专利名称：一种麦类染色体标本制作方法
技术领域：
本发明属于细胞遗传学和细胞生物学领域。
背景技术：
麦类是人类重要的粮食作物。在麦类的起源和演化研究、杂交育种、外源染色体的遗传规律和鉴定中，染色体研究是不可缺的。麦类染色体的工作对细胞遗传学的理论和育种实践也有很大的贡献，其中如单体、端体、缺体、四体、各种附加系、单倍体、多倍体等的建立、研究和应用。在基因组和后基因组时代，染色体的研究仍然具有重要地位。真核生物的遗传是以染色体为单位的。在基因组研究中，遗传图和物理图的绘制，基因的染色体定位，均涉及到染色体研究。近几年，共线性研究对揭示生物多样性的起源、演化和很多生物学的基本原理，均有重要意义，该研究也是基于染色体的。
麦类染色体标本的制作，是进行麦类细胞遗传学研究和相应的基于染色体的工作的前提。而染色体标本的制作，需要一定的经验。因此，对初学者、有时甚至对具丰富经验者，常常会难以获得足够的中期分裂相的染色体标本，因而在研究中会花费很多宝贵时间和精力。需要进行染色体分带等工作时，对染色体标本的质量有一定要求，这时尤其如此。另外，对大学生和研究生教学来说，染色体标本的制作仍然是经验性要求较高的实验技术。
发明内容
本发明公开了一种麦类染色体标本标准化制作方法。
本发明方法主要包括以下步骤种子浸泡、萌发、低温处理、复温生长、前处理、固定和制片步骤。
具体操作30～32℃温水浸泡种子2～5min，然后26±1℃，再浸泡7～15小时；26±1℃，10～14小时进行萌发；再在0～4℃低温处理4～14小时；然后26±1℃进行12～14小时复温生长；选择根长约为1.3～1.7cm或根长是在此基础上以1cm为单位递增的种子，置于预冷到0～4℃的α-溴萘饱和水溶液中，在0～4℃的冰箱中处理11～14小时或22～26小时；然后用3∶1(v/v)甲醇-冰醋酸固定液固定后制片；以上步骤最好在黑暗条件下进行；萌发、低温处理和复温生长的时间在所述时间基础上可以以12小时为一间隔单位递增。
本发明可以通过以下操作得以实现第一步 浸种。26±1℃，黑暗。7～15小时。
首先用30～32℃温水浸泡种子2～5min，冲洗3～5次，手搓或用刷子刷洗去种子表面的浮土；然后将种子浸泡在30～32℃温水中，置于26±1℃的恒温箱中。中间换1～2次26±1℃温水。
第二步 萌发。26±1℃，黑暗。10～14小时，可12小时递增，如26、38小时等。
将滤纸平铺于干净的培养皿中，加少量自来水，滤纸湿润并倾斜培养皿可看到有少量水，按直径10cm培养皿有0.8～1ml富裕的水为宜；将种子摆放在湿滤纸上，沿培养皿摆放一周，芽朝向培养皿中心。摆放种子密度不宜太大，直径10cm的培养皿可摆放30粒种子。
第三步 0～4℃处理。4～14小时，可12小时递增，如26、38小时等。
挑选根长约5mm(3～7mm)的种子，放在一个新的铺有湿滤纸的培养皿中；连同培养皿一起移放到0～4℃(冰箱)，不推荐使用冰水，不能结冰。
第四步 恢复生长。26±1℃，12～14小时，可12小时递增，如26、38小时等。
从0～4℃冰箱取出培养皿，置于26±1℃恒温箱中，恢复生长。在26±1℃，麦类的根的伸长节律为每12小时伸长(递增)1厘米左右。
第五步 前处理。0～4℃，11～14小时，推荐12小时。
挑选符合伸长节律的种子，即根长约为1.3～1.7cm或根长是在此基础上以1cm为单位递增(12小时为一生长周期，根生长约1cm)，根毛区距离根尖在0.5cm以上；对不符合每12小时伸长1cm左右的种子，主要是根的伸长(递增)明显少于1cm的种子，弃之不用。
取根，或连同种子一起，置于预冷到0～4℃的α-溴萘饱和水溶液中，在0～4℃的冰箱中处理11～14小时。要求根全部淹没，α-溴萘饱和水溶液的量要多点，α-溴萘饱和水溶液∶材料为40～50∶1。不推荐使用冰水。
第六步 固定。配制3∶1(v/v)甲醇-冰乙酸固定液，用前新鲜配制为宜；可用乙醇代替甲醇，体积比不变。
从0～4℃冰箱取出经α-溴萘饱和水溶液处理的根，倾去α-溴萘饱和水溶液，按30∶1加入新鲜配制的固定液，略摇，室温固定24小时，然后在0～4℃保存。对麦类根尖，新鲜的固定液中1小时即已完成固定过程。不推荐在0～4℃长期保存，对长期保存材料，制片前应再用新鲜配制的本固定液重新固定1小时。
采用酶解涂片的，也可以不进行固定，到制片时用新鲜配制的本固定液临时固定。
对克隆所需的染色体标本制作，不推荐使用酸，而宜使用70％乙醇单独固定，或最好不用固定，采用酶解制片，加75％酒精临时固定。
第七步 制片。可采用压片、涂片、悬液滴片等各种制片技术，制备染色体标本玻片。
本发明针对各种麦类植物和麦类近缘种的染色体标本制作。包括一粒小麦、二粒小麦、普通小麦、大麦、青稞、黑麦、小黑麦、燕麦、偃麦草、冰草。
本发明的特征是，在对麦类细胞生物学和遗传学研究的基础上，根据发明人在生长节律方面的发现，进行整个方法的设计和实施的。发明人发现，在规定的温度下，麦类植物细胞表现出典型的生长节律，12小时为一生长周期，26±1℃条件下根一生长周期生长约1cm，并建立了交替温度处理达到共振、生长节律明显的方法即共振法。本方法采用共振法加强这种节律。因此，对操作每一步骤有严格的时间和温度要求，同时要求观察根的伸长要符合节律。
本发明公开的方法，是发明人积累20多年的细胞生物学和遗传学的理论研究，及在染色体标本方面的制作经验，设计并实施的；本方法经过一些无经验的初学者试验性的实施验证，均获得足够的中期分裂相，可满足进一步的基于染色体的下一步工作。本流程适当改进或不作改进，也可以应用到其它植物染色体标本的制作。
本发明具有以下优点本方法操作简单，采用该方法，一个初学者也可以获得足够的中期分裂相，满足染色体分析、组型分析、染色体分带及带型分析、原位杂交、姐妹染色单体差别染色和姐妹染色单体交换、染色体显微切割和克隆等及所有基于染色体的研究所需要的染色体标本制作工作。
具体实施例方式
实施例1 普通小麦的染色体标本制作第一天8:00浸种。首先用30～32℃温水浸泡种子2～5min，冲洗3～5次，手搓或用刷子刷洗去种子表面的浮土；然后将种子浸泡在30～32℃温水中，置于26±1℃的恒温箱中。中间换1～2次26±1℃温水。
20:00发根。将滤纸平铺于干净的培养皿中，加少量自来水，滤纸湿润并倾斜培养皿可看到有少量水，按直径10cm培养皿有0.8～1ml富裕的水为宜；将种子摆放在湿滤纸上，沿培养皿摆放一周，芽朝向培养皿中心。每个直径10cm的培养皿摆放30粒种子。26±1℃的恒温箱中黑暗萌发。
第二天8:00或20:00进行0～4℃处理。挑选根长约5mm(3～7mm)的种子，放在一个新的铺有湿滤纸的培养皿中；连同培养皿一起移放到0～4℃冰箱。
第三天9:00或21:00恢复生长。从0～4℃冰箱取出培养皿，置于26±1℃恒温箱中，恢复生长。
第四天10:00前处理。挑选符合伸长节律的种子，根长约为1.5cm或2.5cm，根毛区距离根尖在0.5cm以上；取根，置于预冷到0～4℃的α-溴萘饱和水溶液中，在0～4℃的冰箱中处理过夜。
第五天10:00固定。从0～4℃冰箱取出经α-溴萘饱和水溶液处理的根，倾去α-溴萘饱和水溶液，按30∶1加入新鲜配制的3∶1无水乙醇-冰乙酸固定液，略摇，室温固定1小时。
11:00制片。分别采用压片、涂片、悬液滴片法，制备染色体标本玻片。
实施例2 大麦、燕麦、偃麦草和冰草等有壳种子类的染色体标本制作第一天预先用流水冲洗除去种子表面的浮土和空壳。
8:00浸种。种子浸泡在30～32℃温水中，置于26±1℃的恒温箱中。中间换3～4次26±1℃温水。
以下流程同实施例1。
实施例3 黑麦、青稞(裸大麦)、一粒小麦、二粒小麦、小黑麦和莜麦(裸燕麦)等无壳裸种子类的染色体标本制作整个流程同实施例1。
实施例4 大田麦类植株根尖染色体标本的制作抽穗期到灌浆后期的普通小麦，傍晚太阳落下后浇水，浇透。第三天或第四天的上午9～10点，地里可以进人时，取材。
用长柄镊子，在目标植株根部的一侧挖开土壤，寻找白色的新发根，剪取根尖端的约0.5～1.5cm长，清水洗去泥土后，放入有水的小瓶，保存在壶盖内层加有冰块的冰壶中。为保证该植株籽粒的正常成熟，尽量避免根部的四周全部挖开。这个根部挖开面积视籽粒成熟情况而定，籽粒愈成熟，挖开的面积可愈大；而对灌浆一半左右的植株，最好不要超过3/4。
在实验室中，加适量预冷到0～4℃的α-溴萘饱和水溶液中，在0～4℃的冰箱中处理过夜。
次日上午10～11点，从0～4℃冰箱取出经α-溴萘饱和水溶液处理的根，倾去α-溴萘饱和水溶液，按30∶1加入新鲜配制的固定液，室温固定1小时。然后采用涂片法，制备染色体标本玻片。
应用在进行了减数分裂染色体分析之后，有一些小麦单株需补充其有丝分裂的染色体数据。而此时，小麦植株大多不仅生长在大田，而且已进入生长后期，可制作染色体标本的合适根尖已经很难获得。本实施例就是针对此情况设计和实施的。即使灌浆结束、茎秆有部分刚刚开始变黄的植株，亦可能获得合适的根尖和染色体标本。
权利要求
1.一种麦类染色体标本制作方法，其特征是包括种子浸泡、萌发、低温处理、复温生长、前处理、固定和制片步骤；具体操作30～32℃温水浸泡种子2～5min，然后26±1℃，再浸泡7～15小时；26±1℃，10～14小时进行萌发；再在0～4℃低温处理4～14小时；然后26±1℃进行12～14小时复温生长；选择根长约为1.3～1.7cm或根长是在此基础上以1cm为单位递增的种子，置于预冷到0～4℃的α-溴萘饱和水溶液中，在0～4℃的冰箱中处理11～14小时或22～26小时；然后用3∶1(v/v)甲醇-冰醋酸固定液固定后制片；以上步骤最好在黑暗条件下进行；萌发、低温处理和复温生长的时间在所述时间基础上可以以12小时为一间隔单位递增。
2.根据权利要求1所述的麦类染色体标本制作方法，其特征是本发明方法针对麦类植物和麦类近缘种的染色体标本制作。
3.根据权利要求2所述的麦类染色体标本制作方法，其特征是麦类植物和麦类近缘种包括一粒小麦、二粒小麦、普通小麦、大麦、青稞、黑麦、小黑麦、燕麦、偃麦草、冰草。
4.根据权利要求1所述的麦类染色体标本制作方法，其特征是本方法适当改进或不作改进，也可以应用到其它植物染色体标本的制作。
全文摘要
本发明属于细胞遗传学和细胞生物学领域，涉及一种染色体标本制作方法。本发明针对目前染色体标本的制作中，操作者常常会难以获得足够中期分裂相染色体标本的问题，公开了一种麦类染色体标本制作方法，包括种子浸泡、萌发、低温处理、复温生长、前处理、固定等步骤。本发明方法操作简单，采用该方法，一个初学者也可以获得足够的中期分裂相。
文档编号G01N1/28GK1566917SQ0313533
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月2日 优先权日2003年7月2日
发明者郭骁才 申请人:中国科学院成都生物研究所