修饰的犬瘦素多肽的制作方法
【专利说明】修饰的犬瘦素多肽
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请号61/779, 337的权益。
[0003] 序列表
[0004] 本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并因此以其整体通过引用并 入。在2014年3月7日产生的所述六5(：11副本，被命名为204257-0016-冊-00(509186)_ SL.txt，大小是2, 597字节。
[0005] 本发明涉及聚乙二醇（PEG)修饰的犬瘦素多肽和相关的组合物，以及可用于治疗 陪伴动物肥胖及其它瘦素相关病症的方法。
[0006] 瘦素（1印tin)是一种神经激素，它在下丘脑起作用，来调节能量平衡和食物摄 入。关于与瘦素及其对人的受体有关的问题，已经记载了很多（US2012/0149, 636)，但是，陪 伴动物也遭受瘦素相关病症。特别值得注意的是陪伴动物，例如犬，其经受有瘦素-病症， 例如肥胖。虽然在人中施用外源性瘦素作为治疗是已知的，但它仍被几个问题所妨碍，最重 要的是不能提供持久的效果。因而，正在进行为发现更好的替代物的努力，这些努力包括发 现对人以及陪伴动物更安全、更持久且更有效的化合物。
[0007] 本发明提供包含SEQIDNO: 1的多肽和聚乙二醇（PEG)部分的化合物，其中PEG 部分共价连接至SEQIDNO: 1的多肽的对-乙酰-苯丙氨酸（pAF)残基。
[0008] 本发明还提供一种治疗陪伴动物中肥胖的方法，其包括将有效量的根据本发明的 化合物施用至有需要的动物。
[0009] 本发明还提供一种预防陪伴动物中肥胖的方法，其包括将有效量的根据本发明的 化合物施用至有需要的动物。
[0010] 本发明还提供一种根据本发明的化合物，其用于治疗。
[0011] 本发明还提供一种根据本发明的化合物，其用于治疗肥胖。
[0012] 本发明还提供一种根据本发明的化合物，其用于预防肥胖。
[0013] 本发明还提供一种组合物，其包含根据本发明的化合物和一种或多种载体、稀释 剂或赋形剂。
[0014] 多肽的氨基酸序列是：
[0015]
[0016] 其中，Xaa是对-乙酰-苯丙氨酸（pAF)(SEQIDNO: 1)。
[0017] 编码SEQIDNO: 1的氨基酸序列的DNA分子的实例是：
[0018]
[0019] 作为处理的结果，第一甲硫氨酸可被切割，因而不存在于成熟多肽中，导致形成第 一甲硫氨酸切割和未切割的SEQIDNO1的混合物。优选地，最终混合物含有小于百分之 十（10)或小于百分之五（5)的其中第一甲硫氨酸被切割的SEQIDNO1。最优选地，最终 混合物含有2%或更低的其中第一甲硫氨酸被切割的SEQIDNO1。
[0020] 非天然存在的氨基酸是本领域已知的。已知一种特定的非天然存在的氨基酸被称 为对-乙酰-苯丙氨酸（PAF)。本发明的多肽可以在体内产生，利用修饰的tRNA和tRNA 合成酶来并入响应在编码多肽的基因中的琥珀终止密码子的pAF，如在US2012/0149, 636 中描述的。将指导SEQIDNO:1的多肽表达的表达质粒或载体转染至修饰的大肠杆菌 K-12W3110菌株。大肠杆菌K-12宿主菌株是W3110衍生物，它被修饰来包含这样的质粒，所 述质粒含有在并入PAF位点处带有琥珀终止密码子（TAG)、在SEQIDNO:1的位置112处有 Xaa的DNA序列。质粒还含有来源于詹氏甲烧球菌（Methanococcusjannaschii)DSM2661 的修饰酪氨酰tRNA和氨酰-tRNA合成酶（aa-RS)对（MjTyrCUAtRNA和Tyr-RS)的基因。 该对被修饰且遗传选择来并入响应琥珀终止密码子的pAF。
[0021] 用于本发明中的PEG部分具有IkDa至100kDa、或IkDa至50kDa、或20kDa至50kDa 的平均分子量。优选的PEG部分具有约20kDa的分子量。另一优选的PEG部分具有约30kDa 的分子量。又另一优选的PEG部分具有约40kDa的分子量。PEG用于包括直链和支化的聚 合物两者。大部分PEG是可商购获得的。优选地，PEG是30kDaPEG(a-甲基氨基乙 氧基氨基甲酰基、聚氧乙烯。
[0022] 动物是指陪伴动物，例如犬和猫。
[0023] 本发明的化合物可用于治疗具有由瘦素调节的病症的陪伴动物。这种病症包括肥 胖和肥胖诱导的或肥胖相关的病症。肥胖是一种状况，其中存在与瘦肉组织相比过量的脂 肪组织。肥胖和肥胖诱导的或肥胖相关的病症的治疗是指：施用本发明的化合物来减少食 物摄入，以优先减少脂肪组织的量，并减少肥胖的陪伴动物的体重。一种治疗结果可以是： 相对于在施用本发明化合物之前动物的体重，减少肥胖陪伴动物的体重。治疗可适当地导 致动物减少食物或热量摄入，包括减少总食物摄入，和减少有需求的动物的重量。肥胖和肥 胖相关的病症的预防是指：施用本发明的多肽来减少食物摄入，以减少体重，或者维持处在 肥胖风险中的动物的体重。预防的另一结果可以是预防之前由于饮食、锻炼或药物疗法而 减去的体重的体重恢复。预防的另一结果可以是，如果在肥胖开始之前，在处于肥胖风险中 的动物中施用治疗的话，则预防肥胖发生。
[0024] 本发明的化合物可以与在对具有通过犬瘦素调节的病症的动物的疗法中或者用 于治疗所述动物的一种或多种其它活性成分组合或者利用所述一种或多种其它活性成分。
[0025] 本发明的化合物可以并入适合于施用至动物的组合物中。设计这种组合物来适 合于选择的施用方式，并且适当地使用可接受的稀释剂、载体、和/或赋形剂例如分散剂、 缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。所述组合物可以按照常规技术设 计，所述技术公开在例如Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy，第 19 版， Gennaro,编辑，MackPublishingCo.，Easton，PA1995中，其提供了如从业者通常已知的 制剂技术的概略。组合物用的合适的载体包括当与本发明的化合物组合时，保持该化合物 的活性并且是与动物免疫系统非反应性的任何材料。本发明的组合物包含化合物和一种或 多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0026] 包含本发明化合物的组合物可使用标准的施用技术施用至处于显示如本文中描 述的疾病或病症的风险中的动物。本发明的组合物含有有效量的本发明的化合物。有效量 是指：实现所需治疗结果（以剂量计和对于时间段和对于施用方式）的量。化合物的有效 量可根据例如动物的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在动物中引起所需反应的能 力因素而改变。有效量也是其中治疗有益效果超过化合物的任何毒性或不利影响的量。有 效量可以是动物初始体重的大约2% /周，直至动物达到如由兽医和客户确定的所需体重。 有效量/剂量可以为每周约〇. 1至约l〇mg/kg动物重量，例如通过皮下注射来施用。有效 量/剂量可以是通过SC注射每周一次施用的lmg/kg。
[0027] 实施例1
[0028] SEQIDN0:1的多肽基本上按照US2012/0149,636中所述获得的。SEQIDN0:1 的多肽在pH4. 0下20mMTris;2M尿素；和50mM甲硫氨酸中被配制成4mg/mL。以10 : 1的 PEG与多肽摩尔比，向该配制的多肽加入30KPEG(a-甲基氨基乙氧基氨基甲酰基， 聚氧乙烯，SunbrightME-300CA，N0F，日本）。将多肽和PEG轻轻混合，并且允许在28°C下 进行48-72小时的缀合。然后，通过常规的阳离子交换层析将PEG化的多肽纯化，并在具有 4%海藻糖的PBS(磷酸盐缓冲盐水）7. 4中配制成lmg/mL。该处理导致形成含有1-2%之 间的SEQIDNO:1的混合物，其中第一甲硫氨酸被切割掉。
[0029] 体外牛物数据
[0030] 利用在STAT3响应元件控制下的萤光素酶报告基因和OB-Rb(瘦素受体）（其被表 达在细胞表面上）两者将J1EK293细胞稳定地转染。瘦素结合至瘦素受体，并活化STAT3同 二聚体和STAT3/STAT1异二聚体，其与STAT3序列响应元件相互作用并与其结合。该相互作 用驱动萤光素酶基因的表达，并刺激细胞产生发光。发光的量与化合物的活性成比例。生 物活性是基于4-PLS形曲线的EC50。
[0031]第一天
[0032] 将细胞以20, 000个细胞/孔接种到96孔板中，并放置在37°C、5% 0)2培养箱中 24-30小时。
[0033]第二天
[0034] 野生型（WT)犬瘦素和实施例1的PEG化多肽的起始浓度是1200ng/mL。从中，从 各个样品取出400yL体积，并且越过稀释块的行进行4x连续稀释。首先，将300yL/孔测 定培养基