N0:22至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。优选 地，在此类抗体中保留了H1L2中的一些或所有回复突变。换言之，至少1、2或3个位置的 位置H13被K占据，位置H48被M占据且位置H91被F占据。优选地，至少1、2、3或全部4 个位置的位置Ll被N占据，位置L4被L占据，位置L36被F占据且位置L43被S占据。此 类人源化抗体的⑶R区优选地与H1L2的⑶R区相同或基本相同，H1L2的⑶R区与小鼠供 体抗体相同。所述⑶R区可通过任何常规定义（例如，Chothia)来定义但优选地如Kabat 所定义的。
[0103] 16B5变异体中其它变异的一种可能性是在可变区框架中的额外的回复突变。许 多不与人源化的mAb中的CDR接触的框架残基可以适应来自供体小鼠mAb或其它小鼠或人 抗体相应位置的氨基酸取代，且甚至许多潜在的CDR-接触残基也可以取代或甚至CDR内的 氨基酸可被残基改变，例如，用于提供可变区框架的人受体序列的相应位置发现的残基。此 外，改变的人受体序列可用于，例如，重链和/或轻链。如果使用不同的受体序列，以上推荐 的一个或多个回复突变可能不发生，因为相应的供体和受体残基已经是相同的，而没有回 复突变。例如，当使用其中位置H13已经被K占据的重链受体序列时，回复突变是非必要的。
[0104] 本发明还包括人源化抗体，其中成熟的轻链和重链可变区示出了与人源化的16B5 HlLl抗体的成熟的轻链和重链可变区（分别为SEQIDN0s:21和15)或人源化的16B5H1L3 抗体的成熟的轻链和重链可变区（分别为SEQIDN0s:23和15)至少90%、95%、96%、 97%、98%或99%的序列同一性。
[0105] D.嵌合的及镶饰的抗体
[0106] 本发明还提供嵌合的及镶饰的形式的非人抗体，特别是16B5抗体。
[0107] 嵌合的抗体是其中非人抗体（例如，小鼠）的成熟的轻链和重链可变区与人轻链 和重链恒定区结合的抗体。此类抗体基本上或完全地保留了小鼠抗体的结合特异性，且为 约三分之二的人序列。
[0108] 镶饰的抗体是一种类型的人源化抗体，其保留一些和通常是全部的⑶R以及 一些非人抗体的非人可变区框架残基，但用来自人抗体序列的对应位置的残基取代其 它可能有助于B细胞或T细胞表位的可变区框架残基，例如暴露的残基（Padlan，Mol. Immunol. 28:489, 1991)。结果是产生其中⑶R全部或基本上来自非人抗体的抗体，并且通 过取代使得非人抗体的可变区框架更人类化。本发明中包括任何镶饰形式的16B5抗体。
[0109]E.人抗体
[0110] 通过下述各种技术提供了对tau的人抗体。产生人抗体的方法包括三源杂交瘤 方法（Oestberg等，Hybridoma 2:361-367(1983) ;0estberg，U.S. Patent No. 4, 634, 664; 和Engleman等，US Patent 4,634,666)，使用包含人免疫球蛋白基因的转基因小鼠（参 见，例如，Lonberg等，W093/12227 (1993) ;US 5, 877, 397、US 5, 874, 299、US 5, 814, 318、US 5, 789, 650、US 5, 770, 429、US 5, 661，016、US 5, 633, 425、US 5, 625, 126、US 5, 569, 825、 US 5, 545, 806、Nature 148, 1547-1553 (1994)'Nature Biotechnology 14,826(1996)、 Kucherlapati, WO 91/10741 (1991))及菌体显示方法（参见，例如，Dower等，WO 91/17271和McCafTerty等，WO 92/01047, US 5, 877, 218、US 5, 871，907、US 5, 858, 657、 US 5, 837, 242、US 5, 733, 743和US 5, 565, 332)。
[0111]F.恒宙冈的诜择
[0112] 嵌合的、人源化的（包括镶饰的）或人抗体的重链和轻链可变区可连接于至少一 部分的人恒定区。恒定区的选择部分取决于，是否需要抗体-依赖性补体和/或细胞介导 的细胞毒性。例如，人同种型IgGl和IgG3具有补体介导的细胞毒性，然而人同种型IgG2 和IgG4具有较弱的或无补体介导的细胞毒性。轻链恒定区可以是A或K。抗体可表达为 含有两个轻链和两个重链的四聚体，单独的重链、轻链，Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv，或其中重 链和轻链可变区通过间隔基连接的单链抗体。
[0113] 人恒定区在不同个体中示出了同种异型变异和同族同种异型变异，即所述恒定区 在不同个体中的一个或多个多肽性位置不同。同族同种异型与同种异型的差异在于血清识 别与一个或多个其它同种型的非多态性区结合的同族同种异型。人恒定区的引用包括具有 任何天然同种异型或任何占据天然同种异型中多态性位置的残基的取代或减弱或增强下 述效应功能的达3、5或10个取代的恒定区。
[0114] 轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸，如重链的C-末端赖氨 酸，可以一定比例或全部的分子缺失或衍生。可在恒定区中发生取代以减弱或增强效应功 能，如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见，例如，Winter等，USPatentNo. 5, 624, 821;Tso 等，USPatentNo. 5, 834, 597 ;和Lazar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005, 2006)，或 延长在人体中的半衰期（参见，例如，Hinton等，J.Biol.Chem. 279:6213, 2004)。示例性取 代包括位置250的谷氨酰胺和/或位置428的亮氨酸（在本段恒定区中使用的EU编号）， 用于增加抗体的半衰期。在位置234、235、236和/或237中的任一个或全部的取代降低对 Fey受体的亲和性，特别是FeyRI受体（参见，例如，US6, 624, 821)。人IgGl位置234、 235和237的丙氨酸取代优选地用来减弱效应物功能。可选地，人IgG2的位置234、236和 /或237被丙氨酸取代且位置235被谷氨酰胺取代。（参见，例如，US5, 624, 821.)
[0115]G.重组抗体的表汰
[0116] 嵌合的、人源化的（包括镶饰的）和人抗体通常通过重组表达产生。编码所述抗 体的核酸可进行密码子优化以在所需细胞型（例如，CHO或Sp2/0)中表达。本文所公开的 编码人源化的16B5重链和轻链可变区的核酸具有包含，例如SEQIDNO: 25 (编码Hul6B5 H1)、SEQIDN0:26(编码Hul6B5L1)、SEQIDN0:27(编码Hul6B5L2)或SEQIDN0:28(编 码Hul6B5L3)的序列。对于包含信号肽如SEQIDNOS. 10和16的可变区，所述核酸可以 编码具有或不具有信号肽的可变区。编码重链和轻链的核酸区段可存在于相同的连续的核 酸分子或分开的分子上。重链和轻链可由相同载体或不同载体表达。通常以分离形式提供 核酸。
[0117] 编码人源化的16B5重链可变区的核酸可连接于编码人IgGl恒定区的核酸区段， 例如，具有序列SEQIDNO:30。此类核酸还可包含位于编码重链可变区和IgGl恒定区的区 段之间的内含子，即5'端至编码恒定区的区段。SEQIDN0:31中示出了编码人IgGl恒定 区并在其5'端具有小鼠内含子的示例性核酸序列。
[0118] 编码人源化的16B5轻链可变区的核酸可接于编码人K恒定区的核酸区段，例如， 具有序列SEQ ID N0:33。此类核酸还可包含位于编码轻链可变区和人K恒定区的区段之 间的内含子，即5'端至K恒定区。SEQ ID N0:34中示出了编码人K恒定区并在其5'端 具有人内含子的示例性核酸序列。
[0119] 重组多核苷酸构建体通常包括与抗体链的编码序列可操作地连接的表达调控序 列，其包括天然相关的或异源的启动子区。优选地，所述表达调控序列是载体中能够转化或 转染真核宿主细胞的真核启动子系统。一旦所述载体并入合适的宿主中，宿主维持在一定 条件下以在适于核苷酸序列的高水平表达、以及交叉反应抗体的收集和纯化。编码抗体链 的载体还可以包含可选基因，如二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合成酶，使编码抗体链的核酸 拷贝数扩增。
[0120] 大肠杆菌（E.coli)是特别用于表达抗体的原核宿主，所述抗体特别是抗体片段。 微生物，如酵母也可用于表达。酵母菌是优选的酵母宿主，带有合适的载体，所述载体具有 所需的表达调控序列、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其 它糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括，来自醇脱氢酶、异细胞色素C及负责麦芽糖和半乳糖 利用的酶的启动子。
[0121] 哺乳动物细胞是用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的优选宿主。参 见Winnacker,FromGenestoClones,(VCHPublishers,NY, 1987)。本领域中已研发许多 合适的能够分泌完整异源蛋白质的宿主细胞系，其包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa 细胞、HEK293细胞、L细胞，非抗体产生的包含Sp2/0和NSO的骨髓瘤。优选地，所述细胞是 非人的。这些细胞的表达载体可以包含表达调控序列，如复制起点、启动子、增强子（Queen 等，Immunol.Rev. 89:49(1986))，及必需的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位 点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达调控序列是源自内源基因、巨细胞病 毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等，J.Immunol. 148:1149(1992)。
[0122] 将编码抗体重链和轻链的载体导入细胞培养物中，可在无血清培养基中筛选出用 于生长生产率和产物质量的细胞群。然后将以上产生的细胞群经基于FACS的单个细胞克 隆以产生单克隆系。优选地，具体生长率超过每天每细胞50pg或100pg，其对应的产物效价 大于7. 5g/L培养基。由单个细胞克隆产生的抗体还可检测浊度、过滤性能、PAGE、IEF、UV 扫描、HP-SEC、糖类-低聚糖作图、质谱及结合测定，如ELISA或Biacore。然后将选定的 克隆子在多个小瓶中建库并冻存以备后续使用。
[0123] 抗体一旦表达，可根据本领域的标准流程纯化，所述流程包括蛋白质A捕获、柱色 谱法（例如，疏水作用或离子交换）、用于病毒失活的低pH等（一般参见，Scopes, Protein Purification(Springer-Verlag, NY, 1982))〇
[0124] 可以采用商业生产抗体的方法，包括密码子优化、启动子选择、转录元件和终 止子、无血清的单个细胞克隆、细胞建库、使用扩增拷贝数选择性标志物、CHO终止子、无 血清的单个细胞克隆、蛋白质效价的提高（参见，例如，US5, 786, 464、US6, 114, 148、 US6, 063, 598、US7, 569, 339、W02004/050884、W02008/012142、W02008/012142、 W02005/019442、W02008/107388 和W02009/027471，及US5, 888, 809)。
[0125]IV.活性免疫原
[0126] 用于主动免疫的试剂用作在患者中诱导联系上述被动免疫所述的相同类型的抗 体。用于主动免疫的试剂可以是用于在实验室动物中产生单克隆抗体的相同类型的免疫
导与16B5的相同或重叠表位结合的抗体，这些抗体的特异性表位可被作图（例如，通过检 测与一系列重叠肽扫描tau的结合）。然后包含或重叠表位的tau的片段可以用作免疫原。 此类片段通常以未磷酸化的形式而使用。
[0127] 如果使用异源载体和佐剂，其可以与产生单克隆抗体的载体和佐剂相同，但其还 可被选择以得到更好的药物适用性用于人。合适的载体包括血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、免 疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素，或来自其它病原性细菌的类毒素， 如白喉（例如，CRM197)、大肠杆菌、霍乱、或幽门螺杆菌（H.pylori)，或减毒的毒素衍生 物。Tcell表位也是合适的载体分子。一些缀合物可通过连接本发明的试剂形成免疫刺激 聚合物分子（例如，三棕榈-S-甘油半胱氨酸（Pam3Cys)、甘露聚糖（甘露糖聚合物）或葡 聚糖（a0 1 -2聚合物））、细胞因子（例如，IL-UIL-Ia和0肽、IL-2、y-INF、IL_10、 GM-CSF)和趋化因子（例如，MIPl-a和&RANTES)。免疫原可连接到具有或不具有间 隔氨基酸的载体（例如，gly-gly)。其它载体包括病毒样颗粒。病毒样颗粒（VLPs)还称为 假病毒或病毒衍生的颗粒，表示有多个拷贝的病毒衣壳和/或包膜蛋白的亚基结构，其能 够在体内自组装成定义的球形对称￥1^(?〇￥1116^，等，（2007)?1〇30呢2(5):6415)。可 选地，肽免疫原可以连接于至少一个能够结合大部分MHCClassII分子的人工T细胞表 位，如panDR表位（"PADRE")。PADRE如US5,736，142、W0 95/07707,和AlexanderJ等， Immunity，1:751-761(1994)中所述。活性免疫原可以多体形式存在，其中免疫原的多个拷 贝和/或其载体作为单独的共价分子存在。
[0128] 片段经常与药学上可接受佐剂一起施用。相对于单独使用肽时，所述佐剂增加了 诱导的抗体的效价和/或诱导的抗体的结合亲和性。可使用多种佐剂与tau的免疫原片段 结合以引发免疫响应。优选的佐剂增强了对免疫原的固有响应而不引起影响响应定性形 式的免疫原的构象变化。优选的佐剂包含铝盐，如氢氧化铝和磷酸铝，3脱氧酰化单磷酰脂 质A(MPLtm)(参见GB2220211(RIBIImmunoChemResearchInc. ,Hamilton,Montana,now partofCorixa)。Stimulon?QS-21 是由南美洲发现的阜皮树（QuillajaSaponaria Molinatree)的树皮中分离的三砲阜苷或阜苷（参见Kensil等，inVaccineDesign:The SubunitandAdjuvantApproach(Powell&Newman编,PlenumPress,NY, 1995)；US 5,057,540),(AquilaBioPharmaceuticals,Framingham,MA；nowAntigenics,Inc. ,New York,NY)。其它佐剂是水包油乳剂（如角鲨烯或花生油），任选地与免疫刺激剂结合，如单 磷酸脂质A(参见Stoute等，N.Engl.J.Med. 336, 86-91 (1997))、复合聚合物及灭活的分枝 杆菌。Ribi佐剂是水包油乳剂。Ribi含有可代谢的油（角鲨烯），其由含有吐温80的生理 盐水乳化。Ribi还含有精练的分枝杆菌产物，其用作免疫刺激剂和细菌单磷酸脂质A。另 一种佐剂是CpG(W0 98/40100)。佐剂可作为与活性剂的药物组合物的组分施用或单独施 用，可在药剂之前、同时或之后施用。
[0129] 还可使用tau天然片段的类似物诱导抗体对抗tau。例如，在这种肽中一个或多 个L氨基酸可由D氨基酸取代。而且氨基酸的顺序逆转（反转肽）。任选地肽包含所有逆 序的D氨基酸（反转-变型肽）。肽和其它化合物不必具有与tau肽的显著的氨基酸序 列相似性，但其仍可作为tau肽的模拟物并诱导相似的免疫响应。还可使用如上所述的抗 tau单克隆抗体的抗独特型抗体。此类抗独特型抗体可模拟抗原并产生免疫响应（参见 EssentialImmunology,Roit编，BlackwellScientificPublications,PaloAlto,CA6th ed.，p. 181) 〇
[0130] 肽（和任选地融合到肽的载体）还可以编码肽的核酸形式施用并在患者中原位表 达。编码免疫原的核酸区段通常与调控元件连接，如允许在患者的预期靶细胞中表达DNA 区段的启动子和增强子。对于在血细胞中表达，如诱导免疫反应所需的，来自轻链或重链免 疫球蛋白基因的启动子和增强子元件或CMV主要中间体早期启动子和增强子适合直接表 达。连接的调控元件和编码序列通常克隆到载体。抗体还可以编码抗体重链和/或轻链的 核酸形式施用。如果重链和轻链都存在，所述链优选地连接为单链抗体。被动施用的抗体 也可以被制备，例如，通过肽免疫原治疗的患者血清的亲和层析。
[0131]DNA可以裸形递送（S卩，无胶体或封装材料）。可选地可使用大量病毒 载体系统，包括逆转录病毒系统（参见，例如，Lawrie和1\1111；[11，(]111\0卩;[11.661161:. Develop. 3, 102-109(1993));腺病毒载体adenoviralvectors{参见，例如，Bett 等，J.Virol. 67, 5911 (1993)};腺相关病毒载体{参见，例如，Zhou等，J.Exp.编， 179, 1867(1994)}，来自包含牛痘病毒和禽痘病毒的痘病家族的病毒载体，来自甲病毒 属的病毒载体，如源自辛德毕斯森林脑炎病毒的那些病毒Sindbis和SemlikiForest Viruses(参见，例如，Dubensky等，J.Virol. 70, 508-519 (1996))，委内瑞拉马脑炎病 毒（参见US5, 643, 576)和弹状病毒，如水泡性口炎病毒（参见WO96/34625)和乳头 状瘤病毒（Ohe等，HumanGeneTherapy6,325-333(1995);Woo等，WO94/12629 和 Xiao&Brandsma，NucleicAcids.Res. 24, 2630-2622(1996))0
[0132] 编码免疫原的DNA，或含有所述DNA的载体，可包装到脂质体中。US 5,208,036、US 5, 264, 618、US 5, 279, 833和US 5, 283, 185描述了合适的脂质体和相关类似物。载体和编 码免疫原的DNA还可吸附到和连接到颗粒载体，其实例包含聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚 (乳酸-共-乙醇酸）（参见例如，McGee等，J. Micro Encap. I"6)〇
[0133]V.筛选方法
[0134] 如上所述根据预期结合特异性初步筛选抗体。同样可根据诱导具有此类结合特异 性的抗体的能力筛选出活性免疫原。在这种情况下，活性免疫原用于免疫实验室动物，且获 得的血清用于测试合适的结合特异性。
[0135] 然后将具有所需结合特异性的抗体在细胞和动物模型中进行测试。用于这种筛选 的细胞优选为神经元细胞。已报道tau病理的细胞模型，其中用tau的四重结构域，任选地 tau病理相关的突变体转染神经母细胞瘤细胞（例如，5K280,参见Khlistunova,Current AlzheimerResearch4, 544-546 (2007))。在另一模型中，在神经母细胞瘤N2a细胞系中通 过添加多西环素诱导tau。细胞模型能够使人研究出tau对水溶性或聚合状态细胞的毒性、 tau基因表达转换后tau聚集的产生、基因表达转换为关闭后tau聚集的消失以及抗体抑制 tau聚集形成或使其分解的效率。
[0136] 还可在tau相关疾病的转基因动物模型中筛选抗体或活性免疫原。此类转基因动 物可以包含tau转基因（例如，任何人同种型）和任选地人APP转基因，如磷酸化tau的激 酶、ApoE、早老素或a突触核蛋白。这种转基因动物用于研发tau相关疾病的至少一个体 征或症状。
[0137] 不例性转基因动物是K3系小鼠（Itner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105 (41) :15997-6002 (2008))。这些小鼠具有K3691突变的人tau转基因（所述突变与皮 克氏病有关）和Thy1. 2启动子。所述模型示出了快速的神经退行性过程、运动障碍及传入 纤维和小脑颗粒细胞变性。另一个示例性动物是PR5系小鼠。这些小鼠具有P301L突变的 人tau转基因（所述突变与额颞叶痴呆有关）和Thy1.2启动子（Taconic,Germantown,N. Y. ,Lewis,等，NatGenet. 25:402-405(2000))。这些小鼠具有更渐进的神经性退行过程。 所述小鼠在几个脑区域和脊髓形成神经原纤维缠结，其通过引用的方式整体并入本文。这 是一个可研究缠结产生的原因及筛选抑制聚集体产生的治疗的优良模型。这些动物的另一 个优势是相对较早的病理的发作。在纯合系中，与tau病理相关的行为异常可至少早在3 个月时观察到，但动物至少直到8个月还保持相对健康。换言之，在