传病媒介，这些例子是具有糖皮质激素响应成分的PLK-neo或hygro或PLM-neo或hygro，或是在其中糖皮质激素响应成分被除去的或已被以下成分所取代的同样的传病媒介，这些成分是μ-增强病毒成分，PAKR-μ-neo和PSV40-μ-neo。传病媒介可以包括以下成分。
1)一种用于开始该cDNA转录的合适的启动基因。由反转病毒(retroviruses)制取的LTR′S是适用的，包括由肾腺瘤分离出的LTR，如williger等人在J.Virol.601-11(1986)所述。该肾LTR共享具有以乳房肿瘤分离出的LTR的同系物，该同系物在U3区有某些差别。两个LTRs具有一个糖皮质激素响应成分，该成分提供了转录的激素刺激作用。例如，糖皮质激素(地塞米松，Sigma公司，St.Louis，Mo)使被截尾的多聚Ig受体的转录作用增加了10-50倍。由一种无性繁殖传病媒介(PLK或PLM，由瑞士癌症研究院的HeidiDiggelmann博士提供，在该院的一个组制成了这种质粒，见前面引用的Williger等人著述)借助于顺序的PStl，S1和BamH的菌致分解物回收的肾的或乳房的LTR被嵌入一个PSV2neo传病媒介(可通过Biolabs买到)，该传病媒体利用EcoRI，SI和BamHI菌致分解物进行上述的顺序的菌致分解(除去SV40启动基因并用LTR启动基因取代它)。(图6B)。通过在新霉素抗病性基因(IB)的位置引入湿霉素抗病性基因构成PLK-hygro或PLM-hygro传病媒介。我们已经存放质粒PLK-neoPIR11，它带有ATCC，Rockville，Maryland，在登记号ATCC40787之下。那种质粒是图10所示的PLKneo质粒，它带有嵌入在该质粒的BamHI位置的被截尾的多聚免疫球蛋白受体编码的DNA(图8)。
2)增强转录作用增强病毒成分，并因此增强被截尾的多聚-Ig-受体的生成。这些成分包括病毒成分(SV40，MMTV的糖皮质激素响应成分)或哺乳动物组织专用的增强病毒，例如可以对B细胞中的Ig的高表达式响应的μ增强病毒。由包围μ重链基因座的一种鼠染色体组织无性繁殖系回收的μ增强病毒(Mercola，M，Wang，X.F.，Olsen，Y，and Calame，K.1983，Science221663-665)可以嵌入各种启动基因的位置之前。
3)一个传病媒介主链大分子，包括可选择的标记(例如一个新霉素或湿霉素抗病性基因)，一个在一个带有一个抗体性基因E.Coli中的起源。
4)多聚-Ig-受体-编码cDNA。
5)一个在每一个阅读基因中都含有中止编码，例如AC-TAGTCTAGACTAGT的合成寡聚物。
在图11中提供了关于这种传病媒介结构的更多的细节。PSC-1的cDNA被引入Southern和Berg在J.Mol.Appl.Gen.1327-341(1982)中所描述的表达式传病媒介PSV-2中。该结构被称PSV2-SCl。
所得到的传病媒介被转染进入骨髓瘤细胞中并将这些细胞分离以显示被截尾的多聚-Ig受体的有效的表达式。标准的电多孔(eletroporation)技术被用来影响这种转染。
尤其是细胞从生长介质(每个样品2×106)中采取并使之离心沉积(5×1000rpm)。这些细胞出自处于30-70%融合性的状态的培养液，并且该介质应该在前24小时加以改变。在冷芷温度下(冰浴)，用电多孔介质(RPMI2mM谷氨酰胺和带有penstrp
的0.5%胎儿小牛血清)洗涤该细胞。将该细胞加以计数并在2×106/0.75ml的电多孔介质中重新使之悬浮。将大约45-50μl的线性化的DNA(10μg线性化和重新悬浮在45μl磷酸盐缓冲盐水中)加入到在一个电多孔小杯中的一份(0.75ml)该细胞的悬浮物中。将该小杯在冰上存放15分钟，并将该混合物加以搅动。然后，将这些细胞放入经过调节的RPM1或Eagle介质中并加以选择。
所述受转染的骨髓瘤细胞表达并分泌所述被截尾的多聚-Ig受体。在对照中骨髓瘤细胞不能分裂和分泌这种完整的受体。该被截尾的多聚-Ig受体从该骨髓瘤培养液悬浮在上层的物质中通过硫酸铵沉降和胶体过滤加以分离和提纯。
在下面要作尽详细地叙述的一个特别好的实施例中，该被截尾的多聚-Ig受体是在一种杂交肿瘤中产生的，该杂交肿瘤被选中是因为它能产生一种理想的多聚-IgA。
在这样一个系统中，在该活的细胞中形成将该被截尾的受体与该多聚-Ig连接起来的共价二硫键，并且所产生的稳定的分泌物Ig复合物被分泌出来。这种系统可以按以下方式之一构成或者通过使骨髓瘤细胞转染，这种细胞将用作融合配偶以使产生多聚-Ig-产生B细胞永远繁衍;或者通过使杂交肿瘤转染，这种杂交肿瘤已制造出来并且为了产生理想的多聚-Ig进行了筛选。在这两种情况中的任一处情况下，都产生了所要生成的共价二硫化物键。
SP-20或P3×63/Ag8V.1骨髓瘤细胞(ATCC CRL1581，CRL8287，CRL1597)的转染是利用PLK表达式传病媒介来进行的，在该传病媒介中所述多聚-Ig受体的cDNA转录作用是处于控制肾MMTV LTR启动基因的条件。见williger et al.J.Virol-ogy 601-11(1986)。充分的转录是通过用10-6M地塞米松对转染的细胞进行不少于12个小时刺激获得的。
用于产生稳定剂蛋白质的另一种系统涉及使一个用于表达所述完整的多聚-Ig受体的表达式传病媒介转染到一个哺乳动物上皮细胞的碇系依赖细胞(anchorage-depenclent cell)线中，该细胞线在一种多孔基底上形成一个单层。一种特殊的这类细胞线是用一个表达如上所述的多聚-Ig受体的传病媒介转化了的MDCK细胞线。尤其是含有糖皮质激素LTRk的PLK-neo-ScII传病媒介可以使用。也可以使用其他适合的形成单层上皮宿主细胞。潮霉素抗病性基因是可以买到的，如Bloechliner和Diggel-mann在Mol.Cell.Biol.42929-2931(1984)中所述。
一般说来，被转染的细胞线在一多孔基底，例如涂有骨胶原的过滤器(即通过性能良好过滤器，0.45μm，4.7cm2)上生长成为一个单层。见Steele et al.，Am.J.physiol.251C136-C139(1986)。这些细胞将成为带有底部和顶部膜的不对称细胞。布置有膜和单层是为了将一个容器分成底部介质和顶部介质。由于这些细胞趋向于从底部介质中滋养，该介质应该具有保持细胞生长所必须的营养物质。在该顶部介质中对营养物的较少需要。
有利的是这些细胞将利用重组多聚-Ig受体，以便从底部介质中取出多聚-Ig并把它转移到顶部膜中，在膜中该受体被酶促分裂，产生与该稳定剂蛋白质共价结合的稳定的多聚-IgA。通过在那种介质中培养产生IgA的杂交肿瘤的方式将多聚-IgA补充到所述底层介质中。换句话说，从一种单独的杂交肿瘤培养液中回收(例如亲合力提纯)的多聚-Ig可以加到该介质中。
稳定的多聚-IgA可以再一次通过亲合力提纯或其他标准抗体分离方法从该上层介质中加以回收。该上层介质可以保持与蛋白质杂质完全分离以简化提纯。
产生IgA的杂交肿瘤的构成和筛选本发明的另一方面是容易形成多聚-Ig抗体和对多聚-Ig(特别是IgA)抗体筛选的能力，该抗体经受得住选择的感染，特别是由能通过粘膜表面进入人体的病毒和细菌病原体的感染。本发明的这个方面还包括形成抗精子表面成分的多聚-Ig抗体和对能提供避孕保护的抗体筛选的能力。它还进一步包括形成和筛选抗食物和空气中传播的过敏原的多聚Ig抗体。
在本发明的这一方面，将一个受控制的多聚Ig抗体源提供给一个宿主动物，例如，将分泌多聚-Ig的杂交肿瘤细胞植入一个宿主动物，在动物身上它们发育成为肿瘤。由这肿瘤所产生和释放的多聚-Ig进入到动物循环系统中，循环的二聚单克隆IgA从有漏隙的毛细管出来进入粘膜组织，在那里它们被上皮细胞受体识别并被连接，被转移到带有内分泌成分的分泌物中。杂交肿瘤细胞的腹膜(腹水)肿瘤(这是已知的)可能引起肠内不希望有的病理变化和在浸泡所述肠的腹膜液中引起特别大量的非分泌IgA。因此，分泌IgA的杂交肿瘤的最佳位置是皮下的，例如在上背部。
产生IgA的杂交肿瘤是使一种抗原敏感B淋巴细胞持续繁衍产生的，即从口或粘膜免疫后的Peyer斑(PP)中收集的。见Weltzin et al.J.Cell.Biol.1081673-1685(1989)。用于使产生IgA的细胞持续繁衍的骨髓瘤细胞各处都可以买到。可以利用标准的溶合约定。
特别是为了指定的IgA的生产，根据以下专门的例子来产生和试验杂交肿瘤。
各种标准的方法可以用于免疫试验动物以生产抗原敏感杂交肿瘤结构的B细胞。见以前所引用的Wiltzin等人的著作。一种特殊的方法涉及应用羟磷灰石(HA)微粒作为口服引入机体的抗原的载体。在由Amerongen、Nautra，weltzin和Kraehenbuhl与本申请同时提出的共同拥有的题目为《羟磷灰石-抗原共轭体和用于产生一种多聚-Ig免疫反应的方法》的专利申请中公开了关于制备适用于粘膜免疫的抗原-HA配合的过程的细节。因而，该申请被引用作为参考文献。
适用于通过上皮(例如一般小于0.1μm)传递的HA微晶体被涂复用抗原的浸透，并在一个用于粘膜给药的适合的载体(例如一盐溶液)中化合。对于25g小鼠的口服免疫，将在200μlPBS中的小量(eNgN，30μg)蛋白质同适量(例如每30μg蛋白质1mgHA)的经过予先的超声处理的和洗涤的HA相混合。该混合物在4℃下搅动一小时，然后将HA通过在一个微型离心机(mi-crofuge)中以10000rpm转速旋转2分钟来将HA弄成小球。该小球加以洗涤和旋转或超声处理，以使之重新悬浮在200μl含有0.1M(更少)NaHCO3(碳酸氢钠，用于中和胃酸)的水中。用于口服免疫的给药溶液可以调整以避免高盐情况，该情况有助于从HA中释放该蛋白质。
其他适用于对动物进行免疫试验以提高粘膜免疫反应的方法对本领域技术人员来说是已知的，并且这些公知方法也适用于在本发明中使用。
在一个特殊的用以产生分泌IgA的杂交肿瘤的方法中，从进行免疫试验的动物身上分离出PP单核细胞。特别是8-10PPS的粘膜或粘膜下层被除去，并在含有0.1%胶原酶的完全的RMPI介质中在37℃下培养1小时。组织在二个无菌的冷冻端显微镜导轨端部之间被粉碎，所释放出的细胞在完全的RPMI中洗涤两次，从一个小鼠中大约可收集2-3×107个能存活的PP单核白细胞。
骨髓瘤细胞和小鼠单细胞用无血清的RMPI洗涤两遍，并融合于37%聚乙二醇4000(E.Merck，Darmstadt，FRG)中，白血细胞与骨髓瘤细胞之比为5∶1。在融合后，这些细胞在完全的RPMI中被稀释为1×106细胞个数/ml，并放入96个穴的组织培养液盘中，该营养液盘在24小时之前每穴用2×104个被紫外线照射(800rads)的小鼠腹膜渗出液细胞接种过。杂交肿瘤是用标准方法在次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷中选择出的。
产生定向针对所希望的抗原或细胞的IgA抗体的杂交肿瘤是用标准的筛选方法来鉴别的。
所生成的杂交肿瘤细胞例如在RMP11640被压成小粒的培养液介质中培养，使之重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中并加以计数。细胞密度被调整为每0.5ml为106个细胞。将悬浮细胞(在0.1至0.5ml中有106个)通过皮下注射于BALB-C小鼠上背部。硬瘤在注射后1至3周之间出现。当该瘤达到3-5mm予计的直径时通过尾部放血采集血清样品。ELISA被用来测定血清IgA。具有与植入杂交肿瘤相同特性的分泌物IgA在肠内洗涤物和在奶中加以测量，还是使用ELISA。其他粘膜分泌物(例如从口腔/鼻腔的上皮和腺中，从呼吸系统和生殖系统中分泌出的分泌物)也可能含有这种特殊的分泌物IgA。
然后这些产生肿块的小鼠就被用于“免疫性”试验，在该试验中流出的病毒或细菌病原体通过口腔或其他粘膜表面引入，或者在该试验中将精液或精子从阴道中引入。分泌有用IgA的杂交肿瘤被从显示抵抗这种免疫试验的保护作用的小鼠身上被鉴定出来。这些试验可以用来专门鉴别最适合于被动免疫保护或人或其他动物避孕的分泌物IgA(见下面)。例如，在鉴别适用的分泌抗-V.Cholerae杂交肿瘤时，在出生的那天就给新生的小鼠接种，以便在这些新生小鼠自动产生抗霍乱抗病性之前进行筛选。
以上试验可以用于新生期保护试验，在该试验中杂交肿瘤在三周妊娠期的第一或第二周被植入怀孕的BALB/C小鼠身体内。在怀孕期间肿瘤长起来，循环的产自肿瘤的二聚物IgA充分地被乳腺上皮细胞输出并作为分泌物IgA被排放到初乳和以后的乳液里。新生的小鼠从出生就吸收SIgA。在需要持续不断地供给这种IgA的场合，可以利用多个哺乳雌鼠。
一旦利用以上所述的活体内的检测方法鉴别出IgA单克隆抗体是保护性抗体，就要在直接或被动应用于粘膜表面之后就它们的保护能力对它们进行试验。在这些试验中，带有或不带稳定剂蛋白质的多聚-IgA可以在培养液中产生(如前所述)，并且被加到以前所列的那些器官系统的粘膜表面。
本发明这一方面的一个特别重要的特征就是在接受者体外，在粘膜表面上IgA作用。因此，该IgA不需要是与接受者的系统免疫相容的;它只需到达接受者的粘膜表面并且充分地阻止病原体进入。
本发明特别有用的是提供保护抵抗Pseudomonas aeruginosa，Hemophilus influcnzae，Vibril cholerae，Bordetella Pertussis，Corynebacterium diphtheriae，Escherichia Coli，Salmonella typhi以及typhimurium，clostridium perfringens和其他肠的clostridiae，Shigella dysenteriae，Shigella flexmerii，Neisseria gonorrheae，Tri-chomonas，Entameba histolytica，Giardia lamblia，Streptococcus，呼吸多核体病毒，旋转病毒(rotavirus)，呼吸道肠道病毒，人类(Human)免疫缺乏病毒，人类(Human)T-细胞亲淋巴性病毒，Ⅰ型和Ⅱ型，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，流感病毒，疱疹病毒，人类乳头状瘤病毒;AIDS2·病原体，例如Pneumocystis，以及酵母，例如串珠菌属。本发明对于提供保护抵抗接触呼吸或消化粘膜表面的变应原也是很有用的。它还对于提供保护避免因为阴道里的交联精子而怀孕以及防止精子通过子宫颈和子宫的运动是很用的。
在每一种情况，一种合适的已知的抗原，例如整个病原体或特殊的从外部给予的抗原-例如病毒外壳蛋白，或细菌细胞表面蛋白，菌毛蛋白，脂多糖，病毒衣壳或包膜蛋白，原生动物原生质膜表面成分，精子表面蛋白，或呼吸变应原都可以使用。也可以使用类毒素，例如CRM-197，以及Uchida et al.在J.Biol.Chem.2483838-3844(1973)中所报导的钝化的diphtheria毒素。根据以上的方法来使用该抗原，以产生分泌所要求的保护性抗体的杂交肿瘤。就象刚才那几个例子一样，WO88/08437(在这里被引用作为参考文献)公开了适于形成抗-V.Cholerae单克隆多聚-Ig抗体的一种tcPA菌毛蛋白。美国专利4725669公开了适用于形成抗-HIV多聚-Ig单克隆抗体的HIV(HTLV-Ⅲ)被膜糖蛋白。以下专利和专利申请公开了关于具有抵抗链球菌感染，特别是B组Streptococcus的感染的保护作用的抗原的制备方法。这些专利和专利申请包括U.S.pat.4367221，4367222，4367223，4356263，4207414(RE31672)，以及WO87/06267。
一个抗V.Cholerae脂多糖的适用的IgA单克隆抗体是由杂交肿瘤2D6产生的，存放ATCC，Rockville，MD，登记号为ATCCHB10420。
另一些适用的抗原在以下文件中被公开，该文件是Bacte-rial Vaccines and Local Immunity Proceedings of the Sclavo Interna-tional Conf.，Siena，Italy 17-19November 1986。适用于HIV抗原的特殊的试剂在下述文件中被公开，该文件是AIDS Research and Reference Reagent Program，National Institute of Health，June1989。例如，gP120是Micro Genesys，Inc.出售的。精子细胞表面抗原，例如LDH-C4，也是公知的。例如见Shaha et al.and Tal-war et al.Vaccine 797-100(1988);以及Shaha et al.Int.J.An-drol.11479(1988)。
为实施本发明在选择抗原中特殊含义在于粘膜保护涉及到交联以防止进入人体，并且这种机理不需要所述多聚物抗体杀死或“中和”所述病原体。相反，系统的(IgG)保护涉及键合，这种键合为了更有效一般必须中和所述病原体。因此，没有任何与所述病原体键合的IgG抗体是保护性的，如同用以下这样单克隆抗体的例子所说明的那样，这种单克隆抗体专门与Vibrio cholerae键合，但是没有中和这种病原体，中和的意义指的是防止它移植、生长和在它的宿主中出现临床症状。因而，为提高保护性IgA抗体的可得到的抗原和决定体的全领域被有效地增加了。
被动免疫保护用以上方法鉴别为分泌保护性多聚-Ig的单克隆抗体的杂交肿瘤是用已知的技术培养的，而该抗体利用特殊的免疫吸收法分离并加以收集。
被截尾的Ig受体复合物是通过以下两种方式之一提供的，或是如上所述通过用一种表达传病媒介转化所述杂交肿瘤，或是通过单独表达所述Ig受体并利用以上所述的单层培养技术将它加到所述单克隆抗体中。
所生成的稳定的单克隆抗体被配成为一种“被动”疫苗，这种疫苗被直接给予预计要用流出的病原体进行免疫试验的粘膜表面。
专门的载体和该复合物的给药途径将依据病原体而变化。口腔给药一般是利用缓冲盐溶液来完成，或者在需要时为了保护该复合物抵抗胃和胰的蛋白酶而用胶束。鼻腔给药是利用气溶胶来完成的，眼睛给药是用盐溶液来完成。生殖器或直肠给药是用凝胶、泡沫或栓剂来实现的。
本领域熟练的技术人员将会明白如何用已有技术来配制这些载体。
活性接种羟磷灰石配合抗原，例如以上所述用作杂交肿瘤融合配偶细胞的免疫试验供体的那些抗原也可以用于活性接种。具体说，配合抗原被直接加到粘膜组织上，或者通过口腔(用胶束或其他传递载体)，鼻(用气溶胶)或者通过直肠或阴道(用栓剂或其他载体)。
保存物申请人的代理人，哈佛大学的校长及其同事，指出以上所列举的保存物，ATCC40787和HB10420是根据布达佩斯条约的条款同American Type Culture Colleetion(ATCC)in Rockville，Maryland一起进行的。他们还进一步指出ATCC是一个提供永久性保存的保管机构，如果一个专利被批准，公众很容易与之接洽。一旦一个专利被批准，对公众获得所保存材料的一切限制不可变更地都将取消。对于接受过根据37C.F.R1.15和35U.S.C.122规定，被授权的官员确定的审查人员，在该专利申请审查过程中这种材料也将可以得到。保存的材料在最近提出配制要保存的微生物样品的要求之后至少保存五年，并且，在任何情况下，关于在保存日之后至少30年的期限或关于该专利的可实施期限，无论哪一个期限，取较长一个。申请人的代理人宣告它的职责是在该保管机构由于保存条件的原因不能提供样品时更换保存物。
其他的体现在以下的权利要求书中。
权利要求
1.一种被充分分离的复合物，包括a)专门针对一选定的抗原或抗原族的多聚一lg；以及b)一种包括多聚一lg受体的多聚一lg键合区域的重组稳定剂蛋白，所述稳定剂蛋白实质上没有任何C一末端转移膜和细胞内多聚一lg受体区域；所述复合物的特征在于同未复合的多聚一lg相比较具有蛋白水解稳定性，所述复合物进一步的特征还在于该多聚一lg的专门的键合性能和免疫保护性交联性能。
2.一种被充分分离的复合物，包括a)一种专门针对一选定的抗原或抗原族的单克隆多聚-Ig，以及b)一种包括一个多聚-Ig受体的多聚-Ig键合区域的稳定剂蛋白，所述稳定剂蛋白实质上没有任何C-末端转移膜和细胞内多聚-Ig受体区域;所述复合物的特征在于同未复合的多聚-Ig相比较具有蛋白水解稳定性，所述复合物的进一步的特征还在于该多聚-Ig的专门键合性能和免疫保护性交联性能。
3.根据权利要求2所述的被充分分离的复合物，其特征在于所述稳定剂蛋白是一种重组蛋白。
4.根据权利要求1或2或3所述的被充分分离的复合物，其特征在于所述的多聚-Ig和所述的稳定剂蛋白是通过二硫键共价结合的。
5.根据权利要求1或2所述的被充分分离的复合物，其特征在于所述多聚-Ig是多聚-IgA类抗体。
6.根据权利要求1或2所述的被充分分离的复合物，其特征在于所述稳定剂蛋白包括多聚-Ig受体的区域Ⅰ和区域Ⅳ和Ⅴ中的至少一个，并且所述多聚-Ig稳定剂被截短，实质上失去了区域Ⅵ。
7.根据权利要求6所述的被充分分离的复合物，其特征在于所述稳定剂蛋白的所述区域Ⅰ和所述区域Ⅳ或Ⅴ之间有一段相应于大约100-500个氨基酸顺序的距离。
8.根据权利要求1或2所述的复合物，包括一个单克隆IgA抗体，该抗体专门针对一个选自以下一组抗原中一个抗原，这组抗原包括Pseudomonas aeruginosa，Hemophilus influenzae，Vibriocholerae，Bordetella pertussis，Corynebacterium diphtheriae，Es-cherichia coli，Salmonella typhi以及typhimurium，Clostridium per-fringens以及其他肠的clostridiae，Shigella dysenteriae，Shigella flexnerii、Neisseria gonorrheae，Trichomonas，Entameba histolytica，Giardia lamblia，Streptococcus，呼吸多核体病毒，旋转病毒(ro-tavirus)，呼吸道肠道病毒，人体(Human)免疫缺乏病毒，人体(Human)T-细胞亲淋巴性病毒，Ⅰ型和Ⅱ型，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，流感病毒，疱疹病毒，人类乳头状瘤病毒;Pneumocystis;酵母，以及精子抗原。
9.重组多聚-Ig稳定剂蛋白，包括多聚-Ig受体的一个多聚-Ig键合区，所述稳定剂蛋白实质上没有任何C-末端转移膜和细胞内多聚-Ig受体区，所述稳定剂蛋白具有与多聚-Ig形成复合物的特性，该复合物是蛋白水解作用稳定的并且具有该多聚-Ig的免疫保护性交联性质。
10.一种用于制造权利要求4的复合物方法，包括以下步骤a)提供一种设计用来生产所述稳定剂蛋白质的细胞，所述细胞还能产生专门针对所述选定的抗原或抗原族的单克隆抗体;b)培养所述细胞以产生所述复合物;以及c)收集所述复合物。
11.一种用于制造权利要求2的复合物的方法，其特征在于所述多聚-Ig和所述稳定剂通过二硫键共价结合，包括以下步骤提供设计用于产生多聚-Ig受体的碇系依靠上皮细胞;在一多孔支承体上形成所述细胞的一个单层的条件培养所述上皮细胞，所述多孔支承体和形成的单层使在该单层底侧的第一层介质与在该单层顶侧的第二介质分隔开;将单克隆IgA引入该单层的底侧;从所述单层的顶侧收集所述复合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述第一介质是适于维持所述上皮细胞生长的营养介质。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述第二介质实质上不含与收集所述复合物干扰的蛋白质。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述单克隆IgA是通过在所述第一介质中同时培养杂交肿瘤细胞来引入所述第一介质的。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述单克隆IgA首先在杂交肿瘤培养液中产生，然后将其与所述培养液分离，再往后被引入所述第一介质。
16.一种用于检测单克隆多聚-Ig以确定抵抗病原体或抵抗在体内怀孕的保护性的方法a)将所述单克隆-Ig引入对该病原体敏感的一种哺乳动物的循环系统中。b)检测所述哺乳动物的粘膜分泌物中的多聚-Ig;c)用所述病原体或精子对所述哺乳动物的粘膜表面进行免疫性试验。d)确定抗该病原体或精子免疫性试验保护性。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述单克隆多聚-Ig是通过向循环系统注射或灌注引入该哺乳动物的。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述单克隆多聚-Ig是通过皮下植入产生该单克隆多聚-Ig的肿瘤或肿瘤细胞引入该哺乳动物的。
19.一种用于保护哺乳动物抵抗病原体或避孕的方法，包括将权利要求1-3中的任意一种复合物给药所述哺乳动物的一种粘膜上。
20.权利要求19的方法，包括将该复合物通过口、鼻、阴道、直肠、眼睛，或通过中耳给药。
21.权利要求19的方法，包括第一个哺乳动物的粘膜分泌物中产生所述复合物，并将所述粘膜分泌物给予第二个哺乳动物。
22.权利要求21所述的方法，包括通过口腔将含有所述复合物的来自第一个哺乳动物的奶供给第二个哺乳动物。
23.权利要求21或22的方法，包括提供一种产生多聚-Ig的传诸永远的免疫细胞，将所述多聚-Ig引入第一个哺乳动物的循环系统，并从第一个哺乳动物身上收集粘膜分泌物。
24.一种培育产生单克隆多聚-Ig抗体的杂交肿瘤的方法，包括用一种抗原对一种哺乳动物进行免疫试验，从该哺乳动物Peyer斑粘膜或淋巴组织丰富的其他粘膜上收集淋巴细胞并将该淋巴细胞融合到骨髓细胞中以形成杂交肿瘤。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于通过将所述抗原加到该哺乳动物的一种粘膜表面对该哺乳动物进行免疫试验。
全文摘要
多聚-Ig抗体(特别是单克隆IgA抗体)同一种由该多聚-Ig受体衍生的稳定剂蛋白(特别是一种重组受体-衍生稳定剂蛋白)相复合，它包括至少该受体的一种多聚-Ig键合区，并且实质上没有任何C-末端转移膜或细胞内多聚-Ig受体区。该稳定的复合物可以用作被动疫苗给药到粘膜表面。还公开了一些用于在活体中筛选单克隆多聚-Ig的方法。还公开了一些利用设计用来制造多聚受体的碇系，依靠上皮细胞单层产生该复合物的方法。通过从淋巴细胞丰富的粘膜组织(例如Peyer斑)收集淋巴细胞来制取用于产生单克隆IgA的杂交肿瘤。
文档编号C12R1/91GK1057785SQ9110335
公开日1992年1月15日 申请日期1991年4月15日 优先权日1990年4月16日
发明者让-皮埃尔·克雷亨布尔, 理查德·A·韦尔齐恩, 玛丽安·R·纽特拉 申请人:哈佛大学校长及研究员协会, 瑞士癌病实验研究院