氨酸钠，pH7. 4)。
[0260] 对于每个样品，200微克的高盐可溶组分或20微克的十二烷基肌氨酸钠不溶组 分，在400微升的免疫沉淀缓冲液（IOmM的Tris、150mM的氯化钠、0. 5%的TritonX100、 ImM的EGTA、ImMEDTA中，pH7.4)中稀释。将样品用G蛋白磁珠（NewEnglandBiolabs) 预清除，并向每个管中加入5微克的抗体。所用的抗体包括：1)作为对照的小鼠非免疫IgG 抗体（mlgG) ;2)作为对照的人非免疫IgG抗体（hlgG) ;3)嵌合的抗体16B5(Chil6B5) ;4) 人源化的16B5,版本H1L2 (hl6B6-HlL2);和人源化的16B5,版本H1L3 (hl6B6-HlL3)。预清 除裂解物并使抗体在4°C孵育2小时。通过使用G蛋白磁珠使抗体/抗原复合物沉淀，将沉 淀物用PBS/350mM氯化钠充分洗涤。使用Laemmli缓冲液洗脱后，洗脱液通过SDS-PAGE分 离并使用多克隆tau抗体（DAKO)印迹。
[0261] 如图7所示，嵌合的16B5和人源化的16B5H1L2和H1L3在阿尔茨海默病脑中可 溶和不溶组分中均识别出tau。
[0262] 实施例8.鼠的和人源化的16B5tau抗体在阿尔茨海默病脑上的免疫组织化学表 征
[0263] 鼠单克隆抗tau抗体16B5和它的两个人源化变异体（hl6B5_HlL2和hl6B5_NlD) 还在来自阿尔茨海默病供体和非患病老年对照的人脑新鲜的冷冻切片上进行了免疫组织 化学试验。
[0264]方法：
[0265] 人脑组织
[0266] 额叶皮质获自Sun健康研究所。案例包括确诊为阿尔茨海默氏症且尸检得到神经 病理学评估证实的六名患者（平均年龄86. 8±0.40SEM)，和三个非患病老年对照（平均年 龄77±9.7SEM)。病例的人口统计学特征列于下表8中。在少量丙酮固定的IOum载玻片上 的冰冻切片进行免疫组织化学分析。
[0267]表 8
[0268] 用于免疫组织化学检测的案例的人口统计学特征
[0269]
[0270] 免疫组织化学
[0271] 免疫过氧化物酶法是主要的检测体系，其由标记有过氧化物酶标记的、与山羊抗 小鼠免疫球蛋白缀合的聚合物（EnVision+系统HRP标记的聚合物；DakoK4001)或直接生 物素化人源化抗体的VectorABC扩增系统（ABCEliteStandard;PK-6100;载体实验室） 组成。用DAB色原体（液体DAB+基底色原体系统；DakoK3468)使染色可视化，其产生了 棕色沉淀物。
[0272] 用IgG同种型对照抗体或省略一次抗体在邻近的切片上执行整个免疫组织化学 过程的阴性对照。
[0273] 免疫荧光标记
[0274] 进行双重免疫荧光染色以确定鼠科抗体和人源化抗体变异体，其它识别各种磷酸 化表位的tau抗体以及淀粉状蛋白P之间的关系。用抗体混合物平行地进行组织切片染 色，所述混合物包含生物素化的或FITC标记的人源化16B5的变异体（lug/mL)以及鼠科抗 体（单克隆 16B5 (lug/mL)、AT8 (1:1000)、ATlOO(1:1000)或 3D6 (lug/mL))。用缀合至 488 或635的荧光团（Invitrogen)的山羊抗小鼠二级抗体检测鼠科抗体。用链霉抗生素蛋白 635检测生物素化的人源化抗体。
[0275] 预吸附
[0276] 为了评估抗体与其祀抗原的特异性，在4°C下，用50ug/mL的纯化的人P301Ltau 蛋白或野生型核蛋白（一种不相关蛋白）预吸附lug/mL16B5抗体过夜。所述抗体然后施 加于组织并如上所概述进行免疫组织化学过程。
[0277] 图像分析
[0278]用奥林巴斯BX61 显微镜（OlympusBX61microscope)、奥林巴斯Nanozoomer 2. 0HT(01ympusNanozoomer2.OHT)，或LeicaSPE光谱共聚焦系统中的任一个使载玻片成 像。图像整理为TIFF文件。
[0279] 结果
[0280] 如下表9所示，小鼠单克隆抗体16B5和人源化变异体都显示出对于阿尔茨海默病 组织的反应性，染色主要在神经纤维网线、一些神经元纤维缠结（主要是球状的）和一些 tau阳性神经炎斑。大多数16B5AD-纤维状病理仅限于灰质，但在白质中也检测到了一些反 应性。与此相反，非患病对照组织呈弥漫背景反应性，但是对在AD组织中发现的任何病理 为阴性。
[0281] 用16B5的鼠单克隆版本和与（1)两个人源化变异体，（2)在各种不同磷酸化的表 位识别tau的抗体，和（3)P淀粉状蛋白进行双标记实验以进一步表征由所述抗体变异体 识别的病理。
[0282]hl6B5_HlL2和hl6B5_NlD都用与AD-纤维状病理结构具有高度一致性的单克隆 16B5抗体共定位。H16B5-H1L2还检测到示出与各种磷酸化tau表位具有免疫反应性的病 理，包括丝氨酸202和苏氨酸205 (AT8)，丝氨酸212和苏氨酸214 (ATlOO)，和丝氨酸396 (内 部专有抗体，20H1)。最后，用淀粉样蛋白P双表示的抗体识别N末端氨基酸序列（3D6;氨 基酸1-5)，并且16B5几乎未显示出在淀粉样蛋白斑上AP和16B5免疫反应结构之间的共 定位。
[0283] 当16B5免疫反应性与充分表征的市售单克隆抗tau蛋白抗体（Dako)相比时，两 者都使纤维状AD病理染色，其包括tau蛋白阳性神经斑块、神经网线和神经原纤维缠结。
[0284] 通过用纯化的重组P301Ltau蛋白预吸附来评估抗体的特异性。当用P301Ltau 蛋白预吸附16B5时，观察到染色衰减，但是当用不相关的蛋白（野生型核蛋白）以相同摩 尔浓度预吸附抗体时，染色没有受到影响。
[0285] 所有测试的组织染色中，IgG-同种型对照抗体和第一抗体省略切片都是阴性的。
[0286]表9
[0287] 免疫组织化学表征的16B5抗体
[0288]
[0289]所有引用的出版物（包括GenBank登记号、UniProtKB/Swiss-Prot登录号等）、专 利和专利申请都出于所有目的、以相同的程度通过引用的方式整体并入本文，如同每个单 独的出版物、专利和专利申请被明确地和各自地指出出于所有目的通过引用的方式整体并 入本文。如果与Genbank和UniProtKB/Swiss-Prot登录号等相关的序列存在任何变化，截 止本申请的有效申请日之前本申请涉及引用登录号相关的序列，所述有效申请日是指公开 相关登录号的优选权申请的实际申请日或更早的日期。除非另有特别注明，本发明的任何 特征、步骤、要素、实施方案或方面可与任何其它的组合使用。尽管为了清楚和理解，已经通 过例证和实例对本发明进行了详细的描述，然而，显然可以在所附权利要求的范围内进行 某些改变和修改。
【主权项】
1. 一种单克隆抗体，其与抗体16B5竞争结合tau。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其是人源化的、嵌合的、镶饰的或人抗体。3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其是人IgG同种型。4. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述同种型是IgGl。5. 根据权利要求4所述的单克隆抗体，其在恒定区具有至少一个突变。6. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其是人IgG2或IgG4同种型。7. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其是单克隆抗体16B5的人源化的、嵌合的或镶 饰的形式。8. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其具有单克隆抗体16B5的如Kabat定义的三个 轻链⑶R和如Kabat定义的三个重链⑶R。9. 一种单克隆抗体，其与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的 表位特异性结合。10. 根据权利要求9所述的抗体，其是人的、人源化的、嵌合的或镶饰的。11. 根据权利要求10所述的抗体，其与SEQ ID NO: 1的残基25-44内的表位特异性结 合。12. 根据权利要求11所述的抗体，其是人源化的、嵌合的或镶饰的抗体，其与SEQ ID NO: 1的残基30-39内的表位结合。13. 根据权利要求1所述的抗体，其与磷酸化和未磷酸化形式的tau结合。14. 一种抗体，其包含成熟的重链可变区和成熟的轻链可变区，所述成熟的重链可变 区具有与SEQ ID NO: 15至少90%相同的氨基酸序列，且所述成熟的轻链可变区与SEQ ID N0:22至少90%相同。15. 根据权利要求14所述的抗体，其包含具有SEQ ID NO: 15的三个Kabat⑶R和具有 SEQ ID NO: 22 的三个 Kabat CDR。16. 根据权利要求14或15所述的抗体，其条件是位置H13、H48和H91的至少一个分 别由K、M和F占据，且位置LU L4、L36和L43的至少一个分别由N、L、F和S占据。17. 根据权利要求16所述的抗体，其条件是位置H13、H48和H91分别由K、M和F占据， 且位置LU L4、L36和L43的至少两个分别由N、L、F和S占据。18. 根据权利要求17所述的抗体，其条件是位置H13、H48和H91分别由K、M和F占据， 且位置LU L4、L36和L43的至少三个分别由N、L、F和S占据。19. 根据权利要求17所述的抗体，其条件是位置H13、H48和H91分别由K、M和F占据， 且位置LU L4、L36和L43分别由N、L、F和S占据。20. 根据权利要求14-16中任一项所述的抗体，其包含成熟的重链可变区和成熟的轻 链可变区，所述成熟的重链可变区具有与SEQ ID NO: 15至少95%相同的氨基酸序列，且所 述成熟的轻链可变区与SEQ ID N0:22至少95%相同。21. 根据权利要求14-20中任一项所述的抗体，其中所述成熟的重链可变区与重链恒 定区融合，且所述成熟的轻链可变区与轻链恒定区融合。22. 根据权利要求14-21中任一项所述的抗体，其中所述重链恒定区是天然人恒定区 的突变形式，其相对于所述天然人恒定区具有降低的Fe Y受体结合。23. 根据权利要求21或22所述的抗体，其中所述重链恒定区是IgGl同种型。24. 根据权利要求14-23中任一项所述的抗体，其条件是分别来自SEQ ID NOS: 15和 22的所述成熟的重链可变区CDR和所述成熟的轻链可变区的CDR的任何差异存在于位置 H60-H65 中。25. 根据权利要求14、22和24中任一项所述的抗体，其中所述成熟的重链可变区具有 指定为SEQ ID NO: 15的氨基酸序列，且所述成熟的轻链可变区具有指定为SEQ ID NO:21、 22或23的氨基酸序列。26. 根据权利要求14-25中任一项所述的抗体，其中所述成熟的重链可变区具有指定 为SEQ ID NO: 15的氨基酸序列，且所述成熟的轻链可变区具有指定为SEQ ID N0:22的氨 基酸序列。27. 根据权利要求14-26中任一项所述的抗体，其中所述抗体与细胞毒素剂或细胞抑 制剂偶联。28. 根据权利要求1-27中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab片段。29. -种多核苷酸，其包含编码如权利要求14-28中所述的抗体的重链和/或轻链的核 酸。30. -种使抗体人源化的方法，其包括： 测定小鼠抗体的重链和轻链可变区的序列； 合成编码包含所述小鼠抗体重链的CDR的人源化重链的核酸及编码包含所述小鼠抗 体轻链的CDR的人源化轻链的核酸；及 在宿主细胞中表达所述核酸以产生人源化抗体， 其中所述小鼠抗体是16B5。31. -种产生人源化的、嵌合的或镶饰的抗体的方法，其包括： 培养由编码所述抗体的所述重链和轻链的核酸转化的细胞，以使细胞分泌所述抗体； 及 纯化来自细胞培养基的所述抗体， 其中所述抗体是16B5的人源化的、嵌合的或镶饰的形式。32. -种制备产生人源化的、嵌合的或镶饰的抗体的细胞系的方法，其包括： 将编码抗体的重链和轻链的载体及选择性标志物导入细胞； 在一定条件下繁殖所述细胞以选择拷贝数增加的所述载体的细胞； 从所述选定细胞中分离单细胞；及 将由基于抗体产量选择的单个细胞克隆的细胞建库；其中所述抗体是16B5的人源化 的、嵌合的或镶饰的形式。33. -种药物组合物，其包含根据任一前述权利要求所述的抗体和药学上可接受的载 体。 34?-种tau的分离片段，其包含SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基 24-46内的tau的3-10个连续残基。35. 根据权利要求34所述的片段，其包含SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的 残基30-39内的tau的3-10个连续残基。36. 根据权利要求34所述的片段，其包含SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的 残基33-37。37. 根据权利要求34所述的分离片段，其任选地通过间隔基与载体分子连接，所述间 隔基有助于引发对抗所述片段的抗体。38. -种药物组合物，其包含权利要求34所述的片段和可接受施用于人的佐剂。39. -种治疗或实现预防阿尔茨海默病的方法，其包括向患有阿尔茨海默病或处于患 有阿尔茨海默病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试剂，所述抗体与SEQ ID NO: I (Swiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结合，从而治疗或实现 预防所述疾病。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述抗体如权利要求14-28中任一项所定义。41. 根据权利要求39所述的方法，其中诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包含SEQ ID NO: 1的残基24-46内的tau的3-10个连续残基。42. 根据权利要求39所述的方法，其中所述患者是Ap〇E4携带者。43. -种治疗或实现预防tau相关疾病的方法，其包括向患有所述疾病或处于患有 所述疾病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试剂，所述抗体与SEQ ID NO: I (Swiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结合，从而治疗或实现预防 所述疾病。44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述抗体如权利要求14-28中任一项所定义。45. 根据权利要求43所述的方法，其中所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包含 SEQ ID NO: 1的残基24-46内的tau的3-10个连续残基。46. 根据权利要求43所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。47. -种减少tau异常传送的方法，其包括向患有与tau异常传送相关的疾病或处于患 有与tau异常传送有关的疾病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试剂，所 述抗体与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结合，从 而治疗或实现预防所述疾病。48. 根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体如权利要求14-28中任一项所定义。49. 根据权利要求47所述的方法，其中所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包含 SEQ ID NO: 1的残基24-46内的tau的3-10个连续残基。50. -种诱导tau的吞作用的方法，其包括向患有与tau的积聚相关的疾病或处于患 有与tau的积聚相关的疾病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试剂，所述 抗体与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结合。51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述抗体如权利要求14-28中任一项所定义。52. 根据权利要求50所述的方法，其中所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包含 SEQ ID NO: 1的残基24-46内的tau的3-10个连续残基。53. 根据权利要求50所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。54. -种抑制tau聚集或沉积的方法，其包括向患有与tau聚集或沉积相关的疾病或处 于与tau聚集或沉积相关的疾病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试剂， 所述抗体与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结合。55. 根据权利要求54所述的方法，其中所述抗体如权利要求14-28中任一项所定义。56. 根据权利要求54所述的方法，其中所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包含 SEQ ID NO: 1的残基24-46内的tau的3-10个连续残基。57. 根据权利要求54所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。58. -种抑制tau缠结形成的方法，其包括向患有与tau缠结形成相关的疾病或处于患 有与tau缠结形成相关的疾病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试剂，所 述抗体与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结合。59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述抗体如权利要求14-28中任一项所定义。60. 根据权利要求58所述的方法，其中诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包含SEQ ID NO: 1的残基24-46内的tau的3-10个连续残基。61. 根据权利要求58所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。62. -种筛选对阿尔茨海默病具有对抗活性的试剂的方法，其包括将所述试剂施用于 表达tau转基因的转基因动物，并测定所述试剂是否抑制或延迟阿尔茨海默病的至少一个 体征或症状，其中所述试剂是与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内 的表位特异性结合的抗体，或诱导所述抗体的试剂。63. -种核酸，其包含编码重链可变区的区段，所述重链可变区具有序列SEQ ID NO:10〇64. -种包含核酸，其编码重链可变区的区段，所述重链可变区具有序列SEQ ID N0:15〇65. 根据权利要求64所述的核酸，其中所述区段具有核苷酸序列SEQ ID NO: 25。66. 根据权利要求64或65所述的核酸，其还包含编码IgGl恒定区的区段。67. 根据权利要求66所述的核酸，其中所述IgGl恒定区是人IgGl恒定区。68. 根据权利要求67所述的核酸，其中所述IgGl恒定区具有序列SEQ ID NO: 29,条件 是C-末端赖氨酸可被省略。69. 根据权利要求68所述的核酸，其中编码所述IgGl恒定区的所述区段具有核苷酸序 列 SEQ ID NO:30。70. 根据权利要求66-69中任一项所述的核酸，其还包含连接编码所述重链可变区和 所述IgGl恒定区的所述区段的内含子。71. 根据权利要求70所述的核酸，其中编码所述IgGl恒定区的所述区段具有核苷酸序 列 SEQ ID NO:31。72. -种核酸，其包含编码轻链可变区的区段，所述轻链可变区具有序列SEQ ID N0:16〇73. -种核酸，其包含编码轻链可变区的区段，所述轻链可变区具有序列SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22 或 SEQ ID NO:23。74. 根据权利要求73所述的核酸，其中编码所述轻链可变区的所述区段具有序列SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27 或 SEQ ID NO:28。75. 根据权利要求73或74所述的核酸，其还包含编码K恒定区的区段。76. 根据权利要求75所述的核酸，其中所述K恒定区是人K恒定区。77. 根据权利要求76所述的核酸，其中所述K恒定区具有序列SEQ ID NO:32。78. 根据权利要求77所述的核酸，其中编码所述K恒定区的所述核酸具有序列SEQ ID N0:33〇79. 根据权利要求75-78中任一项所述的核酸，其还包含将编码所述轻链可变区的所 述区段连接至编码所述K恒定区的所述区段的内含子。80. 根据权利要求79所述的核酸，其中编码所述K恒定区的所述区段具有序列SEQ ID NO:34。81. 根据权利要求1-28中任一项所述的抗体，其中所述抗体的重链包含具有序列SEQ ID NO:29的人IgGl恒定区。82. 根据权利要求1-28中任一项所述的抗体，其中所述抗体的轻链包含具有序列SEQ ID NO:32的人K恒定区。83. 核酸，其编码SEQ ID NO: 15的重链可变区和/或SEQ ID NO: 21、22或23的轻链可 变区。
【专利摘要】本发明提供了TAU的抗体。所述抗体抑制或延迟tau相关病状以及相关症状恶化。
【IPC分类】A61K39/395, C07K16/18
【公开号】CN105121465
【申请号】CN201480014601
【发明人】P·苏波特, P·J·多兰三世, Y·刘, R·巴布尔
【申请人】普罗塞纳生物科技公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年3月12日
【公告号】CA2902026A1, WO2014165271A2, WO2014165271A3