专利名称：小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法
技术领域：
本发明涉及一种外源染色体的切割鉴定方法，具体的说是一种小麦-中间偃麦草异代换系中外源染色体的微分离方法，属于分子细胞遗传学领域。
背景技术：
染色体微切害I]、微分离与微克隆(chromosome microdissection and microcloning)技术是在1981年由Scalenghe创立的一项分子细胞遗传学新技术。该技术首先对果蝇染色体进行了切割，成功获得了 80个克隆，随后用于鼠和人类染色体的切割。 随着PCR技术的发展，微切割和微克隆技术得到了较大发展，利用染色体微切割和微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，该技术在植物染色体文库的构建、特异探针筛选、抗性基因的克隆以及遗传与进化研究上得到了较为广泛应用，但是，相比较而言，植物在这方面开展的研究仍然滞后于动物和人类。目前，植物染色体显微切割技术主要存在以下几个方面的困难
(I)植物细胞壁的存在、同步化的困难，阻碍了良好分散染色体标本的制备，影响了切割效率。(2)植物基因组倍性多样，染色体结构变异大，基因排列顺序不够保守；植物染色体DNA含量高、蛋白质含量低，大多数染色体上不显示G、R或Q带带纹，从而影响DNA序列， 通行的C带，对染色体DNA破坏太大，不利于构建完整的DNA文库；而有些植物染色体大小差异不明显，带纹相似，难于精确识别染色体及其细微结构，加大了分析的复杂性。(3)植物染色体DNA高度重复序列多，如中间偃麦草、大麦、黑麦和燕麦核基因组有约80%的重复序列，麦类作物DNA含量高，如六倍体燕麦DNA含量为13. 2—14. 3pg，中间偃麦草C值为1.7X109bp，平均每条染色体0.8X109bp，相当于人类基因组的四分之一若每个插入片段为lkb，每条染色体特异性DNA文库包含8 X IO5以上克隆，筛库工作量巨大。
发明内容
本发明针对上述问题的不足，提供基于SLy CELLCUT系统的小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法，标本的制备方法简单，其鉴定方法简单，分析简单，便于染色体的切割与回收，为后续切割染色体的鉴定与分析奠定基础。本发明为解决上述问题所采用的技术方案是小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，包括以下步骤
步骤一、小麦根尖细胞染色体标本的制备
O按重量份数比取0. 5份的中国春小麦种子和0. 5份的山农小麦种子，混合均匀，后将混合后的小麦种子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麦种子，在温度为I一4°C条件下，放置24小时，后在温度为25°C条件下培养使小麦种子发芽，继续培养至新生小麦根长为I. 5—2. Ocm时，取0. 5—0. 8cm的根尖部位，备用；
2)取步骤I)中的小麦根尖放在O°C的冰水混合物中，放置24小时后取出小麦根尖放于2—3份的温度为1—4°C的卡诺氏液中，放置24小时，取出，将小麦根尖放于质量浓度为 70%的酒精中，备用；
3)试剂的配制
①混合酶液按重量份数比取I份质量浓度为2%的纤维素酶和I份质量浓度为2%的果胶酶，混合均匀，制得混合酶液；
②石炭酸品红溶液取3g的碱性品红和IOOml质量浓度为70%的乙醇，混合均匀，形成原液a，备用；
取IOml原液a和90ml质量浓度为5%的石炭酸水溶液，混合均匀，形成原液b，备用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml质量浓度为37%的福尔马林，混合均匀，形成原液c，备用；
取10 — 20ml的原液c、80— 90ml质量浓度为45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均匀， 制得石炭酸品红溶液，备用；
4)将步骤2)中的小麦根尖从酒精中取出，将Ig的小麦根尖浸泡在IOml的蒸馏水中， 放置10分钟，过滤，得到浸泡后的小麦根尖，将浸泡后的小麦根尖放在电子显微镜的载物台上，进行初步镜检，得到有丝分裂中期的根尖细胞染色体，后将有丝分裂中期的根尖细胞染色体加到Iml步骤3)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I一I. 5小时，形成酶解物I，利用无菌蒸馏水对酶解物I冲洗10分钟，在O. 5ml的离心管a内加入50 μ g 的酶解物I和50μ I步骤3)中得到的石炭酸品红溶液，混合均匀，形成混合物，将混合物涂在载玻片上，在含有混合物的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使混合物附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成混合物痕迹，利用质量浓度为75%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为75%的酒精滴加在含有混合物痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干，然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第二次细胞内脱水，制得小麦根尖细胞染色体标本；
步骤二、花粉母细胞染色体标本的制备
1)取处于减数分裂中期I的小麦-中间偃麦草异代换系山农0095与小麦品种烟农15 的杂种F1代花粉母细胞，备用；
2)按重量份数比取I份步骤I)中得到的花粉母细胞和2—3份的卡诺氏液，将花粉母细胞放于I一4°C的卡诺氏液中，放置3 — 24小时，取出，将花粉母细胞放在质量浓度为70% 的酒精中，备用；
3)将步骤2)中的花粉母细胞从质量浓度为70%的酒精中取出，将Ig的花粉母细胞浸泡在IOml的蒸馏水中，放置10分钟，过滤，得到浸泡后的花粉母细胞，将浸泡后的花粉母细胞加到Iml步骤一)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I小时，形成酶解物 II，利用无菌蒸馏水对酶解物II冲洗10分钟，将酶解物II涂在载玻片上，在含有酶解物II 的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使酶解物II附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成酶解物II痕迹，利用质量浓度为70%的酒精对分离膜上的酶解物II痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为70%的酒精滴加在含有酶解物II痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干， 然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的酶解物II痕迹进行第二次细胞内脱水，制得花粉母细胞染色体标本，备用；
步骤三、小麦根尖细胞染色体的显微分离
在步骤一中制得的小麦根尖细胞染色体标本的载玻片上滴加20 μ I无水乙醇，后在载玻片上覆盖盖玻片，将载玻片置于SLy CELIXUT显微切割系统的载物台上，在4Χ物镜下找到目标染色体，然后转换至40Χ物镜下，对染色体的单价体进行切割，收集切割后的单根尖细胞染色体存放在I. 5ml离心管a中，备用；
步骤四、花粉母细胞染色体的显微切割
依据步骤三的操作方法对花粉母细胞染色体的显微切割，将切割收集后的花粉母细胞染色体存放在I. 5ml离心管b中，备用；
步骤五、对切割后的小麦根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体分别进行DOP-PCR扩增
1)试剂配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K处理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶缓冲液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均匀，形成质量浓度为600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶缓冲液稀释成质量浓度为20ng/l·! I的蛋白酶K处理液，备用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麦根尖细胞染色体的预处理
将步骤二中得到的小麦根尖染色体放在O. 5ml离心管b内，后在含有小麦根尖染色体的O. 5ml离心管b内加入20 μ I步骤I)中得到的质量浓度为20ng/μ I的蛋白酶K处理液， 混合均匀，形成混合液，将含有混合液的O. 5ml离心管b置于37°C条件下，放置4小时，然后将O. 5ml离心管b放于离心机内，以转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到上层液体，将上层液体放在70°C条件下，灭菌20分钟，取出，得到处理后的小麦根尖目标染色体，备用；
3)花粉母细胞染色体的预处理
依据步骤2)中对小麦根尖细胞染色体的预处理方法对花粉母细胞染色体进行预处理， 得到花粉母细胞目标染色体，备用；
4)小麦根尖目标染色体的DOP-PCR扩增
第一次PCR扩增
PCR反应体系I :在0.5ml离心管c中加入24. 6 μ I的处理后小麦根尖目标染色体、 4 μ I的10XPCR缓冲液，3 μ I质量浓度为25mmol/L的Mg2+、4 μ I浓度为25mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、O. 4μ I质量浓度为5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去离子水,形成反应体系I ,备用；
PCR程序将反应体系I放入PCR仪内，94°C预变性10分钟，94°C变性I. 5分钟、50°C退火I. 5分钟、72°C延伸3分钟，PCR扩增共5个循环，然后94°C变性I. 5分钟、57°C退火I. 5 分钟、72°C延伸I. 5分钟，PCR扩增共25个循环，72°C再次延伸10分钟，形成PCR产物I， 备用;
第二次PCR扩增
将PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为PCR产物I，按照相同方法配制成PCR体系II，后依据第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行第二次PCR扩增，得到PCR产物II，备用；
5)花粉母细胞目标染色体的DOP-PCR扩增第一次PCR扩增
将步骤4)中PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为处理后的花粉母细胞目标染色体，按照相同方法配制成PCR反应体系III，后依据步骤4)中第一次 PCR扩增中PCR程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增，得到PCR产物 III，备用；
第二次PCR扩增
将PCR反应体系III配制过程中的处理后的花粉母细胞目标染色体替换为PCR产物III， 按照相同方法配制成PCR体系IV，后依据花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增中PCR 程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第二次PCR扩增，得到PCR产物IV，备用；
步骤六、利用聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳检测PCR产物II和PCR产物II，在凝胶成像系统中确认PCR产物II中含有切割后的普通小麦染色体的目的基因，在凝胶成像系统中确认 PCR产物IV中含有切割后的中间偃麦草外源染色体的目的基因。露白就是种子在合适的温度、水分条件下，发生吸水膨胀，胚根伸长，露出白的芽，叫露白，属于种子发芽过程中的一个生理现象。有益效果
本发明的小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法，其方法简单，易于操作，便于广泛应用于小麦遗传背景中其他外源染色体的分离，并且实用性强。本发明的小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，采用小麦-中间偃麦草异代换系山农0095与其亲本普通小麦烟农15的杂种F1代花粉母细胞为材料，利用“原位”移膜法制备含有外源染色体的标本，其制片简单、快速、方便。本发明的小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，根据细胞遗传学理论，能够快速、准确识别染色体标本中的外源染色体以及具有其他明显细胞学特征的目标染色体。本发明的小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，采用适于单条染色体为目标染色体进行酶切，以便于微克隆的筛选和鉴定研究。本发明的小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，在对SLy CELLCUT显微切割系统进行相关参数优化的基础上，提出了小麦染色体切割所需的染色体标本制备、目标染色体的微分离、微分离染色体的鉴定等技术，为其他作物应用该系统鉴定了实践基础，大大拓宽了该系统的使用范围和利用效率，提高了相对经济效益。
图I为小麦根尖染色体标本图谱；
图2为花粉母细胞染色体标本图谱；
图3为PCR产物II和PCR产物IV的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；
图中标号点样孔1、13 :1&^1 ^，点样孔2、10 :中国春单细胞染色体，点样孔3、9 :中国春的2条染色体，点样孔4、8 :中国春的I条染色体，点样孔5 :中间偃麦草外源染色体I条染色体，点样孔6 :中国春的3条染色体，点样孔7 :中间偃麦草基因组DNA，点样孔11 :对照 DNA溶液、点样孔12 :去离子水。
具体实施例方式小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法，包括以下步骤
步骤一、小麦根尖细胞染色体标本的制备
O按重量份数比取O. 5份的中国春小麦种子和O. 5份的山农小麦种子，混合均匀，后将混合后的小麦种子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麦种子，在温度为I一4°C条件下，放置24小时，后在温度为25°C条件下培养使小麦种子发芽，继续培养至新生小麦根长为I. 5 — 2. Ocm时，取O. 5—0. 8cm的根尖部位，备用；
2)取步骤I)中的小麦根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小时后取出小麦根尖放于2—3份的温度为1—4°C的卡诺氏液中，放置24小时，取出，将小麦根尖放于质量浓度为 70%的酒精中，备用；
3)试剂的配制
①混合酶液按重量份数比取I份质量浓度为2%的纤维素酶和I份质量浓度为2%的果胶酶，混合均匀，制得混合酶液；
②石炭酸品红溶液取3g的碱性品红和IOOml质量浓度为70%的乙醇，混合均匀，形成原液a，备用；
取IOml原液a和90ml质量浓度为5%的石炭酸水溶液，混合均匀，形成原液b，备用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml质量浓度为37%的福尔马林，混合均匀，形成原液c，备用；
取10 — 20ml的原液c、80— 90ml质量浓度为45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均匀， 制得石炭酸品红溶液，备用；
4)将步骤2)中的小麦根尖从酒精中取出，将Ig的小麦根尖浸泡在IOml的蒸馏水中， 放置10分钟，过滤，得到浸泡后的小麦根尖，将浸泡后的小麦根尖放在电子显微镜的载物台上，进行初步镜检，得到有丝分裂中期的根尖细胞染色体，后将有丝分裂中期的根尖细胞染色体加到Iml步骤3)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I一I. 5小时，形成酶解物I，利用无菌蒸馏水对酶解物I冲洗10分钟，在O. 5ml的离心管a内加入50 μ g 的酶解物I和50 μ I步骤3)中得到的石炭酸品红溶液，混合均匀，形成混合物，将混合物涂在载玻片上，在含有混合物的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使混合物附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成混合物痕迹，利用质量浓度为75%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为75%的酒精滴加在含有混合物痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干，然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第二次细胞内脱水，制得小麦根尖细胞染色体标本；
步骤二、花粉母细胞染色体标本的制备
1)取处于减数分裂中期I的小麦-中间偃麦草异代换系山农0095与小麦品种烟农15 的杂种F1代花粉母细胞，备用；
2)按重量份数比取I份步骤I)中得到的花粉母细胞和2—3份的卡诺氏液，将花粉母细胞放于I一4°C的卡诺氏液中，放置3 — 24小时，取出，将花粉母细胞放在质量浓度为70% 的酒精中，备用；
3)将步骤2)中的花粉母细胞从质量浓度为70%的酒精中取出，将Ig的花粉母细胞浸泡在IOml的蒸馏水中，放置10分钟，过滤，得到浸泡后的花粉母细胞，将浸泡后的花粉母细胞加到Iml步骤一)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I小时，形成酶解物 II，利用无菌蒸馏水对酶解物II冲洗10分钟，将酶解物II涂在载玻片上，在含有酶解物II 的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使酶解物II附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成酶解物II痕迹，利用质量浓度为70%的酒精对分离膜上的酶解物II痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为70%的酒精滴加在含有酶解物II痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干， 然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的酶解物II 痕迹进行第二次细胞内脱水，制得花粉母细胞染色体标本，备用；
步骤三、小麦根尖细胞染色体的显微分离
在步骤一中制得的小麦根尖细胞染色体标本的载玻片上滴加20μ I无水乙醇，后在载玻片上覆盖盖玻片，将载玻片置于SL μ CELIXUT显微切割系统的载物台上，在4Χ物镜下找到目标染色体，然后转换至40Χ物镜下，对染色体的单价体进行切割，收集切割后的单根尖细胞染色体存放在I. 5ml离心管a中，备用；
步骤四、花粉母细胞染色体的显微切割
依据步骤三的操作方法对花粉母细胞染色体的显微切割，将切割收集后的花粉母细胞染色体存放在I. 5ml离心管b中，备用；
步骤五、对切割后的小麦根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体分别进行DOP-PCR扩增
1)试剂配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K处理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶缓冲液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均匀，形成质量浓度为600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶缓冲液稀释成质量浓度为20ng/l·! I的蛋白酶K处理液，备用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麦根尖细胞染色体的预处理
将步骤二中得到的小麦根尖染色体放在O. 5ml离心管b内，后在含有小麦根尖染色体的O. 5ml离心管b内加入20 μ I步骤I)中得到的质量浓度为20ng/μ I的蛋白酶K处理液， 混合均匀，形成混合液，将含有混合液的O. 5ml离心管b置于37°C条件下，放置4小时，然后将O. 5ml离心管b放于离心机内，以转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到上层液体，将上层液体放在70°C条件下，灭菌20分钟，取出，得到处理后的小麦根尖目标染色体，备用；
3)花粉母细胞染色体的预处理
依据步骤2)中对小麦根尖细胞染色体的预处理方法对花粉母细胞染色体进行预处理， 得到花粉母细胞目标染色体，备用；
4)小麦根尖目标染色体的DOP-PCR扩增
第一次PCR扩增
PCR反应体系I :在0.5ml离心管c中加入24. 6 μ I的处理后小麦根尖目标染色体、
4μ I的10XPCR缓冲液，3 μ I质量浓度为25mmol/L的Mg2+、4 μ I浓度为25mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、O. 4μ I质量浓度为5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去离子水,形成反应体系I ,备用；
PCR程序将反应体系I放入PCR仪内，94°C预变性10分钟，94°C变性I. 5分钟、50°C退火I. 5分钟、72°C延伸3分钟，PCR扩增共5个循环，然后94°C变性I. 5分钟、57°C退火I. 5 分钟、72°C延伸I. 5分钟，PCR扩增共25个循环，72°C再次延伸10分钟，形成PCR产物I， 备用;
第二次PCR扩增
将PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为PCR产物I，按照相同方法配制成PCR体系II，后依据第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行第二次PCR扩增，得到PCR产物II，备用；
5)花粉母细胞目标染色体的DOP-PCR扩增第一次PCR扩增
将步骤4)中PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为处理后的花粉母细胞目标染色体，按照相同方法配制成PCR反应体系III，后依据步骤4)中第一次 PCR扩增中PCR程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增，得到PCR产物 III，备用；
第二次PCR扩增
将PCR反应体系III配制过程中的处理后的花粉母细胞目标染色体替换为PCR产物III， 按照相同方法配制成PCR体系IV，后依据花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增中PCR 程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第二次PCR扩增，得到PCR产物IV，备用；
步骤六、利用聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳检测PCR产物II和PCR产物II，在凝胶成像系统中确认PCR产物II中含有切割后的普通小麦染色体的目的基因，在凝胶成像系统中确认 PCR产物IV中含有切割后的中间偃麦草外源染色体的目的基因。露白就是种子在合适的温度、水分条件下，发生吸水膨胀，胚根伸长，露出白的芽，叫露白，属于种子发芽过程中的一个生理现象。实施例I
小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，包括以下步骤
步骤一、SL μ CELIXUT系统参数的设置
I)普通光源照明强度将普通光源的照明强度设置为120V/100W。2)紫外激光参数设置
在普通光源为120V/100W的照明强度下，将紫外激光的参数分别设置为100Χ物镜、 激光速度为10，聚焦为49、激光能量为60，40X物镜、激光速度为51，聚焦为50、激光能量为75，20 X物镜、激光速度为59、聚焦为74、激光能量为66，IOX物镜、激光速度为49，聚焦为72、激光能量为79，4Χ物镜、激光速度为82，聚焦为79、激光能量为70 ；
3)切割样本的选择
使用软件中所列的圆形工具进行绘图，完成对样本的切割，避免激光在切割过程中由于热效应造成对样本的损伤；
4)单步收集
在操作CellCut 显微切割系统时，在4Χ物镜、IOX物镜下进行目标染色体的微切
割;
步骤二、小麦根尖细胞染色体标本的制备1)按重量份数比取O.5份的中国春小麦种子和O. 5份的山农小麦种子，混合均匀，后将混合后的小麦种子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麦种子，在温度为1°C条件下，放置 24小时，后在温度为25°C条件下培养使小麦种子发芽，继续培养至新生小麦根长为I. 5cm 时，取O. 5cm的根尖部位，备用；
2)取步骤I)中的小麦根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小时后取出小麦根尖放于2份的温度为1°C的卡诺氏液中，放置24小时,取出，将小麦根尖放于质量浓度为70%的酒精中，备用；
3)试剂的配制
①混合酶液按重量份数比取I份质量浓度为2%的纤维素酶和I份质量浓度为2%的果胶酶，混合均匀，制得混合酶液；
②石炭酸品红溶液取3g的碱性品红和IOOml质量浓度为70%的乙醇，混合均匀，形成原液a，备用；
取IOml原液a和90ml质量浓度为5%的石炭酸水溶液，混合均匀，形成原液b，备用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml质量浓度为37%的福尔马林，混合均匀，形成原液c，备用；
取IOml的原液c、90ml质量浓度为45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均匀，制得石炭 Ife品红溶液，备用；
4)将步骤2)中的小麦根尖从酒精中取出，将Ig的小麦根尖浸泡在IOml的蒸馏水中， 放置10分钟，过滤，得到浸泡后的小麦根尖，将浸泡后的小麦根尖放在电子显微镜的载物台上，进行初步镜检，得到有丝分裂中期的根尖细胞染色体，后将有丝分裂中期的根尖细胞染色体加到Iml步骤3)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I小时，形成酶解物I，利用无菌蒸馏水对酶解物I冲洗10分钟，在O. 5ml的离心管a内加入50 μ g的酶解物I和50μ I步骤3)中得到的石炭酸品红溶液，混合均匀，形成混合物，将混合物涂在载玻片上，在含有混合物的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使混合物附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成混合物痕迹，利用质量浓度为75%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为75%的酒精滴加在含有混合物痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗 I分钟，晾干，然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第二次细胞内脱水，制得小麦根尖细胞染色体标本；
步骤三、花粉母细胞染色体标本的制备
1)取处于减数分裂中期I的小麦-中间偃麦草异代换系山农0095与小麦品种烟农15 的杂种F1代花粉母细胞，备用；
2)按重量份数比取I份步骤I)中得到的花粉母细胞和2份的卡诺氏液，将花粉母细胞放于1°C的卡诺氏液中，放置3小时，取出，将花粉母细胞放在质量浓度为70%的酒精中，备用；
3)将步骤2)中的花粉母细胞从质量浓度为70%的酒精中取出，将Ig的花粉母细胞浸泡在IOml的蒸馏水中，放置10分钟，过滤，得到浸泡后的花粉母细胞，将浸泡后的花粉母细胞加到Iml步骤一)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I小时，形成酶解物
II，利用无菌蒸馏水对酶解物II冲洗10分钟，将酶解物II涂在载玻片上，在含有酶解物II的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使酶解物II附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成酶解物II痕迹，利用质量浓度为70%的酒精对分离膜上的酶解物II痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为70%的酒精滴加在含有酶解物II痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干， 然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的酶解物II 痕迹进行第二次细胞内脱水，制得花粉母细胞染色体标本，备用；
步骤四、小麦根尖细胞染色体的显微分离
在步骤二中制得的小麦根尖细胞染色体标本的载玻片上滴加20 μ I无水乙醇，后在载玻片上覆盖盖玻片，将载玻片置于SL μ CELIXUT显微切割系统的载物台上，在4Χ物镜下找到目标染色体，然后转换至40X物镜下，对染色体的单价体进行切割，收集切割后的单根尖细胞染色体存放在I. 5ml离心管a中，备用；
步骤五、花粉母细胞染色体的显微切割
依据步骤四的操作方法对花粉母细胞染色体的显微切割，将切割收集后的花粉母细胞染色体存放在I. 5ml离心管b中，备用；
步骤六、对切割后的小麦根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体分别进行DOP-PCR扩增
1)试剂配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K处理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶缓冲液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均匀，形成质量浓度为600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶缓冲液稀释成质量浓度为20ng/l·! I的蛋白酶K处理液，备用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麦根尖细胞染色体的预处理
将步骤二中得到的小麦根尖染色体放在O. 5ml离心管b内，后在含有小麦根尖染色体的O. 5ml离心管b内加入20 μ I步骤I)中得到的质量浓度为20ng/μ I的蛋白酶K处理液，混合均匀，形成混合液I，将含有混合液I的O. 5ml离心管b置于37°C条件下，放置4 小时，然后将O. 5ml离心管b放于离心机内，以转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到上层液体，将上层液体放在70°C条件下，灭菌20分钟，取出，得到处理后的小麦根尖目标染色体，备用；
3)花粉母细胞染色体的预处理
依据步骤2)中对小麦根尖细胞染色体的预处理方法对花粉母细胞染色体进行预处理， 得到花粉母细胞目标染色体，备用；
4)小麦根尖目标染色体的DOP-PCR扩增
第一次PCR扩增
PCR反应体系I :在0.5ml离心管c中加入24. 6 μ I的处理后小麦根尖目标染色体、
4μ I的10XPCR缓冲液，3 μ I质量浓度为25mmol/L的Mg2+、4 μ I浓度为25mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、O. 4μ I质量浓度为5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去离子水,形成反应体系I ,备用；
PCR程序将反应体系I放入PCR仪内，94°C预变性10分钟，94°C变性I. 5分钟、50°C退火I. 5分钟、72°C延伸3分钟，PCR扩增共5个循环，然后94°C变性I. 5分钟、57°C退火I. 5 分钟、72°C延伸I. 5分钟，PCR扩增共25个循环，72°C再次延伸10分钟，形成PCR产物I，备用;
第二次PCR扩增
将PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为PCR产物I，按照相同方法配制成PCR体系II，后依据第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行第二次PCR扩增，得到PCR产物II，备用；
5)花粉母细胞目标染色体的DOP-PCR扩增第一次PCR扩增
将步骤4)中PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为处理后的花粉母细胞目标染色体，按照相同方法配制成PCR反应体系III，后依据步骤4)中第一次 PCR扩增中PCR程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增，得到PCR产物 III，备用；
第二次PCR扩增
将PCR反应体系III配制过程中的处理后的花粉母细胞目标染色体替换为PCR产物III， 按照相同方法配制成PCR体系IV，后依据花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增中PCR 程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第二次PCR扩增，得到PCR产物IV，备用；
6)将处理后小麦根尖目标染色体分别替换为无菌去离子水、中国春基因组DNA和中间偃麦草基因组DNA，后依据步骤4)的方法对无菌去离子水、中国春基因组DNA、中间偃麦草基因组DNA进行DOP-PCR扩增，得到无菌去离子水扩增产物、中国春基因组DNA扩增产物和中间偃麦草基因组DNA扩增产物，将中国春基因组DNA扩增产物和中间偃麦草基因组DNA 扩增产物作为阳性对照，无菌去离子水扩增产物作为阴性对照；
步骤七、利用丙稀酰胺凝胶电泳对PCR产物II和PCR产物IV进行检测 O电泳试剂的配制取39g的丙稀酰胺、Ig的甲叉双丙稀酰胺和IOOmL的水，混合均匀，形成丙稀酰胺母液，备用；
取19. 5mL的去离子水、6mL的5 X TBE缓冲液、4. 5mL的丙稀酰胺母液、16 μ L的TEMED 和160 μ L质量浓度为O. lg/mL的过硫酸氨，混合均匀，形成6%聚丙烯酰胺凝胶溶液，备用； 取40mL的乙醇、360mL的水和2mL的乙酸,混合均勻，形成固定液,备用；
取O. 6g的AgNO3和300mL的水，混合均匀，形成质量浓度为O. 2%的银染液，备用；
取12g的Na0H、2mL的甲醛和400mL的水，混合均匀，形成质量浓度为3%的显影液，备
用；
取30mL的乙酸和270mL的水，混合均匀，形成质量浓度为10%的乙酸，备用；
2)将步骤I)中得到的6%聚丙烯酰胺凝胶溶液倒入聚丙烯酰胺凝胶制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5μ L的扩增产物II、5 μ L的PCR产物IV、5 μ L的对照DNA溶液、5 μ L的中国春基因组DNA扩增产物、
5μ L的中间偃麦草基因组DNA扩增产物、5 μ L的去离子水反应产物和2 μ LDNA分子量标准 Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳3小时后关闭电泳仪， 将凝胶从电泳盒内取出，备用；
3)将凝胶放在步骤I)中得到的固定液中，放置3分钟，固定液的量淹没凝胶即可，后取出凝胶，利用去离子水对凝胶洗涤2次，每次30秒，然后将凝胶放在步骤I)中得到的银染液中，放置5分钟，银染液的量淹没凝胶即可，取出凝胶，将凝胶放在步骤I)中得到的质量浓度为3%的显影液中，放置10分钟，取出，用蒸馏水对凝胶洗涤一次，后将凝胶放在步骤 O中得到的质量浓度为10%的乙酸中，备用；
4)将步骤3)中的凝胶放于凝胶成像系统中进行观察，在凝胶成像系统中确认在点样孔内出现切割后的中间偃麦草外源染色体的目的基因和普通小麦染色体的目的基因。其中，中国春基因组对照DNA溶液的制备方法为
1)将5g中间偃麦草叶片置于_60°C的液氮中,放置6小时,取出研成粉末,后将粉末放入50mL离心管内，备用；
2)在含有粉末的50mL离心管内加入20mL温度为65°C的提取液和100μ L质量浓度为 10mg/mL的蛋白酶K，混合混匀，形成混合液II，后将含有混合液II的50mL离心管置于温度为65°C的水浴锅内，放置I小时，取出，后在50mL离心管内加入20mL的酚和氯仿混合液， 混合均匀，形成混合液III，将含有混合液III的50mL离心管送入离心机内，以转速为3000转 /分钟，离心20分钟，得到上层澄清液体a，备用；
3)在I.5mL离心管c内加入500 μ L步骤2)中得到的上层澄清液体a和500 μ L的氯仿，混合均匀，形成混合液IV，将含有混合液IV的I. 5mL离心管c送入离心机内，以转速为 3000转/分钟，离心20分钟，得到上层澄清液体b，备用；
4)在I.5mL离心管d内加入500 μ L步骤3)中得到的上层澄清液体b和300 μ L的异丙醇，混合均匀，形成混合液V，将含有混合液V的I. 5mL离心管d送入离心机内，以转速为 3000转/分钟，离心20分钟，得到沉淀物，将沉淀物用质量浓度为70%的乙醇洗涤一次，晾干，备用；
5)在IOmL离心管a内加入步骤4)中得到的沉淀物、4mL的IXTE溶液和10μ L质量浓度为10mg/mL的RNA酶，混合均匀，后在温度为37°C条件下，放置I小时，后加入4mL的酚和氯仿混合液，混合均匀，形成混合液VI，将含有混合液VI的IOmL离心管a送入离心机内， 以转速为3000转/分钟，离心15分钟，得到上层澄清液体C，备用；
6)在IOmL离心管b内加入5mL步骤5)中得到的上层澄清液体c和5mL的氯仿，混合均匀，形成混合液VL将含有混合液VII的IOmL离心管b送入离心机内，以转速为3000转/ 分钟，离心15分钟，得到上层澄清液体d，备用；
7)在I.5mL离心管e内加入300 μ L的上层澄清液体d、30 μ L的质量浓度为3mol/L的醋酸钠和600 μ L的无水乙醇，混合均匀，挑出离心管内的絮状物，用质量浓度为70%的乙醇对絮状物洗涤I次，晾干，后将絮状物溶解到40 μ L的I X TE溶液中，形成中国春基因组DNA 对照溶液，备用；
依据中国春基因组DNA对照溶液的制备方法，制备中间偃麦草基因组DNA对照溶液。实施例2
小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，包括以下步骤
步骤一、SL μ CELIXUT系统参数的设置
I)普通光源照明强度将普通光源的照明强度设置为120V/100W。2)紫外激光参数设置
在普通光源为120V/100W的照明强度下，将紫外激光的参数分别设置为100X物镜、激光速度为10，聚焦为49、激光能量为60，40X物镜、激光速度为51，聚焦为50、激光能量为75，20 X物镜、激光速度为59、聚焦为74、激光能量为66，IOX物镜、激光速度为49，聚焦为72、激光能量为79，4X物镜、激光速度为82，聚焦为79、激光能量为70 ；
3)切割样本的选择
使用软件中所列的圆形工具进行绘图，完成对样本的切割，避免激光在切割过程中由于热效应造成对样本的损伤；
4)单步收集
在操作CellCut 显微切割系统时，在4X物镜、IOX物镜下进行目标染色体的微切
割;
步骤二、小麦根尖细胞染色体标本的制备
1)按重量份数比取O.5份的中国春小麦种子和O. 5份的山农小麦种子，混合均匀，后将混合后的小麦种子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麦种子，在温度为2°C条件下，放置 24小时，后在温度为25°C条件下培养使小麦种子发芽，继续培养至新生小麦根长为I. 8cm 时，取O. 7cm的根尖部位，备用；
2)取步骤I)中的小麦根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小时后取出小麦根尖放于2份的温度为2°C的卡诺氏液中，放置24小时,取出，将小麦根尖放于质量浓度为70%的酒精中，备用；
3)试剂的配制
①混合酶液按重量份数比取I份质量浓度为2%的纤维素酶和I份质量浓度为2%的果胶酶，混合均匀，制得混合酶液；
②石炭酸品红溶液取3g的碱性品红和IOOml质量浓度为70%的乙醇，混合均匀，形成原液a，备用；
取IOml原液a和90ml质量浓度为5%的石炭酸水溶液，混合均匀，形成原液b，备用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml质量浓度为37%的福尔马林，混合均匀，形成原液c，备用；
取15ml的原液c、85ml质量浓度为45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均匀，制得石炭 Ife品红溶液，备用；
4)将步骤2)中的小麦根尖从酒精中取出，将Ig的小麦根尖浸泡在IOml的蒸馏水中， 放置10分钟，过滤，得到浸泡后的小麦根尖，将浸泡后的小麦根尖放在电子显微镜的载物台上，进行初步镜检，得到有丝分裂中期的根尖细胞染色体，后将有丝分裂中期的根尖细胞染色体加到Iml步骤3)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I. 3小时，形成酶解物I，利用无菌蒸馏水对酶解物I冲洗10分钟，在O. 5ml的离心管a内加入50 μ g的酶解物I和50μ I步骤3)中得到的石炭酸品红溶液，混合均匀，形成混合物，将混合物涂在载玻片上，在含有混合物的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使混合物附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成混合物痕迹，利用质量浓度为75%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为75%的酒精滴加在含有混合物痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗 I分钟，晾干，然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第二次细胞内脱水，制得小麦根尖细胞染色体标本；步骤三、花粉母细胞染色体标本的制备
1)取处于减数分裂中期I的小麦-中间偃麦草异代换系山农0095与小麦品种烟农15 的杂种F1代花粉母细胞，备用；
2)按重量份数比取I份步骤I)中得到的花粉母细胞和2份的卡诺氏液，将花粉母细胞放于2°C的卡诺氏液中，放置15小时，取出，将花粉母细胞放在质量浓度为70%的酒精中，备用；
3)将步骤2)中的花粉母细胞从质量浓度为70%的酒精中取出，将Ig的花粉母细胞浸泡在IOml的蒸馏水中，放置10分钟，过滤，得到浸泡后的花粉母细胞，将浸泡后的花粉母细胞加到Iml步骤一)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I小时，形成酶解物 II，利用无菌蒸馏水对酶解物II冲洗10分钟，将酶解物II涂在载玻片上，在含有酶解物II 的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使酶解物II附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成酶解物II痕迹，利用质量浓度为70%的酒精对分离膜上的酶解物II痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为70%的酒精滴加在含有酶解物II痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干， 然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的酶解物II 痕迹进行第二次细胞内脱水，制得花粉母细胞染色体标本，备用；
步骤四、小麦根尖细胞染色体的显微分离
在步骤二中制得的小麦根尖细胞染色体标本的载玻片上滴加20μ I无水乙醇，后在载玻片上覆盖盖玻片，将载玻片置于SL μ CELIXUT显微切割系统的载物台上，在4Χ物镜下找到目标染色体，然后转换至40X物镜下，对染色体的单价体进行切割，收集切割后的单根尖细胞染色体存放在I. 5ml离心管a中，备用；
步骤五、花粉母细胞染色体的显微切割
依据步骤四的操作方法对花粉母细胞染色体的显微切割，将切割收集后的花粉母细胞染色体存放在I. 5ml离心管b中，备用；
步骤六、对切割后的小麦根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体分别进行DOP-PCR扩增
1)试剂配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K处理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶缓冲液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均匀，形成质量浓度为600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶缓冲液稀释成质量浓度为20ng/l·! I的蛋白酶K处理液，备用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麦根尖细胞染色体的预处理
将步骤二中得到的小麦根尖染色体放在O. 5ml离心管b内，后在含有小麦根尖染色体的O. 5ml离心管b内加入20 μ I步骤I)中得到的质量浓度为20ng/μ I的蛋白酶K处理液，混合均匀，形成混合液I，将含有混合液I的O. 5ml离心管b置于37°C条件下，放置4 小时，然后将O. 5ml离心管b放于离心机内，以转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到上层液体，将上层液体放在70°C条件下，灭菌20分钟，取出，得到处理后的小麦根尖目标染色体，备用；
3)花粉母细胞染色体的预处理
依据步骤2)中对小麦根尖细胞染色体的预处理方法对花粉母细胞染色体进行预处理，得到花粉母细胞目标染色体，备用；
4)小麦根尖目标染色体的DOP-PCR扩增第一次PCR扩增
PCR反应体系I :在0.5ml离心管c中加入24. 6 μ I的处理后小麦根尖目标染色体、
4μ I的10XPCR缓冲液，3 μ I质量浓度为25mmol/L的Mg2+、4 μ I浓度为25mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、O. 4μ I质量浓度为5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去离子水,形成反应体系I ,备用；
PCR程序将反应体系I放入PCR仪内，94°C预变性10分钟，94°C变性I. 5分钟、50°C退火I. 5分钟、72°C延伸3分钟，PCR扩增共5个循环，然后94°C变性I. 5分钟、57°C退火I. 5 分钟、72°C延伸I. 5分钟，PCR扩增共25个循环，72°C再次延伸10分钟，形成PCR产物I， 备用;
第二次PCR扩增
将PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为PCR产物I，按照相同方法配制成PCR体系II，后依据第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行第二次PCR扩增，得到PCR产物II，备用；
5)花粉母细胞目标染色体的DOP-PCR扩增第一次PCR扩增
将步骤4)中PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为处理后的花粉母细胞目标染色体，按照相同方法配制成PCR反应体系III，后依据步骤4)中第一次 PCR扩增中PCR程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增，得到PCR产物 III，备用；
第二次PCR扩增
将PCR反应体系III配制过程中的处理后的花粉母细胞目标染色体替换为PCR产物III， 按照相同方法配制成PCR体系IV，后依据花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增中PCR 程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第二次PCR扩增，得到PCR产物IV，备用；
6)将处理后小麦根尖目标染色体分别替换为无菌去离子水、中国春基因组DNA和中间偃麦草基因组DNA，后依据步骤4)的方法对无菌去离子水、中国春基因组DNA、中间偃麦草基因组DNA进行DOP-PCR扩增，得到无菌去离子水扩增产物、中国春基因组DNA扩增产物和中间偃麦草基因组DNA扩增产物，将中国春基因组DNA扩增产物和中间偃麦草基因组DNA 扩增产物作为阳性对照，无菌去离子水扩增产物作为阴性对照；
步骤七、利用丙稀酰胺凝胶电泳对PCR产物II和PCR产物IV进行检测 O电泳试剂的配制取39g的丙稀酰胺、Ig的甲叉双丙稀酰胺和IOOmL的水，混合均匀，形成丙稀酰胺母液，备用；
取19. 5mL的去离子水、6mL的5 X TBE缓冲液、4. 5mL的丙稀酰胺母液、16 μ L的TEMED 和160 μ L质量浓度为O. lg/mL的过硫酸氨，混合均匀，形成6%聚丙烯酰胺凝胶溶液，备用； 取40mL的乙醇、360mL的水和2mL的乙酸,混合均勻，形成固定液,备用；
取O. 6g的AgNO3和300mL的水，混合均匀，形成质量浓度为O. 2%的银染液，备用；
取12g的Na0H、2mL的甲醛和400mL的水，混合均匀，形成质量浓度为3%的显影液，备
用；取30mL的乙酸和270mL的水，混合均匀，形成质量浓度为10%的乙酸，备用；
2)将步骤I)中得到的6%聚丙烯酰胺凝胶溶液倒入聚丙烯酰胺凝胶制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5μ L的扩增产物II、5μ L的PCR产物IV、5y L的对照DNA溶液、5μ L的中国春基因组DNA扩增产物、
5μ L的中间偃麦草基因组DNA扩增产物、5 μ L的去离子水反应产物和2 μ LDNA分子量标准 Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳3小时后关闭电泳仪， 将凝胶从电泳盒内取出，备用；
3)将凝胶放在步骤I)中得到的固定液中，放置3分钟，固定液的量淹没凝胶即可，后取出凝胶，利用去离子水对凝胶洗涤2次，每次30秒，然后将凝胶放在步骤I)中得到的银染液中，放置5分钟，银染液的量淹没凝胶即可，取出凝胶，将凝胶放在步骤I)中得到的质量浓度为3%的显影液中，放置10分钟，取出，用蒸馏水对凝胶洗涤一次，后将凝胶放在步骤 O中得到的质量浓度为10%的乙酸中，备用；
4)将步骤3)中的凝胶放于凝胶成像系统中进行观察，在凝胶成像系统中确认在点样孔内出现切割后的中间偃麦草外源染色体的目的基因和普通小麦染色体的目的基因。其中，中国春基因组对照DNA溶液和中国春基因组DNA对照溶液的制备方法，与实施例I相同。实施例3
小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，包括以下步骤
步骤一、SL μ CELIXUT系统参数的设置 I)普通光源照明强度将普通光源的照明强度设置为120V/100W。2)紫外激光参数设置
在普通光源为120V/100W的照明强度下，将紫外激光的参数分别设置为100Χ物镜、 激光速度为10，聚焦为49、激光能量为60，40Χ物镜、激光速度为51，聚焦为50、激光能量为75，20 X物镜、激光速度为59、聚焦为74、激光能量为66，IOX物镜、激光速度为49，聚焦为72、激光能量为79，4X物镜、激光速度为82，聚焦为79、激光能量为70 ；
3)切割样本的选择
使用软件中所列的圆形工具进行绘图，完成对样本的切割，避免激光在切割过程中由于热效应造成对样本的损伤；
4)单步收集
在操作CellCut 显微切割系统时，在4Χ物镜、IOX物镜下进行目标染色体的微切
割;
步骤二、小麦根尖细胞染色体标本的制备
1)按重量份数比取O.5份的中国春小麦种子和O. 5份的山农小麦种子，混合均匀，后将混合后的小麦种子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麦种子，在温度为4°C条件下，放置 24小时，后在温度为25°C条件下培养使小麦种子发芽，继续培养至新生小麦根长为2. Ocm 时，取O. 8cm的根尖部位，备用；
2)取步骤I)中的小麦根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小时后取出小麦根尖放于3份的温度为4°C的卡诺氏液中，放置24小时,取出，将小麦根尖放于质量浓度为70%的酒精中，备用；
3)试剂的配制
①混合酶液按重量份数比取I份质量浓度为2%的纤维素酶和I份质量浓度为2%的果胶酶，混合均匀，制得混合酶液；
②石炭酸品红溶液取3g的碱性品红和IOOml质量浓度为70%的乙醇，混合均匀，形成原液a，备用；
取IOml原液a和90ml质量浓度为5%的石炭酸水溶液，混合均匀，形成原液b，备用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml质量浓度为37%的福尔马林，混合均匀，形成原液c，备用；
取20ml的原液c、80ml质量浓度为45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均匀，制得石炭 Ife品红溶液，备用；
4)将步骤2)中的小麦根尖从酒精中取出，将Ig的小麦根尖浸泡在IOml的蒸馏水中， 放置10分钟，过滤，得到浸泡后的小麦根尖，将浸泡后的小麦根尖放在电子显微镜的载物台上，进行初步镜检，得到有丝分裂中期的根尖细胞染色体，后将有丝分裂中期的根尖细胞染色体加到Iml步骤3)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I. 5小时，形成酶解物I，利用无菌蒸馏水对酶解物I冲洗10分钟，在O. 5ml的离心管a内加入50 μ g的酶解物I和50μ I步骤3)中得到的石炭酸品红溶液，混合均匀，形成混合物，将混合物涂在载玻片上，在含有混合物的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使混合物附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成混合物痕迹，利用质量浓度为75%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为75%的酒精滴加在含有混合物痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗 I分钟，晾干，然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第二次细胞内脱水，制得小麦根尖细胞染色体标本；
步骤三、花粉母细胞染色体标本的制备
1)取处于减数分裂中期I的小麦-中间偃麦草异代换系山农0095与小麦品种烟农15 的杂种F1代花粉母细胞，备用；
2)按重量份数比取I份步骤I)中得到的花粉母细胞和3份的卡诺氏液，将花粉母细胞放于4°C的卡诺氏液中，放置24小时，取出，将花粉母细胞放在质量浓度为70%的酒精中，备用；
3)将步骤2)中的花粉母细胞从质量浓度为70%的酒精中取出，将Ig的花粉母细胞浸泡在IOml的蒸馏水中，放置10分钟，过滤，得到浸泡后的花粉母细胞，将浸泡后的花粉母细胞加到Iml步骤一)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I小时，形成酶解物 II，利用无菌蒸馏水对酶解物II冲洗10分钟，将酶解物II涂在载玻片上，在含有酶解物II 的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使酶解物II附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成酶解物II痕迹，利用质量浓度为70%的酒精对分离膜上的酶解物II痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为70%的酒精滴加在含有酶解物II痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干， 然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的酶解物II痕迹进行第二次细胞内脱水，制得花粉母细胞染色体标本，备用；
步骤四、小麦根尖细胞染色体的显微分离
在步骤二中制得的小麦根尖细胞染色体标本的载玻片上滴加20 μ I无水乙醇，后在载玻片上覆盖盖玻片，将载玻片置于SLy CELIXUT显微切割系统的载物台上，在4Χ物镜下找到目标染色体，然后转换至40Χ物镜下，对染色体的单价体进行切割，收集切割后的单根尖细胞染色体存放在I. 5ml离心管a中，备用；
步骤五、花粉母细胞染色体的显微切割
依据步骤四的操作方法对花粉母细胞染色体的显微切割，将切割收集后的花粉母细胞染色体存放在I. 5ml离心管b中，备用；
步骤六、对切割后的小麦根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体分别进行DOP-PCR扩增
1)试剂配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K处理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶缓冲液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均匀，形成质量浓度为600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶缓冲液稀释成质量浓度为20ng/l·! I的蛋白酶K处理液，备用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麦根尖细胞染色体的预处理
将步骤二中得到的小麦根尖染色体放在O. 5ml离心管b内，后在含有小麦根尖染色体的O. 5ml离心管b内加入20μ I步骤I)中得到的质量浓度为20ng/μ I的蛋白酶K处理液，混合均匀，形成混合液I，将含有混合液I的O. 5ml离心管b置于37°C条件下，放置4 小时，然后将O. 5ml离心管b放于离心机内，以转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到上层液体，将上层液体放在70°C条件下，灭菌20分钟，取出，得到处理后的小麦根尖目标染色体，备用;
3)花粉母细胞染色体的预处理
依据步骤2)中对小麦根尖细胞染色体的预处理方法对花粉母细胞染色体进行预处理， 得到花粉母细胞目标染色体，备用；
4)小麦根尖目标染色体的DOP-PCR扩增
第一次PCR扩增
PCR反应体系I :在0.5ml离心管c中加入24. 6 μ I的处理后小麦根尖目标染色体、 4 μ I的10XPCR缓冲液，3 μ I质量浓度为25mmol/L的Mg2+、4 μ I浓度为25mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、O. 4μ I质量浓度为5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和
12μ I的去离子水,形成反应体系I ,备用；
PCR程序将反应体系I放入PCR仪内，94°C预变性10分钟，94°C变性I. 5分钟、50°C退火I. 5分钟、72°C延伸3分钟，PCR扩增共5个循环，然后94°C变性I. 5分钟、57°C退火I. 5 分钟、72°C延伸I. 5分钟，PCR扩增共25个循环，72°C再次延伸10分钟，形成PCR产物I， 备用;
第二次PCR扩增
将PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为PCR产物I，按照相同方法配制成PCR体系II，后依据第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行第二次PCR扩增，得到PCR产物II，备用；5)花粉母细胞目标染色体的DOP-PCR扩增第一次PCR扩增
将步骤4)中PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为处理后的花粉母细胞目标染色体，按照相同方法配制成PCR反应体系III，后依据步骤4)中第一次 PCR扩增中PCR程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增，得到PCR产物 III，备用；
第二次PCR扩增
将PCR反应体系III配制过程中的处理后的花粉母细胞目标染色体替换为PCR产物III， 按照相同方法配制成PCR体系IV，后依据花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增中PCR 程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第二次PCR扩增，得到PCR产物IV，备用；
6)将处理后小麦根尖目标染色体分别替换为无菌去离子水、中国春基因组DNA和中间偃麦草基因组DNA，后依据步骤4)的方法对无菌去离子水、中国春基因组DNA、中间偃麦草基因组DNA进行DOP-PCR扩增，得到无菌去离子水扩增产物、中国春基因组DNA扩增产物和中间偃麦草基因组DNA扩增产物，将中国春基因组DNA扩增产物和中间偃麦草基因组DNA 扩增产物作为阳性对照，无菌去离子水扩增产物作为阴性对照；
步骤七、利用丙稀酰胺凝胶电泳对PCR产物II和PCR产物IV进行检测 O电泳试剂的配制取39g的丙稀酰胺、Ig的甲叉双丙稀酰胺和IOOmL的水，混合均匀，形成丙稀酰胺母液，备用；
取19. 5mL的去离子水、6mL的5 X TBE缓冲液、4. 5mL的丙稀酰胺母液、16 μ L的TEMED 和160 μ L质量浓度为O. lg/mL的过硫酸氨，混合均匀，形成6%聚丙烯酰胺凝胶溶液，备用； 取40mL的乙醇、360mL的水和2mL的乙酸,混合均勻，形成固定液,备用；
取O. 6g的AgNO3和300mL的水，混合均匀，形成质量浓度为O. 2%的银染液，备用；
取12g的Na0H、2mL的甲醛和400mL的水，混合均匀，形成质量浓度为3%的显影液，备
用；
取30mL的乙酸和270mL的水，混合均匀，形成质量浓度为10%的乙酸，备用；
2)将步骤I)中得到的6%聚丙烯酰胺凝胶溶液倒入聚丙烯酰胺凝胶制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5μ L的扩增产物II、5μ L的PCR产物IV、5y L的对照DNA溶液、5μ L的中国春基因组DNA扩增产物、
5μ L的中间偃麦草基因组DNA扩增产物、5 μ L的去离子水反应产物和2 μ LDNA分子量标准 Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳3小时后关闭电泳仪， 将凝胶从电泳盒内取出，备用；
3)将凝胶放在步骤I)中得到的固定液中，放置3分钟，固定液的量淹没凝胶即可，后取出凝胶，利用去离子水对凝胶洗涤2次，每次30秒，然后将凝胶放在步骤I)中得到的银染液中，放置5分钟，银染液的量淹没凝胶即可，取出凝胶，将凝胶放在步骤I)中得到的质量浓度为3%的显影液中，放置10分钟，取出，用蒸馏水对凝胶洗涤一次，后将凝胶放在步骤 O中得到的质量浓度为10%的乙酸中，备用；
4)将步骤3)中的凝胶放于凝胶成像系统中进行观察，在凝胶成像系统中确认在点样孔内出现切割后的中间偃麦草外源染色体的目的基因和普通小麦染色体的目的基因。
其中，中国春基因组对照DNA溶液和中国春基因组DNA对照溶液的制备方法，与实施例I相同。所述的氯仿和异戊醇混合液的组成成分按体积比氯仿和异戊醇混合液中含有 24份的氯仿和I份的戊醇。所述的IXTE溶液的组成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量为水。所述的5XTBE缓冲液的组成成份每升TBE缓冲液中含有54g的三羟甲基氨基甲烷、27. 5g的硼酸、20mL的乙二胺四乙酸(pH为8. 0)，余量为水。所述的提取液的组成成份每升提取液中含有lOOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 为 8. 5)、100mmol/L 的 NaCl、50mmol/L 的乙二胺四乙酸(pH 为 8. O)、2% 的十二
烧基硫酸纳，余量为水。
权利要求
1.小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法，其特征在于包括以下步骤步骤一、小麦根尖细胞染色体标本的制备O按重量份数比取O. 5份的中国春小麦种子和O. 5份的山农小麦种子，混合均匀，后将混合后的小麦种子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麦种子，在温度为I一4°C条件下，放置24小时，后在温度为25°C条件下培养使小麦种子发芽，继续培养至新生小麦根长为I. 5—2. Ocm时，取O. 5—0. 8cm的根尖部位，备用；2)取步骤I)中的小麦根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小时后取出小麦根尖放于2—3份的温度为1—4°C的卡诺氏液中，放置24小时，取出，将小麦根尖放于质量浓度为 70%的酒精中，备用；3)试剂的配制①混合酶液按重量份数比取I份质量浓度为2%的纤维素酶和I份质量浓度为2%的果胶酶，混合均匀，制得混合酶液；②石炭酸品红溶液取3g的碱性品红和IOOml质量浓度为70%的乙醇，混合均匀，形成原液a，备用；取IOml原液a和90ml质量浓度为5%的石炭酸水溶液，混合均匀，形成原液b，备用；取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml质量浓度为37%的福尔马林，混合均匀，形成原液c，备用；取10 — 20ml的原液c、80— 90ml质量浓度为45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均匀， 制得石炭酸品红溶液，备用；4)将步骤2)中的小麦根尖从酒精中取出，将Ig的小麦根尖浸泡在IOml的蒸馏水中， 放置10分钟，过滤，得到浸泡后的小麦根尖，将浸泡后的小麦根尖放在电子显微镜的载物台上，进行初步镜检，得到有丝分裂中期的根尖细胞染色体，后将有丝分裂中期的根尖细胞染色体加到Iml步骤3)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I一I. 5小时，形成酶解物I，利用无菌蒸馏水对酶解物I冲洗10分钟，在O. 5ml的离心管a内加入50 μ g 的酶解物I和50 μ I步骤3)中得到的石炭酸品红溶液，混合均匀，形成混合物，将混合物涂在载玻片上，在含有混合物的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使混合物附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成混合物痕迹，利用质量浓度为75%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为75%的酒精滴加在含有混合物痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干，然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第二次细胞内脱水，制得小麦根尖细胞染色体标本；步骤二、花粉母细胞染色体标本的制备1)取处于减数分裂中期I的小麦-中间偃麦草异代换系山农0095与小麦品种烟农15 的杂种F1代花粉母细胞，备用；2)按重量份数比取I份步骤I)中得到的花粉母细胞和2—3份的卡诺氏液，将花粉母细胞放于I一4°C的卡诺氏液中，放置3 — 24小时，取出，将花粉母细胞放在质量浓度为70% 的酒精中，备用；3)将步骤2)中的花粉母细胞从质量浓度为70%的酒精中取出，将Ig的花粉母细胞浸泡在IOml的蒸馏水中，放置10分钟，过滤，得到浸泡后的花粉母细胞，将浸泡后的花粉母细胞加到Iml步骤一)中得到的混合酶液中，在温度为37°C条件下，酶解I小时，形成酶解物 II，利用无菌蒸馏水对酶解物II冲洗10分钟，将酶解物II涂在载玻片上，在含有酶解物II 的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使酶解物II附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成酶解物II痕迹，利用质量浓度为70%的酒精对分离膜上的酶解物II痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为将质量浓度为70%的酒精滴加在含有酶解物II痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗I分钟，晾干， 然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的酶解物II 痕迹进行第二次细胞内脱水，制得花粉母细胞染色体标本，备用；步骤三、小麦根尖细胞染色体的显微分离在步骤一中制得的小麦根尖细胞染色体标本的载玻片上滴加20μ I无水乙醇，后在载玻片上覆盖盖玻片，将载玻片置于SL μ CELIXUT显微切割系统的载物台上，在4Χ物镜下找到目标染色体，然后转换至40Χ物镜下，对染色体的单价体进行切割，收集切割后的单根尖细胞染色体存放在I. 5ml离心管a中，备用；步骤四、花粉母细胞染色体的显微切割依据步骤三的操作方法对花粉母细胞染色体的显微切割，将切割收集后的花粉母细胞染色体存放在I. 5ml离心管b中，备用；步骤五、对切割后的小麦根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体分别进行DOP-PCR扩增1)试剂配制及兼并引物序列的合成蛋白酶K处理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶缓冲液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均匀，形成质量浓度为600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶缓冲液稀释成质量浓度为20ng/l·! I的蛋白酶K处理液，备用；兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；2)小麦根尖细胞染色体的预处理将步骤二中得到的小麦根尖染色体放在O. 5ml离心管b内，后在含有小麦根尖染色体的O. 5ml离心管b内加入20 μ I步骤I)中得到的质量浓度为20ng/μ I的蛋白酶K处理液， 混合均匀，形成混合液，将含有混合液的O. 5ml离心管b置于37°C条件下，放置4小时，然后将O. 5ml离心管b放于离心机内，以转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到上层液体，将上层液体放在70°C条件下，灭菌20分钟，取出，得到处理后的小麦根尖目标染色体，备用；3)花粉母细胞染色体的预处理依据步骤2)中对小麦根尖细胞染色体的预处理方法对花粉母细胞染色体进行预处理， 得到花粉母细胞目标染色体，备用；4)小麦根尖目标染色体的DOP-PCR扩增第一次PCR扩增PCR反应体系I :在O. 5ml离心管c中加入24. 6 μ I的处理后小麦根尖目标染色体、 4 μ I的10XPCR缓冲液，3 μ I质量浓度为25mmol/L的Mg2+、4 μ I浓度为25mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、O. 4μ I质量浓度为5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去离子水,形成反应体系I ,备用；PCR程序将反应体系I放入PCR仪内，94°C预变性10分钟，94°C变性I. 5分钟、50°C退火I. 5分钟、72°C延伸3分钟，PCR扩增共5个循环，然后94°C变性I. 5分钟、57°C退火I. 5分钟、72°C延伸I. 5分钟，PCR扩增共25个循环，72°C再次延伸10分钟，形成PCR产物I， 备用;第二次PCR扩增将PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为PCR产物I，按照相同方法配制成PCR体系II，后依据第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行第二次PCR扩增，得到PCR产物II，备用；5)花粉母细胞目标染色体的DOP-PCR扩增第一次PCR扩增将步骤4)中PCR反应体系I配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为处理后的花粉母细胞目标染色体，按照相同方法配制成PCR反应体系III，后依据步骤4)中第一次 PCR扩增中PCR程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增，得到PCR产物 III，备用；第二次PCR扩增将PCR反应体系III配制过程中的处理后的花粉母细胞目标染色体替换为PCR产物III， 按照相同方法配制成PCR体系IV，后依据花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增中PCR 程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第二次PCR扩增，得到PCR产物IV，备用；步骤六、利用聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳检测PCR产物II和PCR产物II，在凝胶成像系统中确认PCR产物II中含有切割后的普通小麦染色体的目的基因，在凝胶成像系统中确认 PCR产物IV中含有切割后的中间偃麦草外源染色体的目的基因。
全文摘要
小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法，包括1)小麦根尖细胞染色体标本的制备、2)花粉母细胞染色体标本的制备3)小麦根尖细胞染色体的显微分离、4)花粉母细胞染色体的显微切割、5)对切割后的小麦根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体分别进行DOP-PCR扩增并利用聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳检测PCR产物Ⅱ和PCR产物Ⅱ，在凝胶成像系统中确认PCR产物Ⅱ中含有切割后的普通小麦染色体的目的基因，在凝胶成像系统中确认PCR产物Ⅳ中含有切割后的中间偃麦草外源染色体的目的基因。本发明的制备方法简单，其鉴定方法简单，分析简单，便于染色体的切割与回收，为后续切割染色体的鉴定与分析奠定基础。
文档编号C12N5/04GK102604883SQ201210060698
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者王春平, 王黎明, 董普辉, 袁建国, 袁瑛 申请人:河南科技大学