）。所有的蛋白酶都是从ThermoScientific获得 的，并在37°C下消化16小时。将所得肽片段与10yg的16B5 -起孵育，并利用蛋白G磁 珠（NEB)沉淀。沉淀物在含有300mMNaCl和0. 5 %NP-40的PBS中充分洗涤，然后用IM NaCl的IOOmM甘氨酸溶液（pH值2. 8)洗脱。洗脱液在真空下干燥并重悬于0. 1 %三氟乙 酸0^)中。重悬洗脱液加载到4.6父5〇111111(：18柱上，然后用册^^81161^ 1260111打11行7 系统）分馏，所述HPLC使用具有0. 075%TFA的线性梯度的乙腈。收集峰馏分、干燥并重悬 于蒸馏水中。通过MALDI-T0F/T0F确定肽质量和身份。在LysC的MS谱中确定对应于SEQ IDNO: 1的残基25-44的峰。在胰蛋白酶MS谱中，确定对应于SEQIDNO: 1的残基25-44 和24-44的峰。用糜蛋白酶和GluC消化的过程中没有获得信号，这表明一些表位可能包含 SEQIDNO: 1的残基29和/或SEQIDNO: 1的残基37。
[0186] 通过突变分析鉴定表位。使用由肽片段分析中确定的结果(如上所述），通过使用 标准分子生物学方法扩增整个质粒进行rTau的缺失诱变。在小体积的细菌培养物中表达 蛋白，将等体积的澄清的细菌裂解液进行电泳、印迹，并用抗体16B5染色。为了控制样品加 载量，将对于tau(C末端表位）的C末端区域具有特异性的抗体Tau46用于染色双重印迹。 以0.2yg/mL的浓度使用两种抗体。使用LicorOdyssey焚光扫描仪捕获图像。以如下方 式制作并分析tau的缺失突变体：A5-24、A23-32、A25-44、A30-39和A37-46。如图1 和2所示，tau的A25-44和A30-39的缺失突变体未被16B5抗体检测到，提供证据表明， 由16B5识别的表位位于那些残基内。tau的A37-46缺失突变体是用16B5仅能稍微可检 测至I」，提供证据表明，37-46范围内的一些残基（如，残基37)可能在16B5与tau结合中起 作用。16B5抗体染色的tau的A23-32缺失突变体的程度低于A5-24并高于A25-44和 A30-39缺失突变体，提供证据表明，16B5也可能与包含残基33-36、30-36、33-37、30-37或 33-39的肽结合。作为一个整体，从tau蛋白缺失突变体中获得的数据表明，由16B5识别的 表位可以包含一些或所有SEQIDNO: 1的残基23-32以及一些或所有SEQIDNO: 1的残基 37-46。例如，16B5可识别在SEQIDNO:1的残基32-38或28-41中的表位。
[0187]通讨丙氨酸拍描鉴宙表位〇接着，用PCR诱变将tau的跨越残基30-42区域内的 单一残基突变成丙氨酸。表达突变的蛋白，如上所述，裂解物通过电泳进行分离并用16B5 抗体或Tau46抗体进行印迹。该分析的结果在图3中示出。上面的印迹列出了经分析的特 定点突变体，包括T30A、M31A、H32A、Q33A、D34A、Q35A、E36A、G37A、D38A、T39A、D40A、A41L 和G42A。在每个印迹上，特别关注的残基含在各店的框内。可检测的16B5的结合被Q33A tau突变体完全清除，被G37Atau突变体大幅降低，提供证据表明残基33,且到较小程度 上残基37,可能是由16B5识别的表位的重要成分。在Biacore分析中，其它残基可能是由 16B5识别的表位的重要成分。
[0188] 实施例4.在tau相关疾病的hTau.P30IL转基因小鼠模型内的被动免疫
[0189] 兔疫。将FVB/N遗传背景下的3个月大的hTau.P301L_Tg的雌性小鼠用于这项研 究。腹腔内施用l〇mg/kg的测试抗体和对照抗体，每周一次。治疗持续时间大约为5个月。 注射23次之后，该研究以小鼠的处死而结束。表1描述了在该研究中施用的试验抗体和对 照抗体。
[0190]表1
[0191] 给药方案
[0192]
[0193] 过早死亡是在转基因小鼠tau相关疾病模型中观察到的一种表型。在这项研究中 所使用的特定模型的小鼠在6月龄出现超磷酸化的Tau，尽管其发作是高变性的。小鼠也 患有运动缺陷如后肢夹紧和一般的活动性降低，并在8-11月龄过早死亡（reMYND未出版资 料，Terwel等人，2005)。处死出现末期疾病症状的小鼠，所述症状特征在于，存在夹紧表型 和体重减轻。超乎预期大量的小鼠过早死亡而并不存在这些症状。在此类情况下，死亡的 原因被认为是与后期tau相关疾病或测试抗体无关，且相反地被认为是与近交系FVB/N的 背景有关。
[0194] 表2示出了在研究过程中所有小鼠的总体存活情况的概要。
[0195]表 2
[0196] 治疗过程中的存活率（死亡的所有原因）
[0197]
[0198] *在组K中，一只小鼠在研究开始时被替换。可以用也可以不用这只替换小鼠来进 行数据分析。
[0199] 处死之后，将小鼠解剖，使用potter型机械均化器（VOS14S40,速率750rpm;VWR) 将脑干和中脑在10倍体积的冰冷的Tris-蛋白酶-磷酸酶-抑制剂缓冲液（TPPI-buffer) 中匀浆，所述缓冲液包含：20mM的Tris-HCl(pH值8.I) ;150mM的NaCl;lmM的乙二胺四乙 酸（EDTA，Merck);lmM的乙二醇四乙酸（EGTA，Sigma-Aldrich) ;5mM的焦磷酸钠（Sigma); 3OmM的氣化钠（Sigma-Aldrich);ImMPMSF(Sigma);2mM的f凡酸钠（Sigma);IOmM的 1，10-邻菲罗啉（Sigma-Aldrich) ;5iig/ml大豆胰蛋白酶抑制剂；5yg/ml胃酶抑素；和蛋 白酶抑制剂混合物（(CPI,RocheDiagnosticsGmbH,Germany)。分别为 140y1 和IOOy1 体积的脑干和中脑匀浆的固体体积（TotH)(大约一半的总体积），在4°C下，以136000xg离 心60分钟（TLA-55转子，OptimaTMTLX超速离心机，BeckmanCoulter)，以产生Tris-可溶 组分（SF)，总匀浆的剩余部分储存在-80°C下。由于离心支架的数量有限（N= 12)，将样品 随机化以使离心机平衡并划分不同的治疗组经历不同的离心分离过程。
[0200] 从球团（Pl)分离上清液（S1，也称为"可溶性组分"或"SF")，等分并储存在-80°C 下。Pl球团溶解在10倍体积的高盐溶液（含TPPI-缓冲液的0. 85M氯化钠）中，并在4°C下 以20000xg离心30分钟。所得高盐球团（P2)储存在-80°C下。在顶置式（top-over-top) 旋转滚筒内，上清液（S2)与1%的肌氨酰以及十分之一的10%肌氨酰接触，并且在室温下 孵育60分钟，然后在4°C下，以136000xg离心60分钟。可溶于肌氨酰的上清液（S3)储存 在-80°C下，并且不溶于肌氨酰的球团（P3,也被称为"不溶性组分"或"IF"）重悬于30iil 的TPPI缓冲液中并等分。通过上述的分馏方案产生的总匀浆（TotH)、Tris-可溶（SF)和 不溶于肌氨酰（IF)脑干组分用于随后的聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析。
[0201] 聚丙懦酰胺凝胶电泳和Western印迹。为了应用于常规SDS-PAGE和Western印 迹，样品通过在95°C下孵育10分钟变性并缩小，然后在7. 5%的Tris-HCl凝胶（标准XT 预制凝胶，26孔梳，15y1，I. 0mm;Biorad公司）上分离。干电转移（iBlot?Invitrogen) 到PVDF-膜（iBlot?GelTransferStacks，PVDF，Regular，Invitrogen)后中，将膜在 0.4%PFA中洗涤30分钟，然后在Tris-缓冲盐溶液中洗涤。下一步将膜在含有5% (重 量/体积）脱脂奶粉和〇? 1 % (体积/体积）Tween-20的Tris缓冲盐溶液（TBS，pH7. 6)孵 育1小时。以表3中所示的工作浓度用各种抗tau蛋白第一抗体孵育印迹过夜。用抗小鼠 或抗兔HRP偶联的第二抗体（山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG，DAK0)洗涤并孵化后，用ECL检 测系统（SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate，产品 34096，Thermo Scientific)观察（develop)印迹。用不同的曝光时间数字化地记录图像（VisionWorks Acquisition，UVP)，并用专用软件（VisionWorksAnalysis，UVP)分析印迹。为了作比较， 将跨凝胶参照凝胶与待比较的将在每个凝胶上电泳的等份的四个馏分一起电泳。用于检测 的抗tau第一单克隆抗体包括ATlOO(磷酸化-Tau，ThermoScientific;稀释比I:250)， AT8 (磷酸化-Tau，ThermoScientific;稀释比I:500)，HT7 (泛tau，Pierce;稀释比 1 : 1000)，和1F5(对于测试设备来说，表位未知，Neotope，稀释比3 :500)。用抗GAPDH(Abeam 9485 ;稀释比I:2500)探针标记的印迹作为上样对照。泛tau抗体对于磷酸化-Tau没有特 异性。
[0202] 表 3
[0203] 用于生化分析的抗体的总结
[0204]
[0205] *IgG2b同种型，JH131-1F5. 4. 1 杂交瘤，lot_B-0081
[0206] 如图4所示，与用6F10对照抗体处理的动物相比，用16B5抗体处理的动物中观 察到在不溶于肌氨酰的脑干组分中tau蛋白的量统计学上显著地降低。使用斯氏t检验 评估统计学显著性，P〈〇. 05。磷酸化-tau特异性抗体（AT8,左上图；AT100,左下图；1F5， 右上图）的泛tau抗体（HT7,右下图）观察这种降低。当用磷酸化特异性抗体检测时，相 对于6F10抗体处理的对照动物，在用16B5处理的动物中，总匀浆的蛋白质印迹也显示磷酸 化-tau/总tau的比例显著降低。参见图5,左图（示出了用AT8抗磷酸化tau抗体检测 的信号通过HT7泛tau抗体检测的信号分开）。与此相反，相对于6F10抗体处理的对照动 物，在用16B5处理的动物中，总tau与总匀浆中的GAPDH水平的比例没有显著变化。参见 图5,右图（示出了用HT7泛tau抗体检测的信号通过GAPDH抗体检测的信号分开）。这些 数据提供证据表明在匀浆中磷酸化-Tau而不是总tau的水平发生降低。
[0207]组织学分析。在底丘脑核附件未定带（STH/ZI)和小脑的中间核、前部和后部、附 件侧小脑核（IntA/P/LAT)中进行使用抗磷酸化tau抗体的免疫组化分析。将弧形振动切 片机切片（40ym)存放于4°C的具有0. 1 %叠氮化钠的PBS中，直至使用。每只小鼠前囟门 处表示的八个切片用mAbAT8、AT100或1F5自由浮动地染色。在下表4中列出了用于使用 示出的抗体染色所选的切片。对所选的用于特定染色的所有动物的切片进行随机染色和盲 定量（blindedquantification) 〇
[0208] 在Netwells?中孵育自由浮动切片。然后在PBS中将切片洗涤两次，并在PBS和甲 醇（1 :1)的1. 5%过氧化氢中孵育20分钟以除去内源性过氧化物酶的活性。用含有0. 1% 的TritonXIOO(PBST)的PBS中洗涤切片三次后，在PBST的10%胎牛血清（FCS)中将切片 封闭30分钟，接着在具有10 %FCS的PBST中，与第一抗体AT8、AT100(ThermoScientific) 一起孵育过夜，抗体的使用浓度分别为〇. 4yg/ml和0. 05yg/ml。漂洗后，将切片与山羊抗 小鼠过氧化物酶标记的（GAMPO)第二抗体（DAKO，PBST中的1/500,10%FCS) -起孵育，且 信号用3, 3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB，每IOmlTris-盐酸1片与每IOml的3ylH2O2) 显影。将切片用Mayer氏苏木素共染色，在在五个梯度的乙醇（50、70、95和2X100% )和 二甲苯（MerckEurolab)中脱水，并固定在Depex(Depex固定介质，BDH实验室）。
[0209]表 4
[0210] 用于免疫组织化学分析的抗体的总结
[0211]
[0212] 由配备有ColorviewIIOlympus相机的OlympusBX41显微镜获取图像，并用计 算机使用AnalySISFive-CeirD软件进行分析。在整个图像获取过程中，显微镜的光强 度和聚光器的设置保持恒定。所有获取的图像进行相同的计算机子程序，以使研究者偏差 最小化。在整个分析中统一使用密度切片阈值。
[0213] 选择如下所定义目的的区域用于（多个）染色信号的自动定量。底丘脑核和未定 带分别由大脑脚腹侧和白质背侧，并基于细胞密度的差异描绘出轮廓（弓形小脑切片前囟 1，32-1，92)。小脑的中间核，前部和后部，侧面小脑核由白质和细胞密度的变化以及第三脑 室描绘出轮廓（弓形小脑部分，前囟门用于LAT的1，92-2, 64和用于IntA/P的0,84-1. 8)。 对于每个染色而言，在分析中每个小鼠有6个含有STH/ZI的脑切片和16个含有IntA/P/ LAT的切片。
[0214] 如图6所示，相比于用6F10抗体处理的对照动物的相同结构中检测的磷酸化-tau 的量，用16B5抗体处理的动物在小脑核及底丘脑区域中检测到磷酸化-tau的量显著降低。 使用斯氏t检验评估统计显著性，p〈0. 05。
[0215] 实施例5. 16B5的人源化
[0216] 序列分析表明，16B5抗体具有可变的k(Vk)域，其具有序列SEQIDNO:16,其属于 鼠Kabat的亚组1，并对应于人的Kabat亚组4。KabatCDR用下划线标出。16B5抗体的重 链可变区（Vh)具有序列SEQIDNO:10,其属于小鼠的Kabat亚组2b，并对应于人的Kabat 亚组I(Kabat等人（1991)，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第 5 版； NIH出版号91-3242)。KabatCDR用下划线标出。
[0217]The16B5Vk域包含 17 个残基CDR-Ll序列（KSSQSLLNSRTRKNYLA,SEQID NO: 17), 7个残基CDR-L2序列（WASTRES,SEQIDNO: 18)以及8个残基CDR-L3(KQSYTLRT,SEQ IDNO: 19)。⑶R-Ll序列属于典型类别3,且⑶R-L2和⑶R-L3序列属于类别 I(Martin&Thornton(1996)，J.Mol.Biol. 263:800-15)〇
[0218] 16B5Vh域包含基于Kabat编号的 5 残基的CDR-Hl序列（YHGMD，SEQIDNO:11) 或基于组合的Kabat和Chothia编号的10个残基的CDR-Hl序列（GYPFTYHGMD，SEQIDNO: 24)，17 个残基的CDR-H2 序列（WINTYSGVPTYADDFKG，SEQIDNO: 12)，和 8 个残基的CDR-H3 序列（RRDFTMDF，SEQIDN0:13)。⑶R-Hl序列属于典型类别1，并且⑶R-H2序列属于类别 2 (Martin&Thornton(1996)，J.Mol.Biol. 263:800-15)。CDR-H3 序列没有典型类别，但根据 Shirai等（1999)，FEBSLett. 455:188-97的规则可能具有扭结的碱基。
[0219] 在Vk和Vh域之间的界面的残基是通常在小鼠这些位置的残基。
[0220] PDB数据库的蛋白质序列中进行检索（Deshpande等，（2011)，J. Virol. 85:1820-33)以找到能够提供16B5抗体的粗略结构模型的结构。抗霍乱毒素抗体 Fab片段Te33(pdb代码1ZEA_H)的结构用作具有I. 78A的分辨率的VL。它保留了与16B5 相同的标准环结构。在Dsbb-Fab复合物（pdb代码2ZUQ_B)中Fab的晶体结构用做16B5 的VH域的模型。它解决了 3. 3A的分辨率并含有与⑶R-Hl和⑶R-H2相同的典型结构，及 相同长度的带有扭结的CDR-H3。所述BioLuminate程序用来模拟16B5Fv的粗略结构。
[0221] 具有⑶R"X"的16B5FV序列的来自NCBI的非冗余蛋白质序列数据库的一个检索 允许选择合适的人类框架，其中移植了鼠科CDR。对于Vk，选择具有NCBI登录码ACJ71718. pro的人K轻链（SEQIDNO:20)。所述人K轻链序列具有相同的典型类别的⑶R-L2和 L3。对于Vh，选择人Ig重链BAC02002.I(SEQIDNO:14)。它具备 16B5CDR-H1 和H2 的典 型形式，并且H3的长度为具有预计扭结碱基的8个残基。
[0222] 分别在表5和表6中示出了基于这些人框架中的人源化的重链和轻链设计以及回 复突变。
[0223] 设计具有序列SEQIDNO:15的人源化16B5可变重链（Hl)。所述设计包括三个 回复突变：R13K、V48M和Y98F。选择位置13的K，因为它比人类中的R更加频繁。选择在 位置48上的M，因为它比人类中的V更加频繁。选择在位置98的F，因为它位于接口处，使 得它被期望保留小鼠残基。
[0224] 设计3个人源化16B5可变轻链序列：
[0225] 版本I(LI)具有序列SEQIDNO:21并包括三个回复突变：D1N、M4L和Y36F。选 择在位置1的N，因为它与在HCDR2的N61形成潜在氢键。选择在位置4的L，因为它接触 LCDR3中的K96、Q97和S98 ;它还接触接口残基F104。选择位置36的F，因为Y能够与HCDR3 中的D106形成氢键，而F不能。氢键将构成可能影响HCDR3功能的额外的相互作用，且因 此最好避免。
[0226] 版本2(L2)具有序列SEQIDNO:22并包括四个回复突变：D1N、M4L、Y36F和P43S。 对于D1N、M4L和Y36F选择的基本原理与版本1相同。选择在位置43的S，因为S与VH中 的QllO形成氢键，其接近HCDR3。
[0227] 版本3 (L3)具有序列SEQIDNO:23并包括三个回复突变：M4L、Y36F和P43S。这 些突变的每个的选择原理与版本1和2相同。
[0228]表 5
[0229] 用于人源化16B5重链的序列
[0230]
[0252] 实施例6.人源化的16B5抗体的Tau亲和性
[0253] 下表7中示出了具有HlLl或H1L2设计的人源化16B5抗体的结合数据示。为了 比较，还示出了嵌合的16B5的结合数据。使用Biacore仪器产生数据。得出的结论是版本 H1L2具有最强的亲和力，基本上与嵌合的16B5相同。人源化的16B5版本HlLl和H1L3也 具有足够的亲和力。
[0254] 使用BiacoreT200(GELifesciences)进行表面等离子共振测定。所有实验使用 IOmM的流动相以30y1/min的速率流过由胺偶联抗小鼠或抗人捕获抗体制备的CM5传感器 芯片，所述流动相为ffiPES(pH7. 4)、150mM氯化钠和的0. 05%吐温20。16B5(嵌合或人源化 的形式）结合到固定的捕获抗体，并且不同浓度的重组纯化hTau-P301L连续重复地施加到 抗体复合物上。高盐或低PH再生步骤分离重复。用不同制剂的抗体和抗原重复实验。用 机载的Biacore软件进行分析。
[0255]表7
[0256] Biacore数据
[0257]
[0258] 实施例7.用人源化的16B5抗体对Tau进行免疫沉淀检测
[0259] 来自阿尔茨海默病患者的额叶皮层具有Braak分数为6分的尸检样品依次在溶解 度增高的缓冲液中提取，缓冲液按照以下顺序：（i)高盐缓冲液（20mM的Tris、5mM的EDTA、 1禮的01'1\10%蔗糖、75001111 的似(：1，口117.4)，（^)1^仂11缓冲液（201111的1^8、51111的 EDTAUmM的DTT、10%蔗糖、1%的TritonX100、500mM的NaCl，pH7.4)，和（iii)十二烷基 肌氨酸钠缓冲液（IOmM的Tris、5mM的EDTAUmM的DTT、10%蔗糖、500mM氯化钠、1%十二 烷基肌