专利名称：稳定表达6个hmw-gs的普通小麦培育方法
稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法技术领域
本发明属于植物染色体工程技术领域，特别涉及一种将四倍体野生二粒小麦的功能性Ay型高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)编码基因引入普通小麦，实现全部6个HMW-GS均稳定表达的普通小麦的培育方法。
背景技术：
小麦作为世界主要的大宗粮食作物，贡献了全球总谷物产量的30%左右而成为人类营养素来源的主要作物之一。据估计，到2020年，全球对小麦的需求量将增加40%左右， 因而小麦对人类健康与生存具有举足轻重的作用。
大量研究表明，小麦的营养品质和面粉的加工品质都与种子蛋白的含量和组成密切相关。小麦高分子量谷蛋白亚基(High molecular weight glutenin subunits,HMW-GS) 是小麦的主要贮藏蛋白之一，占小麦蛋白质的10%左右，与小麦面粉的弹性关系密切。业已证明，具有优质高分子量谷蛋白亚基或优质亚基组合的小麦品种具有优良的烘焙品质特性。研究表明，优质面粉所具有的高强度面筋主要在于其所含有的高交联度大聚合体，而麦谷蛋白的半胱氨酸残基是形成高交联度聚合体的决定因子，因而半胱氨酸残基的数量和 /或位置是影响面粉加工品质的直接因素。在普通小麦aestivum, 2n = 6x = 42，染色体组型为AABBDD)基因组中，编码HMW谷蛋白的基因Glu-Al, Glu-BlM Glu-Dl分别位于1A，IB和ID染色体的长臂上，每一个高分子量麦谷蛋白基因位点内存在两个紧密连锁的基因，分别编码一个分子量较大的X型亚基，和一个分子量较小的I型亚基，所以，理论上普通小麦应含有6个HMW-GS亚基。但是，由于存在基因的沉默现象，其中，2办和7尤r常不表达，而脚则总是沉默的，致使Glu-Al位点常常没有HMW-GS而成为Null位点，因此， 普通小麦通常只拥有3-5个高分子量谷蛋白亚基。现已证明，Glu-Al位点有一个亚基表达的比Null位点具有更高的面筋强度。因此，许多具有高产特性的小麦品种缺乏优良的烘焙品质性能。
国内外研究者试图从小麦近缘属物种中寻找活性2^7基因，以改良普通小麦的加工品质特性。截至目前，已发现在小麦的近缘植物苑科夫斯基小麦(K zhukovskyi, 2n=6x=42, AAAAGG)、提莫非维小麦{T. timopheevii, 2n=4x=28, AAGG)、野生二粒小麦 (71. dicoccoides, 2n=4x=28, AABB)和二倍体一粒系的(2n=2x=14, AA)乌拉尔图小麦(71. urartu)，野生一粒小麦(71. Aoeoiicw )和栽培一粒小麦(71.中存在IAy亚基的表达，而且已获得了 12个活性基因的分子克隆。虽然Margeotta et al. (1996) 报道在两个瑞典春小麦品系W 29323和W 3879中检测到表达的IAy亚基，但其活性基因 21*y的扩增片段短于Cheyemme品种中的无活性态等位基因，而且，其表达的Ay基因的来源也不清楚，仅仅是一种推测，认为很可能是某一种野生小麦被用在了育种过程中所引起的。之后，Rogers et al. (1997)报道将二倍体的野生一粒沙达小麦(71· boeoticum ssp. thaoudar)的Glu-ΑΙ位点的IAx和脚基因,通过回交选育近等基因系的方法导入六倍体春小麦面包加工品种Sicco 中。其方法是将居群为CL1020006和G3152的野生一粒沙达小麦{T. b. thaoudar)分别与硬粒小麦(T1. durum, 2n=4x=28, AABB)品种 Cando 和中国春小麦杂交后再与Sicco回交5次，结果在对面筋强度或/和面筋粘性及和面的稳定性上稍微有所提高的同时，对籽粒蛋白质含量和籽粒产量均没有正效应。仅有的这两例报道所涉及的普通小麦都属于春小麦，而且缺乏其相应基因在普通小麦遗传背景下的分子结构特点分析。2008年，我国的马建华等用转基因工程方法将乌拉尔图小麦(7 rarte)的基因转入普通小麦兰考4号，但是，仅仅在Ttl代的I粒种子中检测到IAy亚基，而且未见其稳定表达的报道。对于野生二粒小麦(7 dicoccoides^ Glu-Al位点y-型亚基编码基因的利用，目前仅见Ciaffi et al. (1991)将其Ay亚基转入到四倍体的硬粒小麦(7有效地提高了硬粒小麦面筋强度的报道。野生二粒小麦(AABB)是上联原始的二倍体一粒系小麦(AA)，下联进化的六倍体普通小麦(AABBDD)最原始的四倍体桥梁植物，比二倍体小麦更易与六倍体普通小麦有性杂交实现遗传重组。然而，迄今未见有关野生二粒小麦Glu-Al 位点y型亚基编码基因向栽培面积更广阔，生产量和消费量更大的六倍体普通小麦引入的报道。发明内容
本发明的目的在于为提高小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)，提供一种通过野生二粒小麦与普通小麦远缘杂交的染色体工程技术，获得全部6个HMW-GS均稳定表达的普通小麦培育方法。该方法能有效增加普通小麦基因组中的功能性脚基因，实现在普通小麦基因组中，Glu-Al、Glu-Bl、Glu-Dl位点的3个x型和3个y型全部6个HMW-GS基因的表达，从而培育出具有6个高分子量谷蛋白亚基新组合的新型普通小麦。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
—种稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法,其特征在于以普通小麦为母本, 野生二粒小麦为父本，将拥有4个HMW-GS的野生二粒小麦的花粉，授予六倍体的普通小麦， 通过种间远缘杂交、多代自交及鉴定，选育出稳定表达6个HMW-GS的普通小麦。
所述母本选自高产但加工品质差的普通小麦，染色体组型为AABBDD。如小麦推广品种川农16，为春性冬小麦，其蛋白含量较低，仅有12. 3%，只具有4个高分子量谷蛋白亚基，其IAy亚基编码基因处于沉默态，具有序列表中SEQ ID NO. 1_3所述的碱基、核苷酸及氨基酸序列。
所述父本选自Glu-Al和Glu-Bl位点均表达的含有4个高分子量谷蛋白亚基的野生二粒小麦，染色体组型为AABB，其活性态的IAy亚基基因具有序列表中SEQ ID N0.4-5所述的碱基、核苷酸及氨基酸序列。
所述杂交双亲的种植，是秋冬季按株距10cm，行距30cm，行长2m进行双行田间播种。
所述双亲的杂交，是抽穗后对母本穗进行人工去雄，套上硫酸纸袋以防飞花，授以野生二粒小麦花粉后继续套袋直至成熟。
所述多代自交及鉴定包括如下方法步骤A、将经杂交产生的种子进行 SDS-PAGE分析，并对其根尖体细胞染色体数目进行检测， 选择具有双亲HMW-GS条带的、染色体数目为35条的杂种F1代植株。
B、将经步骤A选取出的匕代植株在抽穗后套上硫酸纸袋自交，收取F2代种子，按步骤A所述方法进行SDS-PAGE分析和染色体数目检测，选取35 < 2n < 42和HMW-GS为 6条的籽粒继续种植套袋自交得F3代，再按步骤A所述方法对F3代籽粒进行检测和选取。
C、对步骤B获选的F3代种子进行发芽移栽，并自交，连续自交6代后获得F8代，且每代均选取株叶型、抽穗期、开花期、成熟期趋向母本普通小麦的单株。
D、随机抽取F8代单株，再从各单株收获籽粒中随机选取8粒，按步骤A所述的 SDS-PAGE方法进行HMW-GS检测；选取具有6个HMW-GS的籽粒进行发苗移栽获得F9代植株，再自交，收获F9代植株上产生的Fltl代籽粒，再随机选取8粒按同样方法进行SDS-PAGE 分析，对HMW谷蛋白亚基进行检测；然后再对HMW谷蛋白亚基谱带数均为6条，且电泳迁移率一致，并含有父本野生二粒小麦Glu-Al和Glu-Bl位点y-型亚基的上述8粒籽粒，进一步按步骤A所述方法进行染色体数目均为2n=42的根尖染色体数目检测。
E、将步骤D选取的杂种Fltl代种子，同时与母本及父本的种子进行室内发芽，剪取幼嫩叶片提取基因组DNA，再对HMW-GS编码基因进行PCR扩增，选取脚的条带进行转化、 阳性检测、测序和序列比较分析。
F、将步骤E获得的Fltl代种子与母本及父本的核苷酸及其氨基酸序列进行比较分析，确认杂种育成小麦的Glu-Al位点活性y型亚基编码基因与父本野生二粒小麦的Glu-Al 位点活性I型亚基编码基因序列高度一致，均具有1830bp的核苷酸长度，都没有缺失/插入区段，都能编码608个氨基酸残基，且没有提前终止密码子，均属于活性态的基因；而母本普通小麦等位基因的核苷酸序列短于父本和育成小麦，为1791bp，而且其DNA分子结构上存在着3个区段的缺失，其中间重复区还存在I个提前终止密码子，处于沉默态，由此而确定野生二粒小麦Glu-Al位点的活性y型亚基编码基因已真实导入普通小麦基因组。
G、对步骤F鉴定的杂种后代中的活性等位基因进行染色体工程遗传重组特性分析，确认育成普通小麦所拥有的活性基因的DNA序列，在保持父本98. 9%的脚基因核苷酸的同时，还存在21个单核苷酸的变异，其中14个位点为突变，7个位点为整合了母本普通小麦的核苷酸。
H、对经步骤G确定的育成普通小麦的7^7基因的编码亚基活性进行异源表达分析，以证明育成普通小麦所拥有的IAy基因与父本野生二粒小麦的IAy基因一样具有编码 IAy亚基的功能。
1、将经步骤D-H鉴定后获选的杂种种子的具有种胚的半粒进行培养皿内发芽移栽，再连续自交2代获得F11和F12代；继续对F11和F12代的籽粒进行HMW-GS检测，以进一步证明其拥有的6个HMW-GS能在普通小麦遗传背景中稳定传递。
本发明的有益技术效果主要表现在1、通过本发明方法培育获得的具有6个HMW-GS的新型普通小麦，不仅具有与母本相似的株叶型，而且还具有母本所没有的紫色茎杆性状，及较母本更优的籽粒粒积性状、产量性状和优异的品质特性，对比结果如表I所示。
2、通过本发明方法，育成了含有IAy亚基的普通小麦，其拥有的活性办基因的DNA 序列，既保持了父本IAy基因高达98. 9%的核 苷酸序列，又存在14个位点的突变，还整合了母本IAy核苷酸序列的7个位点，而成为育成小麦特有的IAy亚基编码基因。
3、通过连续对杂交种Fltl、F11和F12代的籽粒进行HMW-GS检测，证明了其拥有的脚基因能够代代稳定传递与表达。
表I 育成小麦与母本在产量及品质特性方面的比较
权利要求
1.一种稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法,其特征在于以普通小麦为母本， 野生二粒小麦为父本，将拥有4个HMW-GS的野生二粒小麦的花粉，授予六倍体的普通小麦， 通过种间远缘杂交、多代自交及鉴定，选育出稳定表达6个HMW-GS的普通小麦。
2.根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法,其特征在于所述母本选自高产但加工品质差的普通小麦，染色体组型为AABBDD，具有4个高分子量谷蛋白亚基，其IAy亚基编码基因处于沉默态，具有序列表中SEQ ID NO. 1_3所述的碱基、核苷酸及氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法,其特征在于所述父本选自Glu-Al和Glu-Bl位点均表达的含有4个高分子量谷蛋白亚基的野生二粒小麦，染色体组型为AABB，其活性态的IAy亚基基因具有序列表中SEQ ID NO. 4-5所述的碱基、核苷酸及氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法,其特征在于所述双亲的杂交，是抽穗后对母本穗进行人工去雄，套上硫酸纸袋以防飞花，授以野生二粒小麦花粉后继续套袋直至成熟。
5.根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于所述多代自交及鉴定包括如下方法步骤A、将经杂交产生的种子进行SDS-PAGE分析，并对其根尖体细胞染色体数目进行检测， 选择具有双亲HMW-GS条带的、染色体数目为35条的杂种F1代植株；B、将经步骤A选取出的F1代植株在抽穗后套上硫酸纸袋自交，收取F2代种子，按步骤 A所述方法进行SDS-PAGE分析和染色体数目检测，选取35 < 2n < 42和HMW-GS为6条的籽粒继续种植套袋自交得F3代，再按步骤A所述方法对F3代籽粒进行检测和选取；C、对步骤B获选的F3代种子进行发芽移栽，并自交，连续自交6代后获得F8代，且每代均选取株叶型、抽穗期、开花期、成熟期趋向母本普通小麦的单株；D、随机抽取F8R单株，再从各单株收获籽粒中随机选取8粒，按步骤A所述的 SDS-PAGE方法进行HMW-GS检测；选取具有6个HMW-GS的籽粒进行发苗移栽获得F9代植株，再自交，收获F9代植株上产生的Fltl代籽粒，再随机选取8粒按同样方法进行SDS-PAGE 分析，对HMW谷蛋白亚基进行检测；然后再对HMW谷蛋白亚基谱带数均为6条，且电泳迁移率一致，并含有父本野生二粒小麦Glu-Al和Glu-Bl位点y-型亚基的上述8粒籽粒，进一步按步骤A所述方法进行染色体数目均为2n=42的根尖染色体数目检测；E、将步骤D选取的杂种Fltl代种子，同时与母本及父本的种子进行室内发芽，剪取幼嫩叶片提取基因组DNA，然后对HMW-GS编码基因进行PCR扩增，选取脚的条带进行转化、阳性检测、测序和序列比较分析；F、将步骤E获得的Fltl代种子与母本及父本的核苷酸及其氨基酸序列进行比较分析，确认杂种育成小麦的Glu-Al位点活性y型亚基编码基因与父本野生二粒小麦的Glu-Al位点活性I型亚基编码基因序列高度一致，均具有1830bp的核苷酸长度，都没有缺失/插入区段，都能编码608个氨基酸残基，且没有提前终止密码子，均属于活性态的基因；而母本普通小麦等位基因的核苷酸序列短于父本和育成小麦，为1791bp，而且其DNA分子结构上存在着3个区段的缺失，其中间重复区还存在I个提前终止密码子，处于沉默态，由此而确定野生二粒小麦Glu-Al位点的活性y型亚基编码基因已真实导入普通小麦基因组；G、对步骤F鉴定的杂种后代中的活性等位基因进行染色体工程遗传重组特性分析， 确认育成普通小麦所拥有的活性基因的DNA序列，在保持父本98. 9%的IAy基因核苷酸的同时，还存在21个单核苷酸的变异，其中14个位点为突变，7个位点为整合了母本普通小麦的核苷酸；H、对经步骤G确定的 育成普通小麦的IAy基因的编码亚基活性进行异源表达分析，以证明育成普通小麦所拥有的以_7基因与父本野生二粒小麦的以_7基因一样具有编码IAy亚基的功能；1、将经步骤D-H鉴定后获选的杂种种子的具有种胚的半粒进行培养皿内发芽移栽，再连续自交2代获得F11和F12代；继续对F11和F12代的籽粒按步骤A的SDS-PAGE方法进行 HMW-GS检测，以进一步证明其拥有的6个HMW-GS能在普通小麦遗传背景中稳定传递。
全文摘要
本发明涉及一种稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，属于植物染色体工程技术领域。该方法是以普通小麦为母本，野生二粒小麦为父本，将拥有4个HMW-GS的野生二粒小麦的花粉，授予六倍体的普通小麦，通过种间远缘杂交、多代自交及鉴定，选育出稳定表达6个HMW-GS的普通小麦。通过本发明方法培育获得的具有6个HMW-GS的新型普通小麦，不仅具有与母本相似的株叶型，而且还具有母本所没有的紫色茎秆性状，及较母本更优的籽粒粒积性状、产量性状和优异的品质特性，且通过连续对杂交种F10、F11和F12代的籽粒进行HMW-GS检测，证明了其拥有的1Ay基因能够代代稳定传递与表达。
文档编号A01H1/02GK103039357SQ20131002273
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者伍碧华, 王真真, 胡喜贵, 胡继良, 郭孝辉, 王栋, 郑有良, 刘登才, 蒲至恩, 陈国跃, 代寿芬 申请人:四川农业大学