专利名称：四种病原体特异性免疫球蛋白g抗体及其亲和指数检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学和生物学检测领域，具体而言，本发明涉及巨细胞、风疹、单纯疱疹和弓形虫四种病原体特异性IgG抗体及其亲和指数检测试剂盒及其制备方法。
预防出生缺陷儿的降生，对中国具有特殊的重要意义。宫内感染是造成出生缺陷儿降生的重要原因之一，近年来中国各地区的计生系统也已逐步开展了预防宫内感染方面的工作，如对未孕的育龄妇女和已孕的孕妇进行有关可能引起宫内感染、造成出生缺陷的一些疾病的检测工作，目前主要集中于巨细胞病毒(CMV)、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒(HSV)和弓形虫(Toxo)感染的检测，检测方法多为检测其相应的特异性抗体。这些工作的开展无疑是对预防和减少出生缺陷儿的降生有重要价值的，但是我们发现在这一工作开展过程当中尚存在一些严重问题，应当引起重视，特别是以下几个问题(1)对预防工作重视不够表现在对已婚未孕的育龄妇女的检测不够重视，而只重视对孕妇的检测，事实上若在孕前进行检测，根据检测结果采取一些预防措施是非常有价值的。例如时已婚的育龄妇女于孕前检测风疹病毒IgG抗体，对此抗体阴性或低于15IU/ml的妇女进行疫苗注射，可有效地预防孕期风疹病毒的感染。
(2)分清检测对象目前国内不少地区对未孕的育龄妇女和已孕的孕妇一律单一的检测有关这些病原体的IgM抗体，这样做显然是不合理的。应该在合理的安排检测项目的前提下对未孕的育龄妇女主要检测有关IgG抗体而不是IgM抗体，因为检测IgG抗体可以反应是否感染过这种病原体，检测IgM是看是否近期有急性感染。对于未孕的育龄妇女检测过IgG抗体，孕后若发生急性感染，可根据孕前IgG检测结果判断孕后是原发感染还是再感染，可采取不同的措施；而对未孕的妇女检测有关IgM抗体则无必要，因为未孕的妇女即使发生有关急性感染，对一般免疫功能正常的人无大的影响，也不需治疗。而对已孕的孕妇来讲，如孕前未检查过有关IgG抗体，此时若单纯再查IgG抗体已无意义，应该检查有关IgM抗体，因为只有孕期发生急性感染才可能对胎儿有所损害。
(3)孕妇孕期的感染是原发感染还是继发再感染对引发宫内感染的机率和对胎儿造成的损伤程度有很大的不同，原发感染要比继发再感染严重得多，因此区分孕妇原发感染和继发感染也很重要。如果未孕前检测过有关IgG抗体则很容易根据孕后检测有关IgM的结果进行区分，但我国的具体情况是绝大多数未孕的育龄妇女并未检测过有关IgG抗体，而多数是孕后才做有关IgM的检测，但是单靠一份血清检测IgM阳性并不能区分是原发还是继发再感染，因此还必须对IgM阳性者加试有关IgG的亲和指数。若IgM阳性而其相应的IgG亲和指数小于50％则为近期原发感染，而IgM虽然阳性但其相应的IgG亲和指数大于60％则多不是近期原发感染，对于原发感染的孕妇必须进一步观察做必要的产前诊断。
本发明所涉及的四种病原体是可能引发宫内感染最常见的几种病原体其共同点在于孕妇感染后都可能引起胎儿的感染，对胎儿造成损害产生出生缺陷，影响中国人口素质，给社会、个人及其家庭带来难以估计的损失，尤其是孕妇原发感染的危害又远较继发再感染严重。考虑到对同一患者经常要同时对此四种病原体的抗体进行检测，因此这四种检测试剂盒同时制备。
综上所述，可以清楚的看出制备这四种病原体的IgG特异性抗体及其亲和指数的检测试剂盒的必要性和重要性。客观要求导致本发明的产生。
因此，本发明的目的是提供对育龄妇女孕前检测血清中巨细胞病毒(CMV)、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒(HSV)和弓形虫(Toxo)的特异性IgG抗体分别简写成CMV-IgG为巨细胞病毒特异性免疫球蛋白抗体G、RV-IgG为风疹病毒特异性免疫球蛋白抗体G、TOXO-IgG为弓形虫特异性免疫球蛋白的G抗体、HSV1+2-IgG为单纯疱疹病毒I型加II型特异性免疫球蛋白抗体G、及对孕妇检测其IgG抗体亲和指数之用的试剂盒。
本发明的内容包括下面的四种病原体特异性免疫球蛋白G抗体及其亲和指数检测试剂盒，即1.一种巨细胞病毒特异性IgG抗体及其亲和指数的检测试剂盒，该试剂盒包括a.抗原包被板条以巨细胞病毒AD169株经培养获取抗原，经纯化后包被于聚苯乙烯制成的8孔或12孔为一条的ELISA专用板条；b.用辣根过氧化物酶自行标记或以商品形式购入的抗人IgG或葡萄球菌A蛋白；c.显色液A为含H2O2的溶液，显色液B为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；d.其它试剂盒配套试剂包括标本稀释液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓缩清洗液为含Tween-20的磷酸缓冲液，终止液为2N的H2SO4溶液；e.定量标准品为已知CMV-IgG含量为10IU/ml的血清，阳性对照为已知CMV-IgG含量为6.4IU/ml的人血清，阴性对照为已知CMV-IgG含量小于0.4IU/ml的人血清，临界值为已知CMV-IgG含量为0.4IU/ml的人血清；f.温和蛋白变形剂为含8M尿素的磷酸盐缓冲液或含35mM二乙胺的磷酸盐缓冲液。
2.一种风疹病毒特异性IgG抗体及其亲和指数的检测试剂盒，该试剂盒包括a.抗原包被板条以风疹病毒Gos株经培养获取抗原，经纯化后包被于聚苯乙烯制成的8孔或12孔为一条的ELISA专用板条；b.用辣根过氧化物酶自行标记或以商品形式购入的抗人IgG或葡萄球菌A蛋白；c.显色液A为含H2O2的溶液，显色液B为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；d.其它试剂盒配套试剂包括标本稀释液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓缩清洗液为含Tween-20的磷酸缓冲液，终止液为2N的H2SO4溶液；e.定量标准品为已知RV-IgG含量为120IU/ml的血清，阳性对照为已知RV-IgG含量为100IU/ml的人血清，阴性对照为已知RV-IgG含量小于10IU/ml的人血清，临界值为已知RV-IgG含量为15IU/ml的人血清；f.温和蛋白变形剂为含8M尿素的磷酸盐缓冲液或含35mM二乙胺的磷酸盐缓冲液。
3.一种单纯疱疹病毒特异性IgG抗体及其亲和指数的检测试剂盒，该试剂盒包括a.抗原包被板条以单纯疱疹病毒I型SM-44株及单纯疱疹II型G株经培养获取抗原，经纯化后等量混合包被于聚苯乙烯制成的8孔或12孔为一条的ELISA专用板条；b.用辣根过氧化物酶自行标记或以商品形式购入的抗人IgG或葡萄球菌A蛋白；c.显色液A为含H2O2的溶液，显色液B为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；d.其它试剂盒配套试剂包括标本稀释液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓缩清洗液为含Tween-20的磷酸缓冲液，终止液为2N的H2SO4溶液；e.定量标准品为已知HSV1+2-IgG含量为64AU/ml的血清，阳性对照为已知HSV1+2-IgG含量为32AU/ml的人血清，阴性对照为已知HSV1+2-IgG含量小于4AU/ml的人血清，临界值为已知HSV1+2-IgG含量为4AU/ml的人血清；f.温和蛋白变形剂为含8M尿素的磷酸盐缓冲液或含35mM二乙胺的磷酸盐缓冲液。
4.一种弓形虫特异性IgG抗体及其亲和指数的检测试剂盒，该试剂盒包括a.抗原包被板条以弓形虫RH株经培养获取抗原，经纯化后包被于聚苯乙烯制成的8孔或12孔为一条的ELISA专用板条；
b.用辣根过氧化物酶自行标记或以商品形式购入的抗人IgG或葡萄球菌A蛋白；c.显色液A为含H2O2的溶液，显色液B为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；d.其它试剂盒配套试剂包括标本稀释液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓缩清洗液为含Tween-20的磷酸缓冲液，终止液为2N的H2SO4溶液；e.定量标准品为已知Toxo-IgG含量为240IU/ml的血清，阳性对照为已知Toxo-IgG含量为120IU/ml的人血清，阴性对照为已知Toxo-IgG含量小于15IU/ml的人血清，临界值为已知Toxo-IgG含量为15IU/ml的人血清；f.温和蛋白变形剂为含8M尿素的磷酸盐缓冲液或含35mM二乙胺的磷酸盐缓冲液。
由于间接ELISA方法检测特异性抗体具有经济、快速、简便、敏感、特异、可定量、适宜大量标本检测等优点，适宜于在各种级别的医院和计生部门开展，所以我们确定用该方法研制检测特异性IgG抗体及其亲和指数的试剂盒。本发明主要采用了现代分子生物学技术对抗原进行纯化，以减少检测过程中可能出现的非特异性反应，用我们自行研制的定量标准品滤纸干燥法、酶标记物稳定稀释液和显色液，制备的试剂盒稳定、灵敏、特异、简便、重复性及稳定性都较好，与国外同类产品相近，为本发明的产品商业化提供了保证。
本发明的内容是采用对各种病原体敏感的细胞株接种病原体标准株，经增殖后收获病毒抗原，再经不同步骤纯化后用标准阴阳血清滴定选出适宜的抗原包被浓度，以适当条件包被固相载体，经稳定性处理密封保存，与其相应的配套试剂组装成试剂盆。一种试剂盒为定量检测各相应特异性IgG抗体，一种是检测各相应的IgG抗体的亲和指数。
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。
实施例1风疹病毒特异性IgG抗体检测试剂盒及其制备(一)抗原制备1.将Vero细胞培养至单层，将风疹病毒Gos株接种，细胞生长液为含10％小牛血清的DMEM培养液，37℃吸附1-2小时后倾去接种物，加入含1％小牛血清的DMEM维持液，35℃、5％的CO2培养5-7天。
2.收集染毒细胞，离心取上清加入NaCl和PEG(MW＝6000)。
3.离心取沉淀。
4.经4℃、85000g、2h蔗糖密度梯度离心纯化。
5.取中间带经透析后测蛋白，经阴阳血清滴定确定包被浓度后分装，贮存于-70℃。
(二)ELISA包被固相载体1.用包被缓冲液将风疹抗原稀释至最佳包被浓度，包被载体，每孔100μl，室温2h后移入4℃过夜。
2.用3％BSA+稳定剂封闭，每孔120μl，室温2h后洗两次，再经稳定剂处理两次，晾干后密封，4℃保存。(三)操作流程1.检测血清将血清作1∶101稀释后每孔加入100μl，阴阳对照、临界值或定量标准品溶化后直接加入各相应孔内，37℃，60min。
2.洗五次后，加酶标记抗人IgG(事先滴定选出最佳稀释度)，每孔100μl，37℃，60min。
3.洗五次后，加入TMB-H2O2显色系统，室温，避光，30min。
4.加入终止液(2M H2SO4)，酶标仪450nm测各孔OD值。
5.计算，判断结果。
(四)试剂盒组成密封包被板条(48孔或96孔)，酶标抗人IgG，浓缩清洗液，标本稀释液，显色液A，显色液B，终止液，定量标准品(或阳性对照、阴性对照、临界值)，说明书。
实施例2风疹病毒特异性IgG抗体亲和指数检测试剂盒及其制备(一)抗原制备同实施例1(二)ELISA包被固相载体同实施例1(三)操作流程1.检测血清作1∶101稀释后，每孔100μl，每份标本均作两孔，37℃，60min。
2.洗液洗两次后，每份标本两孔中的一孔加入变性剂300μl保持10min，另一孔加入洗液300μl保持10min，然后甩掉，再用洗液各洗两次。
3.均加入酶标记抗人IgG，每孔100μl，37℃，60min。
4.洗五次后，加入TMB-H2O2显色系统，室温，避光，3min。
5.加入终止液(2M H2SO4)，酶标仪450nm测各孔OD值。
6.按说明书提供的公式计算每份标本的亲和指数。
(四)试剂盒组成同实施例1所列，再加一瓶变性剂。
实施例3巨细胞病毒特异性IgG抗体检测试剂盒及其制备(一)抗原制备1.将人胚肺二倍体细胞培养至单层，接种CMV-AD169株，细胞生长液为含10％小牛血清的DMEM培养液，37℃吸附1-1.5小时后倾去接种物，加入含1％小牛血清的DMEM维持液，35℃、5％的CO2生长5-6天，100％病变，胰酶消化。
2.收集染毒细胞，加入0.05M/L甘氨酸-NaOH、pH9.0的缓冲液悬浮。
3.超声波处理后离心取上清。
4.测蛋白，经阴阳血清棋盘滴定确定包被浓度后分装，贮存于-70℃。
(二)ELISA包被固相载体同实施例1(三)操作流程同实施例1(四)试剂盒组成同实施例1实施例4巨细胞病毒特异性IgG抗体亲和指数检测试剂盒及其制备(一)抗原制备同实施例3(二)ELISA包被固相载体同实施例1(三)操作流程同实施例2(四)试剂组成同实施例2实施例5弓形虫特异性IgG抗体检测试剂盒及其制备(一)抗原制备1.将Vero细胞培养至单层，接种弓形虫RH株，培养3-5天。
2.收集大量繁殖满视野的虫体及细胞，经G3漏斗过滤。
3.收集滤液1700rpm离心20min。
4.将沉淀悬浮于PBS中，超声处理。
5.离心处理，1500rpm、30min，取上清。
6.测蛋白，经阴阳血清棋盘滴定确定包被浓度后分装，贮存于-70℃。
(二)ELISA包被固相载体同实施例1
(三)操作流程同实施例1(四)试剂盒组成同实施例1实施例6弓形虫特异性IgG抗体亲和指数检测试剂盒及其制备(一)抗原制备同实施例5(二)ELISA包被固相载体同实施例1(三)操作流程同实施例2(四)试剂盒组成同实施例2实施例7单纯疱疹病毒I型II型特异性IgG抗体检测试剂盒及其制备(一)抗原制备1.将人胚肺二倍体细胞培养至单层，分别接种单纯疱疹病毒I型SM-44株和单纯疱疹病毒II型G株，细胞生长液为含10％小牛血清的DMEM培养液，37℃吸附1-1.5小时后倾去接种物，加入含1％小牛血清的DMEM维持液，35℃、5％的CO2生长3天，100％病变，胰酶消化。
2.收集染毒细胞，加入0.05M/L甘氨酸-NaOH、pH9.0的缓冲液悬浮。
3.超声波处理后离心取上清。
4.测蛋白，经阴阳血清棋盘滴定确定包被浓度混合后分装，贮存于-70℃。
(二)ELISA包被固相载体同实施例1(三)操作流程同实施例1(四)试剂盒组成同实施例1实施例8单纯疱疹病毒I型II型特异性IgG抗体亲和指数检测试剂盒及其制备(一)抗原制备同实施例7(二)ELISA包被固相载体同实施例1(三)操作流程同实施例2(四)试剂盒组成同实施例权利要求
1.一种巨细胞病毒特异性IgG抗体及其亲和指数的检测试剂盒，该试剂盒包括a.抗原包被板条以巨细胞病毒AD169株经培养获取抗原，经纯化后包被于聚苯乙烯制成的8孔或12孔为一条的ELISA专用板条；b.用辣根过氧化物酶自行标记或以商品形式购入的抗人IgG或葡萄球菌A蛋白；c.显色液A为含H2O2的溶液，显色液B为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；d.其它试剂盒配套试剂包括标本稀释液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓缩清洗液为含Tween-20的磷酸缓冲液，终止液为2N的H2SO4溶液；e.定量标准品为已知CMV-IgG含量为10IU/ml的血清，阳性对照为已知CMV-IgG含量为6.4IU/ml的人血清，阴性对照为已知CMV-IgG含量小于0.4IU/ml的人血清，临界值为已知CMV-IgG含量为0.4IU/ml的人血清；f.温和蛋白变形剂为含8M尿素的磷酸盐缓冲液或含35mM二乙胺的磷酸盐缓冲液。
2.一种风疹病毒特异性IgG抗体及其亲和指数的检测试剂盒，该试剂盒包括a.抗原包被板条以风疹病毒Gos株经培养获取抗原，经纯化后包被于聚苯乙烯制成的8孔或12孔为一条的ELISA专用板条；b.用辣根过氧化物酶自行标记或以商品形式购入的抗人IgG或葡萄球菌A蛋白；c.显色液A为含H2O2的溶液，显色液B为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；d.其它试剂盒配套试剂包括标本稀释液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓缩清洗液为含Tween-20的磷酸缓冲液，终止液为2N的H2SO4溶液；e.定量标准品为已知RV-IgG含量为120IU/ml的血清，阳性对照为已知RV-IgG含量为100IU/ml的人血清，阴性对照为已知RV-IgG含量小于10IU/ml的人血清，临界值为已知RV-IgG含量为15IU/ml的人血清；f.温和蛋白变形剂为含8M尿素的磷酸盐缓冲液或含35mM二乙胺的磷酸盐缓冲液。
3.一种单纯疱疹病毒特异性IgG抗体及其亲和指数的检测试剂盒，该试剂盒包括a.抗原包被板条以单纯疱疹病毒I型SM-44林及单纯疱疹II型G林经培养获取抗原，经纯化后等量混合包被于聚苯乙烯制成的8孔或12孔为一条的ELISA专用板条；b.用辣根过氧化物酶自行标记或以商品形式购入的抗人IgG或葡萄球菌A蛋白；c.显色液A为含H2O2的溶液，显色液B为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；d.其它试剂盒配套试剂包括标本稀释液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓缩清洗液为含Tween-20的磷酸缓冲液，终止液为2N的H2SO4溶液；e.定量标准品为已知HSV1+2-IgG含量为64AU/ml的血清，阳性对照为已知HSV1+2-IgG含量为32AU/ml的人血清，阴性对照为已知HSV1+2-IgG含量小于4AU/ml的人血清，临界值为已知HSV1+2-IgG含量为4AU/ml的人血清；f.温和蛋白变形剂为含8M尿素的磷酸盐缓冲液或含35mM二乙胺的磷酸盐缓冲液。
4.一种弓形虫特异性IgG抗体及其亲和指数的检测试剂盒，该试剂盒包括a.抗原包被板条以弓形虫RH株经培养获取抗原，经纯化后包被于聚苯乙烯制成的8孔或12孔为一条的ELISA专用板条；b.用辣根过氧化物酶自行标记或以商品形式购入的抗人IgG或葡萄球菌A蛋白；c.显色液A为含H2O2的溶液，显色液B为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；d.其它试剂盒配套试剂包括标本稀释液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓缩清洗液为含Tween-20的磷酸缓冲液，终止液为2N的H2SO4溶液；e.定量标准品为已知Toxo-IgG含量为240IU/ml的血清，阳性对照为已知Toxo-IgG含量为120IU/ml的人血清，阴性对照为已知Toxo-IgG含量小于15IU/ml的人血清，临界值为已知Toxo-IgG含量为15IU/ml的人血清；f.温和蛋白变形剂为含8M尿素的磷酸盐缓冲液或含35mM二乙胺的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明涉及巨细胞、风疹、单纯疱疹病毒和弓形虫四种病原体的特异性IgG抗体及其亲和指数检测试剂盒，即将巨细胞病毒AD
文档编号G01N33/569GK1553189SQ0313648
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月5日 优先权日2003年6月5日
发明者马旭, 侯林浦, 姜英涛, 高英, 马 旭 申请人:马旭, 马 旭