免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了能表达包含人可变区序列的抗体的改良的非人脊椎动物和非脊椎动物细胞。本发明涉及从非人脊椎动物和细胞中提供长HCDR3。本发明还涉及提供免疫球蛋白重链和轻链基因座中新的V、D和J配对。本发明提供了新的、偏向的抗体多样性及潜在扩展的多样性。本发明还提供了新的和潜在扩展的多样性或者关于抗体共有的可变基因使用的偏向的多样性，可用于治疗和/或预防某些疾病或病症，如感染性疾病。本发明还提供了使用这种脊椎动物产生抗体的方法，以及抗体本身、其治疗组合物及应用。
【专利说明】免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
发明领域
[0001]本发明涉及提供具有长HCDR3长度的抗体。本发明还涉及提供在免疫球蛋白重链和轻链基因座中新的V、D和J配对。本发明提供了新的、偏向的(biased)抗体多样性和潜在扩展的多样性。本发明还提供了新的和潜在扩展的多样性或者偏向于抗体共有的可变基因使用的多样性，可用于治疗和/或预防某些疾病或病症，如感染性疾病。偏向抗体所有成分的这种能力还提供了简化生产抗体混合物如可用于治疗和/或预防感染性疾病的多克隆抗体治疗剂的方法，其中需要靶向多个病原体抗原的多克隆方法。为此，本发明还提供了双特异性抗体，其能结合一个以上的抗原(例如由相同病原体表达的多个感染性抗原)，因此提供了多克隆抗体混合物不可能有的优势(如生产、用量和施用优势)。 [0002]本发明提供了脊椎动物和细胞，如转基因小鼠或大鼠或者转基因小鼠或大鼠细胞。此外，本发明涉及使用脊椎动物分离抗体或者编码抗体的核苷酸序列的方法。本发明还提供了抗体、核苷酸序列、药物组合物及应用。
[0003]发明背景
[0004]现有技术提供了包含转基因免疫球蛋白基因座的非人脊椎动物(例如小鼠和大鼠)和细胞，这种基因座包含人可变(V)、多样性(D)和/或连接(J)区段，及任选存在的人恒定区。或者，在转基因基因座中提供了宿主脊椎动物的内源性恒定区(例如小鼠或大鼠恒定区)。构建这种转基因脊椎动物及使用其在抗原免疫之后产生抗体及其核酸的方法为本领域已知，见例如 US7501552 (Medarex)、US5939598 (Abgenix)、US6130364 (Abgenix)、W002/066630 (Regeneron)、W02011004192 (Genome Research Limited)、W02009076464、W02009143472和W02010039900 (Ablexis)所述，所述文献并入本文作参考。本领域中的这种转基因基因座包括不同量的人V(D)J库集(repertoire)。
[0005]现有的转基因免疫球蛋白基因座趋于基于单一人DNA来源。携带这种转基因基因座的非人脊椎动物中人抗体可变区的潜在多样性因此受到所用的库集的限制。
[0006]希望在转基因免疫球蛋白基因座及携带其的非人脊椎动物中以及在免疫这些动物之后产生的抗体中提供人可变区的新的及潜在扩展的库集和多样性。
[0007]发明概沭
[0008]本发明人通过构建转基因非人脊椎动物、免疫、抗体重链收集及深度生物信息学分析，已经揭示了怎样合理设计VH结构域、重链及具有长HCDR3的抗体。这些可用于针对(addressing)抗原(如感染性疾病病原体抗原,受体和酶裂缝)，其中较长的CDR更好地针对靶位。
[0009]本发明人还认识到以新的方式提供V、D和J基因区段的组合以在免疫球蛋白基因座中提供在天然或在本领域现有基因座中未发现的合成的基因区段组合的可能性。本发明人认识到在转基因免疫球蛋白基因座及携带其的非人脊椎动物以及在免疫这些动物之后产生的抗体中提供人可变区的新的和潜在扩展的库集和多样性的重要性。一方面，本发明人认识到希望偏向于新的库集以产生具有改良的亲和性和/或生物物理学特性的抗体，和/或其中通过这种库集产生的表位特异性的范围是新的，为抗体提供迄今为止通过现有转基因免疫球蛋白基因座难处理或者难以针对的表位。例如，本发明人设想了特异性应用以偏向新的库集产生可用于治疗和/或预防感染性疾病的抗体。
[0010]为此，本发明的第一种配置是提供非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含:
[0011](a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；任选其中重链基因座处于下文描述的本发明的任一配置中；及
[0012](b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含:
[0013](i)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段和一或多个人J基因区段(任选重排的VHJLCL或VHJ λ CL，其中CL是C λ或C κ );或者
[0014](ii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段(任选重排的VLDJHCL或V λ DJHCL，其中CL是C λ或C κ);或者
[0015](iii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段以及一或多个人JL基因区段，所述人VL基因区段选自如下一组中:νλ II基因家族成员、νλν?Ι4Α、νλ 112.K VAVII4A,V λ I 基因家族成员、νλ 3 基因家族成员、IGLV1S2、νλ 3_cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、Vk I基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、Vk II家族成员、Vk III家族成员、Vk I基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、Vk IIA2 (任选A2a等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及与其至少80%相同的基因区段；
[0016]其中所述重链 基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含通过重链基因座的重组产生的重链和通过轻链基因座的重组产生的轻链的抗体。
[0017]一方面，
[0018]在(b)⑴中，所述轻链基因座的V基因区段库集包含或者由一或多个VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV 基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26 (VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH Hll、VH1GRR、ha3h2、VH1-halcl、VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、Hvlfl0、VH4.11、71-4、VH251、VH1_69 及与其至少 80%相同的基因区段；或者
[0019]在(b)(iii)中，轻链基因座V基因区段库集由一种VL基因区段类型(任选及一或多种其突变体)组成，其中VL基因区段选自所述一组VL基因区段。
[0020]在本发明的第二种配置中，提供了:
[0021]非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含:
[0022](a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；及
[0023](b) (i)未重排的免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段和一或多个人J基因区段，其中每个人VH基因区段是与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体重链可变区的重排的VDJ的人VH基因区段(或其突变体)相同的人基因区段，其中所述抗体结合感染性疾病病原体抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；或者[0024](ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的重排的VJ区或者VDJ区，其中所述重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VH基因区段的重组产生的核苷酸序列相同，所述人VH基因区段与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体重链可变区的重排的VDJ的人VH基因区段(或其突变体)相同，其中所述抗体结合感染性疾病病原体抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；
[0025](C)其中所述重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中的基因区段或VJ或VDJ与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含通过所述重链基因座的重组产生的重链和衍生自所述轻链基因座的轻链的抗体；
[0026](d)任选地，当应用(b)⑴时，所述轻链基因座中每个所述VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHI119.1(VH3-15)、VHIII VH26 (VH3-23),VH3-21,LSG6.ULSG12.1、DP77 (V3-21)、VH Hll、VH1GRR、ha3h2、VH1-halcl, VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71_2、HvlflO、VH4.11、71-4、VH251、VHl-69及与其至少80%相同的基因区段；
[0027](e)任选地，当应用(b) (ii)时，重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VH基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77 (V3-21)、VH HlU VH1GRR、ha3h2 、VH1-halcl, VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71_2、HvlflO、VH4.ll、71-4、VH251、VHl-69及与其至少80%相同的基因区段。
[0028]一方面，所述轻链基因座的V基因区段库集包含或者由一个人VH基因区段、任选种系VH及其一或多种多态性变体组成，例如每个多态性变体与种系VH核苷酸序列在1、2、
3、4、5、6、7、8、9或10个位置不同。一方面，所述轻链基因座的V基因区段库集包含或者由人VH1-69基因区段、任选种系VH1-69及其一或多种多态性变体组成，例如每个多态性变体与种系VH1-69核苷酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置不同。下文提供了构建包含VH1-69及多态性变体的免疫球蛋白基因座的实例。通过使用特定基因区段(例如通常在人体中对抗感染或者其它病症产生的人抗体中发现的一个基因区段)及其一或多种多态性变体，可以提供基因的库集且仍使抗体基因库集偏向于与疾病(例如感染性疾病，如细菌或病毒性疾病，如流感)相关的基因区段。这提供了有用的基因库，从中最后产生并分离先导抗体(lead antibody)以治疗/预防所述研究的疾病。在一个实例中，所述多态性变体是在人类或人群中见到的天然变体。技术人员将获知人抗体基因序列的来源，如IMGT(www.1mgt.0rg)、GenBank(www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank)及 1000 基因组数据库(www.1OOORenomes.0rR)。关于数据库操作的生物信息学工具也易于获得且为技术人员已知，例如从 1000Genomes Project/EBI (www.1000genomes.0rg)中公开获得。
[0029]另一方面，所述脊椎动物或细胞的基因组对于轻链基因座(b) (i)或(ii)是纯合的，任选其中:
[0030]-所述轻链基因座的V基因区段库集由一或多个人VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV 基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH Hll、VH1GRR、ha3h2、VH1-halcl, VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、HvlflO、VH4.11、71_4、VH251、VH1-69及与其至少80%相同的基因区段;或者
[0031]-所述轻链基因座的重组的VJ或VDJ库集由与通过人VH基因区段与人J基因区段及任选存在的人D基因区段重组产生的一或多个核苷酸序列相同的序列组成，所述人VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV 基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH Hll、VH1GRR、ha3h2、VH1-halcl, VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、HvlflO、VH4.11、71_4、VH251、VH1-69 及与其至少 80%相同的基因区段。
[0032]另一方面，所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白轻链基因座是如(b) (i)所述，包含仅一个人VH基因区段，所述人VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHI119.1 (VH3-15)、VHIIIVH26 (VH3-23),VH3-21,LSG6.ULSG12.1、DP77 (V3-21)、VH Hll、VHlGRR、ha3h2、VHI_halcl、VHII1-VH2-UVH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、Hvlfl0、VH4.11、71_4、VH251、VH1-69 及与其至少80%相同的基因区段，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链是纯合的，由此所有轻链基因座均包含相同的单个人VH基因区段。
[0033]本发明提供了分离结合预定抗原的抗体的第一种方法，所述方法包括:
[0034](a)提供根据任何前述配置或方面的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)；
[0035](b)用所述抗原免疫所述脊椎动物(任选其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原)； [0036](c)从所述脊椎动物中取出B淋巴细胞，选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
[0037](d)任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤进行；及
[0038](e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)。
[0039]本发明提供的第二种方法包括进行第一种方法以及从所述B淋巴细胞中分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。
[0040]本发明一方面提供了产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行第一种方法，通过用抗原分别免疫第一和第二脊椎动物(任选第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)及组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))应用如下步骤:
[0041](i)用相同抗原或不同抗原免疫所述脊椎动物(任选其中不同抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达)；
[0042](ii)在免疫之前，所述脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因)及任选存在的相同的J库集；任选哺乳动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；
[0043](iii)在免疫之前，所述脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选所述脊椎动物轻链基因座在免疫之前是相同的。
[0044]本发明一方面提供了产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行第一种方法，通过用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)，组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))应用如下步骤:
[0045](i)所述抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达；
[0046](ii)在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因)及任选存在的相同的J库集；任选哺乳动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；
[0047](iii)在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。
[0048]本发明一方面提供了产生能表达多克隆抗体混合物的宿主细胞的方法，所述方法包括:在第二种方法中，
[0049](a)用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)(任选其中不同抗原由相同病原性生物体(或者其家族成员)表达)；
[0050](b)从所述脊椎动物的B淋巴细胞中分离编码第一种和第二种抗-抗原抗体的核酸；
[0051](C)确定第一种抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列；
[0052](d)确定第二种抗体的重链可变区及任选确定轻链可变区的核苷酸序列；
[0053](e)将每种抗体的重链可变区编码序列插入重链表达载体中；任选其中每个重链的恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；
[0054](f)将第一种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中第一种抗体的轻链恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；
[0055](g)任选将第二种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中第二种抗体的轻链恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；及
[0056](h)将每个表达载体导入宿主细胞中并在所述宿主细胞的混合物中共表达抗体链以产生抗体，每个抗体均包含所述重链可变区和轻链之一或二者；任选其中表达载体一起导入相同宿主细胞中(例如CHO或HEK293细胞)，由此所述细胞能表达抗体轻链与重链，由此所述细胞或多个宿主细胞表达抗体，每个抗体均包含所述重链可变区和轻链之一或二者;
[0057]⑴任选地，
[0058]在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因区段)及任选存在的相同的J库集(任选单个J基因区段)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；或者
[0059]在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。 [0060]本发明还提供了产生单克隆或多克隆抗体混合物的方法，任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病，其中任选每个抗体均结合感染性疾病病原体的抗原，优选相同抗原。本发明还提供了分离的单克隆或多克隆抗体或其突变体或衍生物抗体在生产治疗和/或预防感染性疾病的药物中的应用，任选其中感染性疾病是由细菌或病毒病原体引起的疾病。
[0061]本发明进一步提供了通过本发明的方法可获得或者获得的分离的抗体(例如IgG型抗体)或其突变体或衍生物抗体，其中(i)所述分离的抗体包含所述第一种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(ii)所述分离的抗体包含所述第二种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(iii)所述分离的抗体是双特异性抗体，其包含所述第一种抗体的重链可变区的一个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的一个拷贝配对，及所述抗体的重链可变区的一个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的一个拷贝配对，任选其中所述双特异性抗体结合由相同病原性生物体(或其家族成员)表达的所述第一和第二抗原；任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病。
[0062]一方面，本发明提供了编码本发明抗体的核苷酸序列，任选其中所述核苷酸序列是载体的一部分。
[0063]一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体及稀释剂、赋形剂或载体。
[0064]在本发明的第三种配置中，提供了:
[0065]非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含:
[0066](a)免疫球蛋白重链基因座，其包含:
[0067](i)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段(任选重排的VLDJHCH或V λ DJHCH);或
[0068](ii)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段，其中所述人VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHI119.1 (VH3-15)、VHIIIVH26 (VH3-23),VH3-21,LSG6.ULSG12.1、DP77 (V3-21)、VH Hll、VHlGRR、ha3h2、VHI_halcl、VHII1-VH2-UVH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、Hvlfl0、VH4.11、71_4、VH251、VH1-69 及与其至少80%相同的基因区段；及
[0069](b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段及一或多个人J基因区段，任选其中轻链基因座如本发明第一种配置中的(b) (i)或(b) (ii)所述；
[0070]其中所述重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时小鼠能产生包含通过所述重链基因座的重组产生的重链和通过所述轻链基因座的重组产生的轻链的抗体。
[0071]在本发明的第四种配置中，提供了:
[0072]非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含:
[0073](a) (i)未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个JH基因区段，其中每个人VL基因区段是与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体轻链可变区的重排的VJ的人VL基因区段(或其突变体)相同的人基因区段，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；或者[0074](ii)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的重排的VJ区或VDJ区，其中重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VL基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VL基因区段与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体的轻链可变区的重排的VJ的人VL基因区段(或其突变体)相同，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；
[0075](b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段及一或多个人J基因区段；及
[0076](C)其中轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，及重链基因座中的基因区段或VJ或VDJ与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时小鼠能产生包含通过所述轻链基因座的重组产生的轻链及衍生自所述重链基因座的重链的抗体；
[0077](d)任选地，当应用(a)(i)时，重链基因座中每个所述VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段:νλ II基因家族成员、νλν?Ι4Α、νλ 112.K VAVII4A, VA I基因家族成员、VX 3 基因家族成员、IGLV1S2、νλ 3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、Vk I 基因家族成员、κ 1-15A(KL012), Vk II家族成员、Vk III家族成员、Vk I基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、Vk II A2(任选 A2a 等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及与其至少 80%相同的基因区段；
[0078](e)任选地，当应用(a) (ii)时，重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VL基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段:νλ II基因家族成员、νλν?Ι4Α、νλ 112.1、V λ VII4A、V λ I基因家族成员、νλ 3 基因家 族成员、IGLV1S2、VX 3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、V κ I基因家族成员、κ 1-15A(KL012), Vk II家族成员、Vk III家族成员、V κ I基因家族成员、κ Ι-15Α (KL012)、Vk II A2(任选 A2a 等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及与其至少 80% 相同的基因区段。
[0079]在本发明的第四种配置的一方面，所述脊椎动物或细胞的基因组对于重链基因座(a)⑴或(ii)是纯合的；任选其中:
[0080]-所述重链基因座的V基因区段库集由一或多个人VL基因区段组成，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段:νλ II基因家族成员、νλν?Ι4Α、νλ 112.1、νλ VII4A、νλ I 基因家族成员、νλ 3 基因家族成员、IGLV1S2、νλ 3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325, Vk I基因家族成员、κ Ι-15Α(KL012)、V κ II家族成员、Vk III家族成员、Vk I 基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、Vk II A2 (任选 A2a 等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及与其至少80%相同的基因区段；或者
[0081]-所述重链基因座的重组的VJ或VDJ库集由与通过人VL基因区段与人J基因区段及任选存在的人D基因区段重组产生的一或多个核苷酸序列相同的序列组成，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段:νλ II基因家族成员、νλ VII4A、νλ 112.1、νλν?Ι4Α、νλ I 基因家族成员、νλ 3 基因家族成员、IGLV1S2、νλ 3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325, Vk I基因家族成员、κ Ι-15Α(KL012)、V κ II家族成员、Vk III家族成员、Vk I 基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、Vk II A2 (任选 A2a 等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及与其至少80%相同的基因区段。
[0082]本发明提供了一种单克隆或多克隆抗体组合物，通过用抗原免疫前述任何配置或方面所述的至少一种脊椎动物(例如小鼠或大鼠)而制备，任选其中所述抗原是感染性疾病病原体抗原，任选其中相同抗原用于免疫所有脊椎动物；任选其中所述抗体是IgG型。
[0083]本发明还提供了分离的嵌合抗体以治疗和/或预防感染性疾病或病症，所述抗体包含非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)重链恒定区及结合感染性疾病病原体抗原的人可变区，其中所述抗体在包括用所述抗原免疫本发明的非人脊椎动物的方法中可获得或获得。
[0084]本发明还提供了分离的人抗体以治疗和/或预防感染性疾病或病症，所述抗体包含人重链恒定区及结合感染性疾病病原体抗原的人可变区，其中所述抗体在包括在转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在体内亲和性成熟抗体可变区的方法中可获得或获得，当所述可变区与所述脊椎动物重链恒定区(例如小鼠或大鼠重链恒定区)可操纵地连接时，通过(a)用所述抗原免疫本发明的脊椎动物，(b)分离编码本发明的嵌合抗体的核酸，(C)用编码人重链恒定区的核苷酸序列置换编码非人脊椎动物重链恒定区的核酸的核苷酸序列，产生编码人抗体的核酸，(d)在体外表达人抗体(任选从携带所述人核酸的CHO或HEK293细胞中表达)及(e)分离所述人抗体(任选进一步亲和性成熟所述抗体和/或产生其衍生物)。
[0085]本发明一方面提供了第一种和第二种人抗体的混合物，每个抗体均能结合感染性疾病病原体抗原(任选其中第一种抗体结合第一抗原，第二种抗体结合第二抗原，所述抗原来自相同病原体；或者其中所述抗原是相同的)。在一个实施方案中，使用共同轻链，其能简化抗体混合物的生产 。因此在混合物中提供了第一种抗体的轻链氨基酸序列，其与第二种抗体的轻链氨基酸序列相同，或者具有直至15个氨基酸改变。
[0086]本发明进一步提供了宿主细胞，其包含编码3或更多个第一种和第二种抗体重链和轻链的一或多个表达载体。
[0087]在本发明的第五种配置中，提供了:
[0088]合成的免疫球蛋白基因座，其包含一或多个可变和J基因区段(及任选存在的一或多个D基因区段)，与恒定区5’端可操纵地连接，其中所述基因座包含5’至3’ V(D) J排列，选自可以用如下一或多种排列(5’至3’ )构建的免疫球蛋白基因座:
[0089](a) [V(重链,λ 或 κ)]-[两转角(two-turn)RSS]-[ 一转角(one-turn)RSS]-[D]-[JH]，其中所述RSS是相反方向；
[0090](b) [VH]_[D]_ [两转角RSS]-[—转角RSS]-[J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0091](c) [VH]_[D]_ [—转角RSS]-[两转角RSS]-[J κ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0092](d) [VH或Vk ]_[两转角RSS]-[—转角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0093](e) [Vk ]-[—转角RSS]-[两转角RSS]-[JH或JX ]，其中所述RSS是相反方向；
[0094](f)[V(重链，λ 或 κ)]-[一转角 RSS]-[两转角 RSS] _[D] _[JH]，其中所述 RSS 是相反方向；
[0095](g) [VH]_[D]_ [—转角RSS]-[两转角RSS]-[J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0096](h) [VH]_[D]_ [两转角RSS]-[—转角RSS]-[J κ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0097]⑴[VH或Vk ]_[—转角RSS]-[两转角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0098](j) [Vk ]_[两转角RSS]-[—转角RSS] - [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向。[0099]在本发明的第六种配置中还提供了产生VH结构域、重链和具有长HCDR3长度的抗体的方式。在此，本发明提供了:
[0100]非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白D基因区段库集，其偏向于人D2和/或D3家族或者偏向于一、多个或所有人D基因区段，所述人D基因区段选自Dl-26、D2-2、D3_9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19。
[0101]非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，任选根据前述权利要求所述，其基因组包含人免疫球蛋白VH基因区段库集，其偏向于选自如下一组中的一个、多个或所有基因区段:VHl-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和VH7-4-1。
[0102]非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白JH基因区段库集，其偏向于人JH6。
[0103]单克隆或多克隆抗体组合物或者产生这种组合物的抗体生产细胞群，其中所述组合物或细胞群是通过用抗原免疫前述任何权利要求所述至少一种脊椎动物而制备的，其中所述抗体具有人重链可变区，当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变(junctional mutation);其中所述组合物包含至少一种抗原特异性抗体,其具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3 (根据MGT )。
[0104]包含一或多个重链的抗体重链库集(例如由抗体提供)，其可变结构域HCDR3的长度为至少20个氨基酸(根据MGT)，衍生自人VH、D和JH的重组，其中所述VH选自:
[0105]VHl-2*02、VH1_3*01、VH1_8*01、VH1_18*01、VH2_5*10、VH3_7*01、VH3_9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01 和 VH7-4_1*01，以及
[0106]所述D选自:
[0107]D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01 和 D3_22*01，或者
[0108]D2-2*02、D3-9*01 和 D3_10*01，或者
[0109]D3_9*01 和 D3_10*01，或者
[0110]D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19，或者
[0111]Dl-26*01、 D2-2*02、 D3_9*01、 D3_10*01、 D3_22*01、 D4_17*01、 D6_13*01 和D6-19*01，或者
[0112]D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19，或者 D2_2*02、D3_9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01 和 D6_19*01，或者
[0113]Dl-26、D2-2、D3-10 和 D6-19，或者
[0114]D2-2、D3_9 和 D3-10 ;并且
[0115]任选JH 是 JH6 (例如 JH6*02)；
[0116]其中
[0117](a)所述重链可变结构域已经在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在体内产生；和/或[0118](b)所述重链可变结构域当与相应人种系V、D和J序列相比时包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变。
[0119]附图简沭
[0120]图1-3:例证了产生重组工程BAC载体以将V基因区段加入小鼠基因组中的方案示意图；
[0121]图4:例证了使用相继重组酶介导的盒交换(sRMCE)将V基因区段加入小鼠基因组中的方案示意图；
[0122]图5(4部分):仅示出可变(V)编码区的13个IGHV1-69等位基因的比对。与VH1-69等位基因*01不同的核苷酸在适当位置标示，而相同的核苷酸用破折号标示。在核苷酸改变导致氨基酸不同的情况中，编码的氨基酸在相应三联体上示出。方框区相应于CDR1、CDR2 和 CDR3；
[0123]图6 =RSS结构及重组示意图。
[0124]发明详沭
[0125]人V、D和J基因区段的来源是细菌人工染色体(RPC1-11BAC)，得自Roswell ParkCancer Institute (RPCI) /Invitrogen0 见 http: //bacpac.chor1.0rg/hmalell.htm,其描述了如下的BAC:
[0126]RPC1-1l 人男件 BACf 库
[0127]RPC1-11 人男性 BAC 文库(Osoegawa et al.，2001)使用由 Kazutoyo Osoegawa 开发的改良的克隆技术构建(Osoegawa et al.，1998)。所述文库由Kazutoyo Osoegawa产生。构建由 National Human Genome Research Institute (NHGRI, NIH) (#1R01RG01165-03)提供资金。这个文库根据新的 NHGRI/D0E〃Guidance on Human Subjects in Large-ScaleDNA Sequencing 产生。
[0128]“男性血液通过双盲选择方案获得。男性血液DNA分离自一个随机选择的供体(在10个男性供体中)”。
[0129].0soegawa K, Mammoser AG, Wu C, Frengen E, Zeng C，Catanese JJ, de Jong PJ ；Genome Res.200IMar ;11 (3):483-96 ;〃A bacterial artificial chromosome library forsequencing the complete human genome〃 ；
[0130].0soegawa, K., ffoon, P.Y., Zhao, B., Frengen, E., Tateno, M., Catanese, J.J, and de Jong, P.J.(1998) ;〃An Improved Approach for Construction of BacterialArtificial Chromosome Libraries" ；Genomics52, 1-8.[0131]作为抗体基因区段序列的来源，技术人员也意识到如下可利用的数据库和资源(包括其更新材料):
[0132]1.1.Kabat 数据库(G.Johnson and T.T.ffu, 2002:http: //www.kabatdatabase.com)。由E.A.Kabat和T.Τ.Wu在1966年产生，Kabat数据库公开了抗体、T-细胞受体、主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类分子及其它免疫学感兴趣的蛋白质的排列对比的序列。可搜索的界面由SeqhuntII工具提供，可获得关于序列排列对比、序列子群分类及产生变异性作图(variability plot)的效用范围。也见Kabat, E.A.，Wu, T.T., Perry,H., Gottesman, K., and Foeller, C.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th ed., NIH Publication N0.91-3242, Bethesda, MD 所述，该文献并入本文作参考，特别是参考人基因区段用于本发明。
[0133]1.2.KabatMan (A.C.R.Martin, 2002:http: //www.bioinf.0rg.uk/abs/simkab.html)。这是产生简单查询Kabat序列数据库的网页。
[0134]1.3.1MGT, the International ImMunoGeneTics Information , System?; Μ.-P.Lefranc, 2002:http: //imgt.cines.fr)。IMGT是一个整合的信息系统,其专攻所有脊椎动物物种的抗体、T细胞受体和MHC分子。其提供了标准化数据的一个公共端口，包括核苷酸和蛋白质序列、寡核苷酸引物、基因作图、遗传多态性、特异性及二维(2D)和三维(3D)结构。MGT 包括三个序列数据库(MGT/LIGM-DB、IMGT/MHC-DB, MGT/PRMERDB)，一个基因组数据库(MGT/GENE-DB)，一个3D结构数据库(MGT/3D结构-DB)，及一系列网站资源("IMGT Marie-Paule page〃)和交互工具。
[0135]1.4V-BASE (1.M.Toml in son, 2002 ；http: //www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASE是从1000个以上的公开序列中汇编的所有人抗体种系可变区序列的综合目录。其包括排列软件DNAPL0T (由Hans-Helmar Althaus和Werner Muller开发),其使得可以将重排的抗体V基因分配给其最接近种系基因区段。
[0136]1.5.Antibodies—Structure and Sequence (A.C.R.Martin, 2002:http: //www.bioinf.0rR.uk/abs)。这个网页概括了关于抗体结构和序列的有用信息。其提供了 Kabat抗体序列数据的查询界面，关于抗体的一般信息，、晶体结构及与其它抗体相关信息的链接。其还指示Protein Databank(PDB)中保藏的所有抗体结构的自动化摘要。特别感兴趣的是其全面描述和对比了抗体可变区的各种编号方案。
[0137]1.6.AAAAA—AHo，s Amazing Atlas of Antibody Anatomy (A.Honegger, 2001 ；http://www.unizh.ch/~antibody)。这个资源包括结构分析、建模及工程化的工具。其采用一致的方案综合抗体和T细胞受体序列的结构排列，包括抗体分析和图示的Excelmacros。
[0138]1.7.WAM—Web Antibody Modeling (N.Whitelegg and A.R.Rees, 2001:http: //antibody, bath, ac.uk)。 由 the Centre for Protein Analysis and Design at theUniversity of Bath, United Kingdom 主持。基于 AbM 程序包(先前由 Oxford Molecular销售)构建抗体Fv序列的3D模型，组合使用确立的理论方法，这个网站还包括最新的抗体结构信息。
[0139]1.8.Mike，s Immunoglobulin Structure/Function Page (M.R.Clark, 2001 ；http: //www.path, cam, ac.uk/ ~mrc7/mikeimages, html)。这些网页提供了关于免疫球蛋白结构和功能的教育材料，通过许多彩色图片、模型和动画例证。可获得关于抗体人源化和Mike Clark’s Therapeutic Antibody Human Homology Project 的另外信息,其关注于使临床效力和抗免疫球蛋白应答与治疗性抗体的可变区序列相关联。
[0140]1.9.The Antibody Resource Page(The Antibody Resource Page, 2000:http://WWW, antibodyresourc e.com)。这个网站描述了其自身作为“抗体研究和供应的完全指导”。与氨基酸测序工具、核苷酸抗体测序工具链接，提供了杂交瘤/细胞培养数据库。
[0141]1.9.Humanization bY Design (J.Saldanha, 2000:http: //people, cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07S)。这个资源提供了关于抗体人源化技术的综述。最有用的特征是超过40个公开的人源化抗体的可搜索数据库(通过序列和文本)，包括关于人源化构建体的设计问题、构架选择、构架回复突变及结合亲和性的信息。
[0142]也见AntibodyEngineering Methods and Protocols, Ed.Benny K C Lo, Methodsin Molecular Biology?, Human Press 所述。见 http: / / www.blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdf o
[0143]在本说明书中的一个实施方案中，“种系”是指规范的种系基因区段序列。
[0144]本发明涉及提供在免疫球蛋白重链和轻链基因座中的新的V、D和J配对。提供了新的、偏向的抗体多样性及潜在扩展的多样性。本发明的一方面在体内在抗体V(D)J重组期间利用相容的重组信号序列(RSS)的天然配对，本发明的这个方面提供了使用RSS相容性观测结果的V、D和J基因区段的新的合成组合。
[0145]本发明另一方面基于在针对感染性疾病病原体产生的天然发生的人抗体中V、D和J的使用偏向的观测。本发明可用于在转基因非人动物中操纵抗体基因多样性，由此提供新的及潜在扩展的多样性或者偏向于抗体共同的可变基因使用的多样性，可用于治疗和/或预防某些疾病或病症，如感染性疾病。这个偏向抗体库集的能力还提供了简化抗体混合物生产的方法，如在希望靶向多个病原体抗原的多克隆方法中可用于治疗和/或预防感染性疾病的多克隆抗体治疗剂。为此，本发明还提供了双特异性抗体，其能结合一种以上的抗原(例如由相同病原体表达的多个感染性抗原)，因此提供了使用多克隆抗体混合物不可能的优势(如生产 、给药剂量和施用优势)。
[0146]本发明提供了脊椎动物和细胞，如转基因小鼠或大鼠或者转基因小鼠或大鼠细胞。此外，本发明涉及使用所述脊椎动物分离抗体或编码抗体的核苷酸序列的方法。本发明还提供了抗体、核苷酸序列、药物组合物及应用。
[0147]为此，本发明在第一种配置中提供了:
[0148]非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含:
[0149](a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段(任选多个VH)、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；任选其中重链基因座如下述第二种配置中的(a)所述；及
[0150](b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含:
[0151](i)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段和一或多个人J基因区段(任选重排的VhJlCl或VhJa Cl，其中(^是(^或(^);或者
[0152](ii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人Jh基因区段(任选重排的'01(^或￥；^1(^，其中(^是(^或1);或者
[0153](iii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段及一或多个人叉基因区段，所述VL基因区段选自如下一组中:VA II基因家族成员、VaVII4A、Va 112.1、VaVII4A、Va I基因家族成员、νλ3 基因家族成员、IGLV1S2、Vx3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、Vk I基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、VkII家族成员、VkIII家族成员、VkI基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、VKIIA2(任选 A2a 等位基因)、VKA27(Humkv325)及与其至少 80%相同的基因区段；任选一或多个VL基因区段选自下文的列表A1、A2、A1.UAL 2、A2.1、A2.2、A2.3或 Α2.4。[0154]其中所述重链基因座中基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中基因区段与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时小鼠能产生包含通过所述重链基因座的重组产生的重链及通过所述轻链基因座的重组产生的轻链的抗体。
[0155]本发明的这个配置因此在转基因非人脊椎动物如小鼠或大鼠中提供了新的、合成的抗体和基因库集的可能性。这种新的库集是需要的，因为其提供了新抗体库的可能性，从中在用预定抗原免疫脊椎动物之后可以选择先导抗体。这因此提供了可以从中分离具有希望特性的抗体的库，例如对于特异性靶抗原结合具有相对高亲和性的抗体。希望的是可以从免疫的脊椎动物中直接分离高亲和性抗体，因为这样可以提供可潜在用作治疗和/或预防性药物的抗体前导，而不需要进一步大量的亲和性成熟(例如通过体外抗体展示如核糖体展示或者噬菌体展示)。可以根据需要对抗体的效应子部分进行修饰(例如恒定区的人源化)，而不需要操纵可变区的序列。或者，或此外，抗体的库可以允许选择具有希望的生物物理学特性和/或表位特异性的先导抗体。后者对于发现针对如下表位的先导抗体是重要的，所述表位是先前未产生治疗性 和/或预防性抗体的表位或者难以由携带转基因免疫球蛋白基因座的先前非人脊椎动物产生的抗体基因多样性产生的抗体达到的，例如基于由RPC1-1IBAC所示的单个人基因座的那些。
[0156]本发明的细胞(根据本发明任何方面或配置)是例如B细胞、杂交瘤或干细胞，任选胚胎干细胞或者造血干细胞。一方面，所述ES细胞衍生自小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系。一方面，所述非人脊椎动物是啮齿类动物，优选小鼠，及本发明的细胞是啮齿类动物细胞或ES细胞，适当的是小鼠ES细胞。本发明的ES细胞可用于产生动物，使用本领域熟知的技术进行，包括将ES细胞注射进胚泡中，随后将嵌合的胚泡植入雌性动物中以产生可以繁殖的后代，针对具有需要插入的纯合重组体进行选择。一方面，本发明涉及包含ES细胞衍生的组织及宿主胚胎衍生的组织的转基因动物。一方面，本发明涉及遗传改变的后代动物，包括具有对于VDJ和/或VJ区是纯合重组体的动物。
[0157]携带如(b) (i)和(ii)所述一或多个轻链基因座的脊椎动物提供了新的及潜在扩展的抗体和基因库集，通过采用合成的非天然发生的免疫球蛋白基因区段(V、D、J、C)组合而成。在这方面，本发明人意识到提供混合重链基因区段与轻链基因座那些基因区段的抗体和基因库集的需求和可能性。这基于本发明人的观测结果:首先，自然提示具有VH-VH或VL-VL配对(与更经典的VH-VL配对相反)的功能性抗体的可能性。例如，参见骆驼科(Camelidae)的重链抗体，其产生具有配对的VH结构域及缺乏轻链VL结构域的抗体(例如见 Nature.1993Jun3 ;363 (6428): 446-8 ;NaturalIy occurring antibodies devoid oflight chains ;Hamers_Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，HamersC, Songa EB, Bendahman N, Hamers R)。这些抗体发挥特异性结合抗原的功能,这种抗体在这种骆驼科动物(例如美洲骆驼，骆驼，羊驼)的血液中发现。具有VH配对的这种抗体也可以是合成产生的，以提供治疗性和预防性药物(见例如W01994004678、W02004041862、W02004041863所述)。转基因小鼠也可以产生这种重链抗体，以及所述抗体的体内产生使得小鼠的免疫系统可以选择VH-VH配对，有时选择其中已经在体内由小鼠导入突变的这种配对以适应配对(W02010109165A2)。因此，本发明人认识到采用体内抗体产生系统(而不是体外系统如抗体的噬菌体或核糖体展示)可以适应于本发明设想的合成的免疫球蛋白基因区段组合。[0158]本发明人的第二个观测结果在于天然发生的免疫球蛋白基因座的结构，特别是介导体内V(D) J重组的重组信号序列(RSS)的排列(见例如Cell.2002Apr ；109Supp1:S45-55.The mechanism and regulation of chromosomal V (D) Jrecombination ；Bassing CH, Swat ff, Alt FW,所述文献并入本文作参考)。如图6所例证，已经鉴别了两种类型的RSS元件:一转角RSS(12-RSS)和两转角RSS(23_RSS)。自然地，λ轻链基因座中的VJ重组，如果在位于V λ的3’端的两转角RSS与位于JA的5’端的一转角RSS之间发生重组，RSS是相反方向。自然地，在κ轻链基因座中的VJ重组，如果在位于Vk的3’端的一转角RSS与位于J κ的5’端的两转角RSS之间发生重组，RSS是相反方向。自然地，在重链基因座中的VD重组，如果在位于VH的3’端的两转角RSS与位于D的5 ’端的一转角RSS之间发生重组，RSS是相反方向。自然地，在重链基因座中的DJ重组，如果在位于D的3’端的一转角RSS与位于JH的5’端的两转角RSS之间发生重组，RSS是相反方向。因此，通常两转角RSS与相反方向的一转角RSS相容。本发明人认识到可以使用这个观测结果构建转基因免疫球蛋白基因座，由此当以相反方向提供两转角RSS与一转角RSS时，5’基因区段可以与3’基因区段重组(例如V与J ;或者V与D)，每个RSS邻近各自的一个基因区段。因此，本发明人认识到，在一个实施方案中，免疫球蛋白基因座可以用一或多个如下排列方式构建(5，至3’):
[0159](k)[V(重链，λ 或 κ)]-[两转角 RSS]-[—转角 RSS] _[D]-[JH]，其中所述 RSS 是相反方向；
[0160](I) [VH]_[D]_ [两转角RSS]-[—转角RSS]-[J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0161](m) [VH]_[D]_ [—转角RSS]-[两转角RSS]-[J κ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0162](n) [VH或Vk ]_[两转角RSS]-[—转角RSS]-[J λ ]，其中所述RSS是相反方向； [0163](ο) [Vk ]_[—转角RSS]-[两转角RSS] - [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0164](P) [V (重链，λ 或 κ)]-[一转角 RSS]-[两转角 RSS] _[D]-[JH]，其中所述 RSS 是相反方向；
[0165](q) [VH]_[D]_ [—转角RSS]-[两转角RSS] _ [J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0166](r) [VH]_[D]_ [两转角RSS]-[—转角RSS]-[J κ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0167](s) [VH或Vk ]_[—转角RSS]-[两转角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0168](t) [Vk ]_[两转角RSS]-[—转角RSS] - [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向。
[0169]技术人员将认识到可以使用标准分子生物学技术提供包含RSS与V、D或J的合成组合的载体用于本发明的这个方面中，由此所述载体可用于构建转基因免疫球蛋白基因座(例如使用本领域已知的同源重组和/或重组酶介导的盒交换，例如见 US7501552 (Medarex)、US5939598 (Abgenix)、US6130364 (Abgenix)、W002/066630 (Regeneron)、W02011004192 (Genome Research Limited)、W02009076464、W02009143472和W02010039900 (Ablexis)所述，所述文献在此并入本文作参考。例如，可以使用标准重组工程技术在大肠杆菌中产生RSS与基因区段的这种合成组合以构建携带所述合成组合的BAC载体,之后使用同源重组或RMCE (例如使用cre/lox位点特异性重组)插入胚胎干细胞中。关于重组工程的详细描述可见于www.genebridges.com及在EP1034260和EP1204740中所述，所述文献在此并入本文作参考。
[0170]在(b) (i)的一个实施方案中，所有轻链基因座V基因区段均是人VH基因区段(任选具有一或多个人V λ基因区段)。
[0171]在(b)⑴的一个实施方案中，所述恒定区是小鼠、大鼠或者人CL，如CX。在一个实施方案中，J和恒定区均由一或多个人JX CA提供。
[0172]尽管通常对任何抗原和疾病均有效，但是携带(b) (iii)的一或多个轻链基因座的脊椎动物是有益的，特别用于产生针对感染性疾病病原体的抗体前导。在这方面，本发明人认识到提供抗体和基因库集的需要性和可能性，其偏向于通常见于人对感染性疾病病原体的天然抗体反应中的免疫球蛋白基因区段。本发明人认识到希望的是提供脊椎动物、细胞、方法等用于基于对抗原如感染性疾病病原体的抗原的天然人免疫应答产生治疗性和/或预防性抗体。在这个方面，所述文献观测通常使用免疫球蛋白基因区段在人体中产生抗感染性应答(表1)。
[0173]表1:在针对感染性疾病病原体的人抗体应答中免疫球蛋白基因使用
[0174]
【权利要求】
1. 非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白D基因区段库集，所述人免疫球蛋白D基因区段库集偏向于人 D2 和 / 或 D3 家族或者偏向于选自 D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和D6-19的一个、多个或者所有人D基因区段。
2.权利要求1的脊椎动物或细胞，其中所述D基因区段库集由或者基本由选自D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19 的 I 个、2 个或者 3 个人基因区段组成。
3.权利要求1或2的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，所述未重排的免疫球蛋白重链基因座包含(5’至3’方向)人VH、D和JH基因区段，并且权利要求1中所述的人D基因与所述VH基因区段由不超过4个其它D基因区段(例如无D基因区段)间隔开。
4.前述任何权利要求的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，所述未重排的免疫球蛋白重链基因座包含所述人D基因区段，并且在所述基因座中在所述人D基因区段之间无其它D基因区段。
5.前述任何权利要求的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含选自Dl-26、D2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19 的人 D 基因区段的三个或更多个拷贝。
6.权利要求5的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含选自Dl-26、D2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19的第一个和第二个人D基因区段，其中所述第一个D基因区段以三或更多个拷贝存在及其中第二个D基因区段以三或更多个拷贝存在。
7.前述任何权利要求的脊椎动物或细胞，其中D基因区段选自D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01 和 D3-22*01，或者选自 Dl_26*01、D2_2*02、D3_9*01、D3_10*01、D3_22*01、D4-17*01、D6-13*01 和 D6_19*01。
8.非人脊椎动物(如小鼠或大鼠)或者非人脊椎动物细胞(如小鼠细胞或大鼠细胞)，任选根据前述任何权利要求的非人脊椎动物(如小鼠或大鼠)或者非人脊椎动物细胞(如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白VH基因区段库集，其偏向于选自如下一组中的一个、多个或所有基因区段:VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2_5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和 VH7-4-1。
9.权利要求8的脊椎动物或细胞，其中所述VH基因区段库集基本上由或基本上由选自如下一组中的I个、2个或3个人基因区段组成:VHl-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和VH7-4-1。
10.权利要求8或9的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，所述未重排的免疫球蛋白重链基因座包含(5’至3’方向)人VH、D和JH基因区段，所述人VH基因区段与所述D基因区段由不超过4个其它VH基因区段(例如无VH基因区段)间隔开。
11.权利要求8-10任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，所述未重排的免疫球蛋白重链基因座包含所述人VH基因区段，并且在所述基因座中在所述人VH基因区段之间无其它VH基因区段。
12.权利要求8-11任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含选自如下一组中的人 VH 基因区段的 3 个或更多个拷贝:VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2_5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和 VH7-4-1。
13.权利要求12的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含选自如下一组中的第一个和第二个人 VH 基因区段:VHl-2、VHl-3、VHl-8、VHl-18、VH5-51、VHl-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和 VH7-4-1，其中第一个 VH 基因区段以3或更多个拷贝存在及其中第二个VH基因区段以3或更多个拷贝存在。
14.权利要求8-13任一项的脊椎动物或细胞，其中所述VH基因区段选自如下一组中:VHl-2*02, VH1-3*0U VH1-8*0U VH1-18*0U VH2-5*10, VH3_7*01、VH3-肿01、VH3_11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3_23*04、VH4_4*02、VH6_1*01 和 VH7-4_1*01。
15.权利要求8-16任一项的脊椎动物或细胞，其包含具有选自所述组的VH基因区段的2或更多个拷贝的免疫球蛋白重链基因座。
16.任何权利要求的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含由一或多个人JH6基因区段组成的人JH基因区段库集。
17.前述任何权利要求的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含偏向于JH6、任选JH6*02的人免疫球蛋白JH基因区段库集。
18.权利要求17的脊椎动物或细胞，其中所述JH基因区段库集由或者基本上由3或更多个人JH6基因区段组成。
19.前述任何权利要求的脊椎动物或细胞，其中每个所述人基因区段的序列是人种系基因区段序列。
20.前述任何权利要求的脊椎动物或细胞，其中一个、多个或所有选择的基因区段以2或更多个拷贝存在于基因组中，所述拷贝是彼此的变体。
21.前述任何权利要求的脊椎动物或细胞，其中所述人基因区段由纯合免疫球蛋白重链基因座提供。
22.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白VH基因区段库集、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段，其中所述VH库集不包含选自如下一组中的一个、多个或所有VH基因区段:VHl-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和 VH7-4-1。
23.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白D基因区段库集、一或多个人VH基因区段及一或多个人JH基因区段，其中所述D库集不包含选自如下一组中的一个、多个或所有D基因区段:Dl-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19。
24.权利要求22或23的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含人JH基因区段库集，所述人JH基因区段库集不包含JH6。
25.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含偏向于人JH6的人免疫球蛋白JH基因区段库集。
26.权利要求25的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，所述未重排的免疫球蛋白重链基因座包含多个人JH6基因区段，任选其中所述基因组对于所述基因座是纯合的。
27.权利要求26的脊椎动物或细胞，其中所述重链基因座包含(5’至3’方向)人VH、D和JH基因区段，所述JH6基因区段与所述D基因区段由不超过两个其它JH基因区段间隔开。
28.权利要求25、26或27的脊椎动物或细胞，其中在所述基因座中在所述人JH6基因区段之间中无其它JH基因区段。
29.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或 者非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白JH基因区段库集，所述人免疫球蛋白JH基因区段库集由一或多个人JH6基因区段组成。
30.权利要求25-29任一项的脊椎动物或细胞，其中所有所述基因区段均是人种系基因区段。
31.权利要求25-30任一项的脊椎动物或细胞，其包含不同的变体JH6基因区段。
32.权利要求25-31任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因区段由纯合的免疫球蛋白重链基因座提供。
33.单克隆或多克隆抗体组合物或者用于产生这种组合物的抗体生产细胞群，其中所述组合物或细胞群是通过用抗原免疫任何前述权利要求的至少一种脊椎动物而制备的，其中所述抗体具有人重链可变区，当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变；其中所述组合物包含至少一种具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3 (根据MGT)的抗原特异性抗体。
34.特异性结合抗原的分离的抗体，所述抗体包含人重链可变区和非人恒定区，其中所述可变区衍生自(i)选自权利要求8中列举的一组中的人VH基因区段与(ii)选自权利要求I中列举的一组中的人D基因区段及与人JH基因区段(任选JH6)在非人脊椎动物中的重组；其中所述抗体具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3(根据MGT);当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变。
35.权利要求34的抗体，其中所述抗体得自或可得自权利要求1-32任一项的脊椎动物。
36.分离结合预定抗原的抗体的方法，所述方法包括: (a)提供权利要求1-32任一项的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)； (b)用所述抗原免疫所述脊椎动物； (c)从所述脊椎动物取出B淋巴细胞，选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞； (d)任选使所述选择的B淋巴细胞或者其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤而永生化；及 (e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)。
37.权利要求36的方法，其中在步骤(e)中，所述抗体具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3 (根据 MGT)。
38.权利要求36或37的方法，包括从所述B淋巴细胞中分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选地用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体的可变区；以及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。
39.权利要求36、37或38的方法，进一步包括产生通过所述方法产生的抗体的拷贝、突变体或衍生物(例如人源化形式)。
40.权利要求33-39任一项的抗体组合物、细胞群、抗体或方法，其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原，任选其 中所述病原体是病毒或细菌。
41.权利要求40的抗体组合物、细胞群、抗体或方法，其中病原体选自流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、疱疹病毒科病毒、巨细胞病毒(CMV)、HIV和流感病毒。
42.权利要求33-41任一项的抗体组合物、细胞群、抗体或方法，其中所述抗原是HIVgpl20抗原或者HIV gp41抗原。
43.权利要求33-40任一项的抗体组合物、细胞群、抗体或方法，其中所述抗原包含活性位点或裂缝，其中所述具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3的抗体特异性结合所述抗原的活性位点或裂缝。
44.包含权利要求33-35及40-43任一项的抗体或抗体组合物或者由权利要求36-38任一项的方法产生的抗体的药物组合物，用以治疗和/或预防人感染性疾病(例如其中所述感染性疾病是由选自如下的病原体所致:流感嗜血杆菌，大肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏菌，疱疹病毒科病毒，巨细胞病毒(CMV)，HIV和流感病毒)。
45.抗体重链的库集(例如由抗体提供)，其包含一或多个衍生自人VH、D和JH的重组的重链，所述重链的可变结构域HCDR3的长度为至少20个氨基酸(根据MGT)，其中 VH选自如下一组:
VHl-2*02, VH1-3*01, VH1-8*01, VH1-18*01, VH2-5*10, VH3-7*01, VH3_9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01 和 VH7-4_1*01，及D选自如下一组: D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01 和 D3_22*01，或者 D2-2*02、D3-9*01 和 D3_10*01，或者 D3-9*01 和 D3-10*01，或者 Dl-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19，或者 D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01 和 D6_19*01，或者
D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19，或者 D2_2*02、D3_9*01、D3_10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01 和 D6_19*01，或者Dl-26、D2-2、D3-10 和 D6-19，或者D2-2、D3-9 和 D3-10 ； 任选地，JH是JH6 (例如JH6*02)； 其中 (a)所述重链可变结构域已经在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在体内产生；和/或(b) 所述重链可变结构域当与相应人种系V、D和J序列相比时包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变。
46.编码权利要求45的重链库集的核酸集合。
47.获得抗原特异性重链(例如由抗体提供)的方法，所述方法包括将权利要求45的库集暴露于预定抗原并选择特异性结合所述抗原的一或多个重链，其中一或多个重链是分离的，具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3。
48.非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含: (a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段，任选其中所述重链基因座如权利要求81的(a)所述；及 (b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含: (i)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段及一或多个人J基因区段(任选重排的VhJA或VhJaQ，其中Q是Ca或CO ;或者 (ii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人Jh基因区段(任选重排的VlDJhCl或VxDJhCl,其中Cl是Ca或C K);或者 (iii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段及一或多个人叉基因区段，所述一或多个人VL基因区段选自如下一组中:VAII基因家族成员，VaVII4A, νλΙΙ2.1，VaVII4A,VaI 基因家族成员，νλ3 基因家族成员，IGLV1S2, VA3-cML70, lalh2, lalvl, Ia3h3, Kv325,Vk I基因家族成员，κ 1-15A(KL012), Vk II家族成员，VkIII家族成员，Vk I基因家族成员，K 1-15A(KL012)，VKII A2 (任选 A2a 等位基因)，VkA27 (Humkv325)及与其至少 80%相同的基因区段； 其中重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含由重链基因座重组产生的重链和由轻链基因座重组产生的轻链的抗体。
49.权利要求48的脊椎动物或细胞，其中在(b)(i)中，轻链基因座的J基因区段是夂基因区段，及任选轻链基因座的恒定区是λ恒定区；或者在(b) (ii)中，，及任选轻链基因座的恒定区是λ恒定区。
50.权利要求48或49的脊椎动物或细胞，其中 在(b) (i)中，轻链基因座的V基因区段库集包含或由一或多个VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中:VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)，VhIV 基因家族成员，VhI 119.1 (VH3-15)，VhIII VH26 (VH3-23), VH3_21，LSG6.1，LSG12.1，DP77(V3-21), Vh Hll, VH1GRR, ha3h2, VHI_halcl，VhII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3,Hvl051, 71-2，Hvlf 10，VH4.11，71-4，VH251，VH1-69 及与其至少 80%相同的基因区段;或者 在(b) (iii)中，轻链基因座V基因区段库集由VL基因区段类型(任选及其一或多个突变体)组成，其中所述VL基因区段选自所述一组VL基因区段。
51.权利要求48-50任一项的脊椎动物或细胞，其中在(a)中，所述恒定区是重链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区和/或在(b)中，所述恒定区是轻链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
52.权利要求48-51任一项的脊椎动物或细胞，其中内源性重链和轻链表达已经被失活。
53.非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含: (a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段 '及 (b)(i)未重排的免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段和一或多个人J基因区段，其中每个人VH基因区段是与用于产生重排的VDJ的人VH基因区段(或其突变体)相同的人基因区段，所述重排的VDJ编码来自抗体表达细胞的人抗体的重链可变区，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；或者 (ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的重排的VJ区或VDJ区，其中重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VH基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VH基因区段与用于产生重排的VDJ的人VH基因区段(或其突变体)相同，所述重排的VDJ编码来自抗体表达细胞的人抗体的重链可变区，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)； (C)其中重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，轻链基因座中的基因区段或VJ或VDJ与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含通过重链基因座重组产生的重链和衍生自轻链基因座的轻链的抗体； (d)任选地，当应用(b)(i)时，轻链基因座中每个所述VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)，VHIV基因家族成员，VHI119.1(VH3-15),VHIII VH26(VH3-23), VH3-21,LSG6.1,LSG12.1,DP77(V3-21),VH Hll,VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051,71-2, Hvlf10, VH4.11，71-4，VH251，VH1-69及与其至少80%相同的基因区段； (e)任选地，当应用(b)(ii)时，重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VH基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)，VHIV基因家族成员，VHIII9.1(VH3-15),VHIII VH26(VH3-23), VH3-21, LSG6.1,LSG12.1,DP77(V3-21),VH Hll,VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051，71_2，HvlflO, VH4.11，71-4，VH251，VH1-69及与其至少80%相同的基因区段。
54.权利要求53的脊椎动物或细胞，其中轻链基因座的J基因区段是Ja基因区段，任选轻链基因座的恒定区是λ恒定区。
55.权利要求53或54的脊椎动物或细胞，其中轻链基因座的V基因区段库集包含或者由人VH1-69基因区段组成。
56.权利要求53、54或55的脊椎动物或细胞，其中在(a)中，所述恒定区是重链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
57.权利要求53、54、55或56的脊椎动物或细胞，其中在(b)中，所述恒定区是轻链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
58.权利要求53-57任一项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于轻链基因座(b) (i)或(ii)是纯合的，任选其中: -轻链基因座的V基因区段库集由选自如下一组中的一或多个人VH基因区段组成:VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)，VHIV基因家族成员，VHI119.1(VH3-15),VHIII VH26(VH3-23), VH3-21,LSG6.1,LSG12.1,DP77(V3-21),VH Hll,VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051, 71-2, HvlflO, VH4.11，71-4，VH251，VH1-69及与其至少80%相同的基因区段；或者 -轻链基因座的重组VJ或VDJ库集由与通过人VH基因区段与人J基因区段及任选存在的人D基因区段重组产生的一或多个核苷酸序列相同的序列组成，所述人VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)，VHIV基因家族成员，VHI119.1 (VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23), VH3-21, LSG6.1，LSG12.1，DP77(V3_21)，VH Hll, VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051，71_2，HvlflO,VH4.11，71-4，VH251，VH1-69及与其至少80%相同的基因区段。
59.权利要求53-58任一项的脊椎动物或细胞，其中内源性重链和轻链表达已经被失活，及其中权利要求53-58任一项的轻链基因座是在所述脊椎动物或细胞的基因组中唯一的功能性轻链基因座。
60.权利要求53-59任一项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白轻链基因座如权利要求53中(b) (i)所述，并且包含仅一个人VH基因区段，所述人VH基因区段选自如下一组中=VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)，VHIV 基因家族成员，VHI1 19.1 (VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23), VH3-21, LSG6.1，LSG12.1，DP77(V3-21), VH Hll, VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051,71-2，HvlflO, VH4.11,71-4, VH251，VH1-69及与其至少80%相同的基因区段，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链是纯合的，由此所有轻链基因座均包含相同的单个人VH基因区段。
61.权利要求53-59任一项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白轻链基因座如权利要求53中(b) (ii)所述，包含仅一个重排的VJ或VDJ区，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链是纯合的，由此所有轻链基因座均包含相同的单个重排的VJ或VDJ区。
62.权利要求60或61的脊椎动物或细胞，其中每个免疫球蛋白轻链基因座进一步包含VH基因区段或重排的区域，其分别是所述选择的人VH基因区段或重排的区域的突变体，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链突变体VH基因区段或者重排的区域是纯合的。
63.权利要求60的脊椎动物或细胞，其中每个免疫球蛋白轻链基因座包含选自所述一组中的仅两个人VH基因区段，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述两个轻链人VH基因区段是纯合的。
64.权利要求61的脊椎动物或细胞，其中每个免疫球蛋白轻链基因座包含仅两个所述重排的VJ或VDJ区，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述两个轻链重排的VJ或VDJ区是纯合的。
65.单克隆或多克隆抗体组合物，通过用抗原免疫权利要求48-64任一项的至少一种脊椎动物(例如小鼠或大鼠)而制备，任选其中所述抗原是感染性疾病病原体抗原，任选其中相同抗原用于免疫所有脊椎动物，任选其中所述抗体是IgG型。
66.分离结合预定抗原的抗体的方法，所述方法包括: (a)提供权利要求48-64任一项的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)； (b)用所述抗原免疫所述脊椎动物(任选其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原)； (c)从脊椎动物取出B淋巴细胞并选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞； (d)任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤而进行永生化；及 (e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)。
67.权利要求66的方法，包括从所述B淋巴细胞中分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体的可变区；以及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。
68.权利要求66或67的方法,进一步包括产生通过权利要求66或67的方法产生的抗体的突变体或衍生物。
69.产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行权利要求66-68任一项的方法，通过用抗原分别免疫第一和第二脊椎动物(任选第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)并组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))应用如下步骤: (i)用相同抗原或不同抗原免疫脊椎动物(任选其中所述不同抗原是由相同病原性生物体(或其家族成员)表达的)); (ii)在免疫之前，所述脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因)及任选存在的相同的J库集；任选所述哺乳动物的轻链基因座在免疫之前是相同的； (iii)在免疫之前，所述脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选所述脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。
70.产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行权利要求66-68任一项的方法，通过用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)并组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合(（i）和(ii);或者（i）和(iii))应用如下步骤: (i)所述抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达； (ii)在免疫之前，所述脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因)及任选存在的相同的J库集；任选所述哺乳动物的轻链基因座在免疫之前是相同的； (iii)在免疫之前，所述脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选所述脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。
71.产生能表达多克隆抗体混合物的宿主细胞的方法，所述方法包括，在权利要求67的方法中: (a)用第一和第二抗原(任选其中不同抗原由相同病原体生物体(或其家族成员)表达)免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)； (b)从所述脊椎动物B淋巴细胞中分离编码第一种和第二种抗-抗原抗体的核酸； (c)确定第一种抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列； (d)确定第二种抗体的重链可变区及任选确定轻链可变区的核苷酸序列； (e)将每个抗体的重链 可变区编码序列插入重链表达载体中；任选其中每个重链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列； (f)将第一种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中第一种抗体的轻链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列； (g)任选将第二种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中第二种抗体的轻链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；及 (h)将每个表达载体导入宿主细胞中并在所述宿主细胞的混合物中共表达抗体链以产生抗体，每个抗体均包含所述重链可变区和轻链之一或二者；任选其中所述表达载体一起导入相同宿主细胞(例如CHO或HEK293细胞)中，以便细胞能表达抗体轻链和重链，由此所述细胞或多个宿主细胞表达抗体，每个抗体均包含所述重链可变区和轻链之一或二者； (i)任选地: 在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因区段)及任选存在的相同的J库集(任选单个J基因区段)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；或者 在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。
72.产生单克隆或多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行权利要求71的方法及表达单克隆抗体或所述抗体的多克隆混合物；任选随后分离包含第一种和/或第二种抗体的重链可变区的抗体。
73.权利要求66-72任一项的方法，其中用于免疫的每个脊椎动物如下所述提供: (a)从人血液或组织(例如B淋巴细胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃体或淋巴结)样品中分离B淋巴细胞，其表达结合预定抗原的抗体(例如由感染性疾病病原体表达的抗原；任选其中所述血清或组织来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体，或者来自携带所述生物体的人类个体)； (b)确定何种人种系VH基因区段在人体中重组以产生编码所述抗体重链可变区的所述B淋巴细胞的核苷酸序列； (c)构建转基因脊椎动物，其中所述人种系VH基因区段提供于权利要求48-63任一项的其轻链基因座中 '及 (d)提供所述转基因脊椎动物以在权利要求66-72任一项的方法中免疫。
74.权利要求66-72任一项的方法，其中用于免疫的每个脊椎动物如下所述提供: (a)从人血液或组织(例如B淋巴细胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃体或淋巴结)样品中分离B淋巴细胞，其表达结合预定抗原的抗体(例如由感染性疾病病原体表达的抗原；任选其中所述血清或组织来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体，或者来自携带所述生物体的人类个体)； (b)确定编码所述抗体的重排的VDJ或VJ区的所述B淋巴细胞的核苷酸序列； (c)构建转基因脊椎动物，其中所述重排的VDJ或VJ区提供在权利要求48-64任一项的其轻链基因座中 '及 (d)提供所述转基因脊椎动物以在权利要求66-72任一项的方法中进行免疫。
75.通过权利要求72的方法或者从属于权利要求72时的权利要求73或74的方法可获得的或获得的分离的抗体(例如IgG型抗体)或其突变体或衍生物抗体，其中(i)所述分离的抗体包含所述第一种抗体重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体轻链可变区的两个拷贝配对；或者(ii)所述分离的抗体包含所述第二种抗体重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(iii)所述分离的抗体是双特异性抗体，包含所述第一种抗体的重链可变区的一个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的一个拷贝配对，及包含所述抗体的重链可变区的一个拷贝，与第一种抗体的轻链可变区的一个拷贝配对，任选其中所述双特异性抗体结合权利要求71所述第一和第二抗原；所述分离的抗体或其突变体或衍生物抗体任选用于医学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病。
76.单克隆或多克隆抗体混合物(例如一或多种IgG型抗体)，其中所述单克隆抗体或者混合物包含或由通过权利要求65-71和72-74任一项的方法产生的抗体或者其突变体或衍生物抗体组成，任选用于医学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病，其中任选其中每个抗体均结合感染性疾病病原体的抗原，优选相同抗原。
77.权利要求65、75或76的分离的单克隆或多克隆抗体或者其突变体或衍生物抗体在生产治疗和/或预防感染性疾病的药物中的应用，任选其中所述感染性疾病是由细菌或病毒病原体引起的疾病。
78.权利要求75、76或77的抗体、混合物或应用，其中所述感染性疾病选自由选自如下的病原体引起的疾病:流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、疱疹病毒科病毒、巨细胞病毒(CMV)、HIV和流感病毒。
79.编码权利要求65、75或76的抗体的核苷酸序列,任选其中所述核苷酸序列是载体的一部分。
80.包含权利要求65、75或76的抗体及稀释剂、赋形剂或载体的药物组合物。
81.非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含: (a)免疫球蛋白重链基因座，其包含: (i)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段(任选重排的VJXJhCh或VaDJhCh);或者 (ii)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人Jh基因区段，所述一或多个人VH基因区段选自VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb 家族成员)、VHIV 基因家族成员、VHIII9.1 (VH3-15)、VHIII VH26 (VH3-23)、VH3_21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH Hll、VHlGRR、ha3h2、VH1-halcl、VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、Hvlfl0、VH4.11、71-4、VH251、VH1_69 及至少 80%相同的基因区段;及 (b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段和一或多个人J基因区段，任选其中所述轻链基因座如权利要求48的(b) (i)或(b) (ii)所述，其 中所述重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含由所述重链基因座重组产生的重链及由所述轻链基因座重组产生的轻链的抗体。
82.权利要求81的脊椎动物或细胞，其中所述轻链基因座的V基因区段库集包含或由一或多个VL基因区段组成，所述VL基因区段选自VaII基因家族成员、VaVII4A、VaII2.1、￥^114六、￥入1基因家族成员、￥入3基因家族成员、161^152、￥;^3-。]^70、1&1112、1&1￥1、1&3113、Kv325、Vk I基因家族成员、κ Ι-15Α(KL012)、Vk II家族成员、VkIII家族成员、Vk I基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、VKII A2 (任选A2a等位基因)、VkA27 (Humkv325)及与其至少80%相同的基因区段；和/或其中或在(a) (ii)中，所述重链基因座V基因区段库集由一种VH基因区段类型(任选及一或其突变体)组成，其中所述VH基因选自所述一组VH基因区段。
83.权利要求81-82任一项的脊椎动物或细胞，其中在(a)中，所述恒定区是重链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区和/或在(b)中，所述恒定区是轻链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
84.权利要求81-83任一项的脊椎动物或细胞，其中内源性重链和轻链表达已经被失活。
85.非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含: (a)(i)未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段和一或多个Jh基因区段，其中每个人VL基因区段是与用于产生重排VJ的人VL基因区段(或其突变体)相同的人基因区段，所述重排的VJ编码来自表达抗体细胞的人抗体轻链可变区，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；或者 (ii)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的重排的VJ区或者VDJ区，其中重组区域的核苷酸序列与由人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VL基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VL基因区段与用于产生重排的VJ的人VL基因区段(或其突变体)相同，所述重排的VJ编码来自抗体表达细胞的人抗体轻链可变区，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)； (b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段及一或多个人J基因区段；及 (c)其中所述轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述重链基因座中的基因区段或VJ或VDJ与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含通过所述轻链基因座重组产生的轻链和衍生自所述重链基因座的重链的抗体； (d)任选地，当应用(a)(i)时，所述重链基因座中每个所述VL基因区段选自如下一组中:V λ II基因家族成员，νλν?Ι4Α，VA 112.1, VAVII4A, νλ I基因家族成员，νλ3基因家族成员，IGLV1S2, VA 3-cML70, lalh2, lalvl, Ia3h3，Kv325，V κ I 基因家族成员，κ 1-15A(KL012)，Vk II 家族成员，Vk III 家族成员，Vk I 基因家族成员，κ Ι-15Α(KL012)，Vk II A2(任选A2a等位基因)，VKA27(Humkv325)及与其至少80%相同的基因区段； (e)任选地，当应用(a) (ii)时，重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VL基因区段重组而产生的核苷酸序列相同，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段:νλ II基因家族成员，νλν?Ι4Α，νλ 112.1, V λ VII4A, V λ I基因家族成员，νλ 3 基因家族成员，IGLV1S2, VA 3-cML70, lalh2, lalvl, Ia3h3, Kv325, Vk I基因家族成员，κ 1-15A(KL012), Vk II家族成员，Vk III家族成员，Vk I基因家族成员，κ 1-15A (KL012) ,Vk II A2 (任选 A2a 等位基因)，V κ A27 (Humkv325)及与其至少 80%相同的基因区段。
86.权利要求85的脊椎动物或细胞，其中所述重链基因座的VL基因区段是Va基因区段。
87.权利要求85 或86的脊椎动物或细胞，其中在(a)中，所述恒定区是重链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
88.权利要求85、86或87的脊椎动物或细胞，其中在(b)中，所述恒定区是轻链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
89.权利要求85-88任一项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于重链基因座(a) (i)或(ii)是纯合的，任选其中: -所述重链基因座的V基因区段库集由一或多个人VL基因区段组成，所述人VL基因区段选自如下一组中II基因家族成员、VaVII4A、Va 112.1、VaVII4A、Va I基因家族成员、V人3 基因家族成员、IGLVlS2、Vx3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VK I 基因家族成员、κ 1-15A(KL012)、VkII 家族成员、VkIII 家族成员、Vk I 基因家族成员、κ Ι-15Α(KL012)、VkII Α2(任选A2a等位基因)、VKA27(Humkv325)及与其至少80%相同的基因区段；或者 -所述重链基因座的重组VJ或VDJ库集由与通过人VL基因区段与人J基因区段及任选存在的人D基因区段重组产生的一或多个核苷酸序列相同的序列组成，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段:νλ II基因家族成员，νλν?Ι4Α，νλ 112.1, V λ VII4A, V λ I基因家族成员，νλ 3 基因家族成员，IGLV1S2，VX 3-cML70，lalh2, lalvl, la3h3,Kv325, V κ I基因家族成员，κ 1-15A(KL012), Vk II家族成员，Vk III家族成员，Vk I基因家族成员，κ 1-15A(KL012)，Vk II A2 (任选 A2a 等位基因)，V κ A27 (Humkv325)以及与其至少 80%相同的基因区段。
90.权利要求85-89任一项的脊椎动物或细胞，其中内源性重链和轻链表达已经被失活，及其中权利要求85-89任一项的重链基因座是脊椎动物或细胞基因组中的唯一功能性重链基因座。
91.权利要求85-90任一项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白重链基因座是如权利要求85中(a) (i)所述，包含仅一个人VL基因区段，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段:νλ II基因家族成员，VAVII4A, VA 112.1，νλν?Ι4Α，V λ I 基因家族成员，νλ 3 基因家族成员，IGLV1S2, VA 3-cML70, lalh2, lalvl,Ia3h3，Kv325，Vk I基因家族成员，κ Ι-15Α(KL012)，Vk II家族成员，Vk III家族成员，Vk I 基因家族成员，κ 1-15A(KL012)，Vk II A2 (任选 A2a 等位基因)，V κ A27 (Humkv325)及与其至少80%相同的基因区段，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述重链是纯合的，由此所有重链基因座均包含相同的单个人VL基因区段。
92. 权利要求85-90任一项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白重链基因座是如权利要求85中(a) (ii)所述，包含仅一个的重排的VJ或VDJ区，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述重链是纯合的，由此所有重链基因座均包含相同的单个重排的VJ或VDJ区。
93.权利要求91或92的脊椎动物或细胞，其中每个免疫球蛋白重链基因座进一步包含VL基因区段或重排区域，其分别是所述选择的人VL基因区段或者重排区域的突变体，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链突变体VL基因区段或重排区域是纯合的。
94.权利要求91的脊椎动物或细胞，其中每个免疫球蛋白重链基因座包含仅两个选自所述组中的人VL基因区段，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述两个重链人VL基因区段是纯合的。
95.权利要求92的脊椎动物或细胞，其中每个免疫球蛋白重链基因座包含仅两个所述重排的VJ或VDJ区，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述两个重链重排的VJ或VDJ区是纯合的。
96.通过用抗原免疫权利要求81-95任一项的至少一个脊椎动物(例如小鼠或大鼠)制备的单克隆或多克隆抗体组合物，任选其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原，任选其中用相同抗原免疫所有脊椎动物；任选其中所述抗体是IgG型。
97.分离结合预定抗原的抗体的方法，所述方法包括: (a)提供权利要求81-95任一项的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)； (b)用所述抗原免疫所述脊椎动物(任选其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原)； (c)从所述脊椎动物中取出B淋巴细胞并选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞； (d)任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤进行永生化；及 (e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)。
98.权利要求97的方法，包括从所述B淋巴细胞中分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。
99.权利要求97或98的方法，进一步包括产生通过权利要求97或98的方法产生的抗体的突变体或衍生物。
100.产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行权利要求97-99任一项的方法，用抗原分别免疫第一和第二脊椎动物(任选第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)及组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))应用如下步骤: (i)将脊椎动物用相同抗原或不同抗原免疫(任选其中不同抗原是由相同病原性生物体(或其家族成员)表达的)； (ii)在免疫之前，所述脊椎动物的重链基因座含有相同的VL基因库集(任选单个VL基因)及任选存在的相同的D和/或J库集；任选哺乳动物的重链基因座在免疫之前是相同的； (iii)在免疫之前，所述脊椎动物的重链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选所述脊椎动物的重链基因座在免疫之前是相同的。
101.产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行权利要求97-99任一项的方法，用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)并组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))应用如下步骤: (i)所述抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达； (ii)在免疫之前，所述脊椎动物的重链基因座含有相同的VL基因库集(任选单个VL基因)及任选存在的相同的D和/或J库集；任选哺乳动物的重链基因座在免疫之前是相同的； (iii)在免疫之前，所述脊椎动物的重链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选所述脊椎动物的重链基因座在免疫之前是相同的。
102.产生能表达多克隆抗体混合物的宿主细胞的方法，所述方法包括:在权利要求98的方法中， (a)用第一和第二抗原(任选其中不同抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达)免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)； (b)从所述脊椎动物的B淋巴细胞中分离编码第一种和第二种抗-抗原抗体的核酸； (C)确定第一种抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列； (d)确定第二种抗体的轻链可变区的核苷酸序列及任选确定第二种抗体的重链可变区的核苷酸序列； (e)将每个抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中每个轻链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列； (f)将第一种抗体的重链可变区编码序列插入重链表达载体中；任选其中第一种抗体的重链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列； (g)任选将第二种抗体的重链可变区编码序列插入重链表达载体中；任选其中第二种抗体的重链恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；及 (h)将每个表达载体导入宿主细胞中并在所述宿主细胞混合物中共表达抗体链以产生抗体，每个抗体均包含所述轻链可变区和重链之一或二者；任选其中将表达载体一起导入相同宿主细胞中(例如CHO或HEK293细胞)由此所述细胞能表达抗体轻链和重链，由此所述细胞或多个宿主细胞表达抗体，每个抗体均包含所述轻链可变区和重链之一或二者； (i)任选地: 在免疫之前，所述脊椎动物的重链基因座含有相同的VL基因库集(任选单个VL基因区段)及任选存在的相同的D和/或J库集(任选单个D和J基因区段)；任选脊椎动物的重链基因座在免疫之前是相同的；或者 在免疫之前，所述脊椎动物的重链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ);任选脊椎动物的重链基因座在免疫之前是相同的。
103.产生单克隆抗体或多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行权利要求102的方法及表达单克隆抗体或所述抗体的多克隆混合物；任选随后分离包含第一种和/或第二种抗体的轻链可变区的抗体。
104.权利要求97-103任一项的方法，其中用于免疫的每个脊椎动物如下所述提供: (a)从人血液或组织(例如B淋巴细胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃体或淋巴结)样品中分离表达结合预定抗原的抗体的B淋巴细胞(例如由感染性疾病病原体表达的抗原；任选其中所述血清或组织来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体)； (b)确定何种人种系VL基因区段在人体内重组，以产生编码所述抗体轻链可变区的所述B淋巴细胞的核苷酸序列； (c)构建转基因脊椎动物，其中所述人种系VL基因区段提供在权利要求81-95任一项的其重链基因座中；及 (d)提供所述转基因脊椎动物以在权利要求97-103任一项的方法中进行免疫。
105.权利要求97-103任一项的方法，其中用于免疫的每个脊椎动物如下所述提供: (a)从人血液或组织(例如B淋巴细胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃体或淋巴结)样品中分离表达结合预定抗原的抗体的B淋巴细胞(例如由感染性疾病病原体表达的抗原；任选其中所述血清或组织来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体)； (b)确定编码所述抗体的重排的VDJ或VJ区的所述B淋巴细胞的核苷酸序列； (c)构建转基因脊椎动物，其中所述重排的VDJ或VJ区提供在权利要求81-95任一项的其重链基因座中；及 (d)提供所述转基因脊椎动物以在权利要求97-103任一项的方法中进行免疫。
106.通过权利要求103或者当从属于权利要求103时的权利要求104或105的方法可获得的或者获得的分离的抗体(例如IgG型抗体)或者其突变体或衍生物抗体，其中(i)所述分离的抗体包含所述第一种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(ii)所述分离的抗体包含所述第二种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(iii)所述分离的抗体是双特异性抗体，其包含所述第一种抗体的重链可变区的一个拷贝，与第一种抗体轻链可变区的一个拷贝配对，及包含所述抗体的重链可变区的一个拷贝，与第一种抗体的轻链可变区的一个拷贝配对，任选其中所述双特异性抗体结合权利要求102所述第一和第二抗原；所述分离的抗体或者其突变体或衍生物抗体任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病。
107.单克隆或多克隆抗体混合物(例如IgG型抗体)，其中所述单克隆抗体或混合物包含或者由通过权利要求97-101和103-105任一项的方法产生的抗体或者其突变体或衍生物抗体组成，任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病，其中任选其中每种抗体均结合感染性疾病病原体的抗原，优选相同抗原。
108.用以治疗和/或预防感染性疾病或病症的分离的嵌合抗体，所述抗体包含非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)重链恒定区和人可变区，其结合感染性疾病病原体的抗原，其中所述抗体在包括用所述抗原免疫权利要求48-64和81-95任一项的脊椎动物的方法中可获得或获得。
109.用于治疗和/或预防感染性疾病或病症的分离的人抗体，所述抗体包含人重链恒定区和人可变区，其结合感染性疾病病原体的抗原，其中所述抗体在包括当可变区与脊椎动物(例如小鼠或大鼠重链恒定区)的重链恒定区可操纵地连接时在转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在体内亲和性成熟抗体可变区的方法中如下可获得或获得，(a)用所述抗原免疫权利要求48-64和81-95任一项的脊椎动物；(b)分离编码权利要求108的嵌合抗体的核酸；(c)用编码人重链恒定区的核苷酸序列置换编码非人脊椎动物重链恒定区的核酸的核苷酸序列以产生编码人抗体的核酸；(d)在体外表达所述人抗体(任选从携带所述人核酸的CHO或HEK293细胞表达)及(e)分离所述人抗体(任选进一步亲和性成熟所述抗体和/或产生其衍生物)。
110.包含结合预定抗原(例如由细菌或病毒病原体表达的抗原)的人可变结构域的抗体，其中所述可变结构域序列由重排的VDJ和VJ区编码，每个VDJ和/或VJ均是通过在体内重排人重链和轻链可变区基因区段(V和J及任选存在的D区段)产生的杂交区；任选其中所述抗体包含人恒定区。
111.第一种和第二种人抗体的混合物，每个抗体均如权利要求109或110所述，其能结合感染性疾病病原体的抗原(任选其中第一种抗体结合第一种抗原，第二种抗体结合第二种抗原，所述抗原来自相同病原体；或者其中所述抗原是相同的)。
112.权利要求111的混合物，其中第一种抗体的轻链氨基酸序列与第二种抗体的轻链氨基酸序列相同，或者具有至多15个氨基酸改变。
113.权利要求96及106-112任一项的分离的单克隆或多克隆抗体或混合物在生产治疗和/或预防感染性疾病的药物中的应用，任选其中所述感染性疾病是由细菌或病毒病原体引起的疾病。
114.权利要求96及106-112任一项的抗体、混合物或应用，其中所述感染性疾病选自由选自流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、疱疹病毒科病毒、巨细胞病毒(CMV)、HIV和流感病毒的病原体引起的疾病。
115.编码权利要求96及106-112任一项的抗体的重链和轻链或者至少其可变区的第一个和第二个核苷酸序列，任选其中每个核苷酸序列均是载体的一部分。
116.宿主细胞，其包含一或多个编码权利要求110或112所述第一种和第二种抗体的重链及权利要求110或112所述第一种抗体的轻链(及任选权利要求110或112所述第二种抗体的轻链)的表达载体。
117.药物组合物，其包含权利要求96及106-112任一项的抗体及稀释剂、赋形剂或载体；任选其中所述组合物提供在与IV针头或注射器连接的容器中或者在IV包中。
118.合成的免疫球蛋白基因座，其包含与恒定区5’端可操纵地连接的一或多个可变区和J基因区段(及任选存在的一或多个D基因区段)，其中所述基因座包含选自由如下免疫球蛋白基因座组成的组中的5’至3’ V(D)J排列，其可以根据如下一或多种排列(5，至3’ )构建: (a)[V(重链，λ或κ)]-[两转角RSS]-[—转角RSS]-[D]_[JH]，其中所述RSS是相反方向； (b)[VH]-[D]_ [两转角RSS]-[—转角RSS] - [J λ]，其中所述RSS是相反方向； (c) [VH] - [D]-[ —转角RSS]-[两转角RSS] _ [J κ ]，其中所述RSS是相反方向；(d)[VH或V κ ]-[两转角RSS]-[ 一转角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向； (e)[Vk ]-[ 一转角RSS]-[两转角RSS] _ [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向； (f)[V(重链，λ或κ)]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[D]-[JH]，其中所述RSS是相反方向； (g)[VH] - [D]-[ —转角RSS]-[两转角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向； (h)[VH] - [D]-[两转角RSS]-[ 一转角RSS] _ [J κ ]，其中所述RSS是相反方向； (i)[VH或V κ ]-[ —转角 RSS]-[两转角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向； (j) [Vk ]-[两转角RSS]-[ 一转角RSS] _ [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向。
119.包含权利要求118的基因座的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或者细胞。
【文档编号】C12N15/85GK103945689SQ201280056528
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年9月18日 优先权日:2011年9月19日
【发明者】G·弗里德里克, E-C·李, J·克拉贝, N·英格兰 申请人:科马布有限公司