专利名称：高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫球蛋白抗体，尤其是涉及一种采用糖基转移酶催化增加免疫球蛋白 抗体上的唾液酸含量的方法及其应用。
背景技术：
免疫球蛋白抗体，如静脉注射免疫球蛋白G，被广泛用于治疗慢性自我免疫疾病等 (1. Imbach， P.， Barandun, S.， d'Apuzzo，V.， et al, High-dose intravenous gammaglobulin for idiopathic thrombocytopenic purpura in childhood,i， 1228 (1981); 2. Blanchette， V， Imbach, P.， Andrew, M.， et. al. Randomised trial of intravenous immunoglobulin G, intravenous anti-D， and oral prednisone in childhood acute immune thrombocytopenic purpura,丄awc" 344, 703 (1994); 3. Y. Sultan, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Anti-idiotypic suppression of autoantibodies to factor VIII (antihaemophilic factor) by high-dose intravenous gammaglobulin Za"c" ii, 765 (1984); 4. D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox， C. M. Black, C. M. Lockwood， Treatment of systemic vasculitis with pooled intravenous immunoglobulin丄tmc" 337, 1137 (1991) ; 5 . P. LeHoang， N. Cassoux， F. George, N. et.al.D.Kazatchkine, Intravenous immunoglobulin (IVIg) for the treatment of birdshot retinochoroidopathy, (9cw/. /附附wwo/. /",a附m. 8,49 (2000))。免疫球蛋白抗体上的糖基的结构是非均一的，含有不同结构的糖基的免疫球 蛋白抗体有不同的生理活性。比如，静脉注射免疫球蛋白G含有两个N-连接糖基，其N-连接糖 基有不同的末端结构，末端结构为唾液'酸的静脉注射免疫球蛋白G在总的静脉注射免疫球蛋白 G中的比例低于5M (Routier， F. H.， Hounsell, E. F.， Rudd， P. M., et.al.Quantitation of the oligosaccharides of human serum IgG from patients with rheumatoid arthritis: a critical evaluation of different methods J. Immunol. Methods 213， 113 (1998))。而恰恰是这含量不足5%、含有 唾液酸的静脉注射免疫球蛋白G是治疗抗炎症的有效成分(Yoshikatsu Kaneko， Falk Nimmerjahn, Jeffrey V. Ravetch ， Anti-Inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation， Sde"ce 313， 670 (2006))，大剂量的静脉注射免疫球蛋白G在人体内会诱发严 重的副反应。因此提高静脉注射免疫球蛋白G上N-连接糖基末端唾液酸的含量对提高它的药 效，降低用药剂量以减轻副反应有重要医疗价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法及其应用。 本发明的技术方案是采用糖基转移酶催化方法将唾液酸连接到免疫球蛋白抗体的N-连接
糖基上，用于有效提高免疫球蛋白的唾液酸含量，通过把不含有唾液酸的成分转变为含有唾 液酸的有效成分，而提高其活性药物成分的比例。
本发明所述的一种高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法的具体步骤为
1) 用胞苷-5'-磷酸-唾液酸合成酶催化唾液酸与胞苷-5'-三磷酸(CTP)反应生成胞苷-5'-磷酸-唾液酸；
2) 利用以尿苷二磷酸(UDP)-半乳糖为底物的ei， 4半乳糖基转移酶，催化连接半乳
糖到免疫球蛋白糖基的末端N-乙酰氨基葡萄糖上；
3) 利用以胞苷-5'-磷酸-唾液酸为底物的唾液酸基转移酶，催化连接唾液酸到免疫球蛋白 糖基末端的半乳糖上。
免疫球蛋白可为多克隆免疫球蛋白抗体或单克隆抗体。多克隆免疫球蛋白抗体选自静脉 注射免疫球蛋白G (Intravenous IgG)等。所述的底物为尿苷二磷酸-半乳糖或尿苷二磷酸陽半 乳糖-4-差向异构酶酶催化尿苷二磷酸-葡萄糖生成的尿苷二磷酸-半乳糖等。
唾液酸基转移酶为a2，6唾液酸塞转移酶，a2，3唾液酸基转移酶，a2,8唾液酸基转移 酶，a 2, 9唾液酸基转移酶或a 2, 8/9多聚唾液酸基转移酶等。
所制备的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体可应用于制备治疗自身免疫性疾病药物，如治 疗类风湿性关节炎。
本发明的有益效果是通过糖基转移酶催化把唾液酸连接到静脉注射免疫球蛋白的N-连 接糖基上，把不含有唾液酸的没有抗炎活性的成分转变为含有唾液酸的有效成分而提高其活 性药物成分的比例。由于经过本发明处理的静脉注射免疫球蛋白G有高含量唾液酸(70%)， 因此降低了静脉注射免疫球蛋白G用于治疗自身免疫性疾病的药剂量，进而降低大剂量所带 来的副作用。
图l为本发明实施例的静脉注射免疫球蛋白的N-连接糖基的不同结构示意图。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
在100 ml的缓冲溶液(100 mraol磷酸溶液，pH 7. 5,含有2画ol 二价锰离子和5 mmol 二价镁离子)中加入静脉注射免疫球蛋白G (0.5g)，尿苷二磷酸-葡萄糖(0.2g)，胞苷-5'-
三磷酸(0.2g),唾液酸(0.1 g)，尿苷二磷酸-半乳糖4-差向异构酶酶(20单位活性)，e 1, 4半乳糖基转移酶((20单位活性)，胞苷-5'-磷酸-唾液酸合成酶(20单位活性)和a 2, 6唾 液酸基转移酶(20单位活性)。反应液在4t:缓慢搅拌12 h。反应液通过His-Tag蛋白纯化柱 除去所有的糖基转移酶。然后反应液通过透析除去没有反应的尿苷二磷酸-葡萄糖等小分子， 缓冲溶液以及金属离子而得到高含量唾液酸的静脉注射免疫球蛋白G。经过检测唾液酸的含 量，与没有反应的静脉注射免疫球蛋白G相比，经过糖基转移酶催化的静脉注射免疫球蛋白 G的唾液酸的含量提高了 10 15倍。
图1给出本发明实施例的静脉注射免疫球蛋白的N-连接糖基的不同结构示意图，通过糖 基转移酶催化把唾液酸连接到静脉注射免疫球蛋白G的N-连接糖基上的末端而把把没有抗炎 活性的成分转化为有效成分(A)。免疫球蛋白抗体含有两个N-连接糖侧链，为了图示的简单， 仅画出一个。ei， 4半乳糖基转移酶以尿苷二磷酸-半乳糖为底物，催化连接半乳糖(图l， 圆形)到免疫球蛋白糖基的末端N-乙酰氨基葡萄糖上使得C转化为D;唾液酸基转移酶以胞 苷-5'-磷酸-唾液酸为底物催化连接唾液酸(图1，菱形)到免疫球蛋白糖基末端的半乳糖上使 得成分B与D转化为A。
经实验，高唾液酸含量的静脉注射免疫球蛋白G与未经本发明处理的静脉注射免疫球蛋 白G被分别注射到有类风湿性关节炎的小老鼠体内(O. lg/Kg)与静脉注射免疫球蛋白G相比， 高唾液酸含量的静脉注射免疫球蛋白G能够有效地保护小老鼠的关节发炎程度(药效提高4 5倍)。
权利要求
1、高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法，其特征在于其步骤为1)胞苷-5’-磷酸唾液酸合成酶催化唾液酸与胞苷-5’-三磷酸反应生成胞苷-5’-磷酸-唾液酸；2)β1，4半乳糖基转移酶以尿苷二磷酸-半乳糖为底物，催化连接半乳糖到免疫球蛋白糖基的末端N-乙酰氨基葡萄糖上；3)唾液酸基转移酶以胞苷-5’-磷酸-唾液酸为底物催化连接唾液酸到免疫球蛋白糖基末端的半乳糖上。
2. 根据权利要求1所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法，其特征在于免疫 球蛋白为多克隆免疫球蛋白抗体或单克隆抗体。
3. 根据权利要求2所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法，其特征在于多克 隆免疫球蛋白抗体选自静脉注射免疫球蛋白G。
4. 根据权利要求2所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法，其特征在于单克 隆抗体选自免疫球蛋白M或免疫球蛋白A。
5. 根据权利要求1所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法，其特征在于底物 为尿苷二磷酸-半乳糖，或尿苷二磷酸-半乳糖-4-差向异构酶酶催化尿苷二磷酸-葡萄糖生成的 尿苷二磷酸-半乳糖。 '
6. 根据权利要求1所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法，其特征在于唾液 酸基转移酶为a2，6唾液酸基转移酶，a2，3唾液酸基转移酶，a 2， 8唾液酸基转移酶，a 2， 9 唾液酸基转移酶或a 2, 8/9多聚唾液酸基转移酶。
7. 根据权利要求1所制备的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体在制备治疗自身免疫性疾病 药物中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的治疗自身免疫性疾病药物为类风湿性 关节炎药物。
全文摘要
高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法与应用，涉及一种免疫球蛋白抗体，尤其是涉及一种采用糖基转移酶催化增加免疫球蛋白抗体上的唾液酸含量的方法及其应用。提供一种高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体的制备方法及其应用。胞苷-5’-磷酸-唾液酸合成酶催化唾液酸与胞苷-5’-三磷酸反应生成胞苷-5’-磷酸-唾液酸；β1，4半乳糖基转移酶以尿苷二磷酸-半乳糖为底物，催化连接半乳糖到免疫球蛋白糖基的末端N-乙酰氨基葡萄糖上；唾液酸基转移酶以胞苷-5’-磷酸-唾液酸为底物催化连接唾液酸到免疫球蛋白糖基末端的半乳糖上。所制备的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗体可用于制备治疗自身免疫性疾病药物，尤其是类风湿性关节炎。
文档编号A61K39/395GK101358225SQ20071000930
公开日2009年2月4日 申请日期2007年7月30日 优先权日2007年7月30日
发明者韩守法, 韩家淮 申请人:厦门大学