具有抗真菌、抗菌和生长促进活性的芽孢杆菌属(bacillus sp.)菌株的制作方法
【专利说明】具有抗真菌、抗菌和生长促进活性的芽孢杆菌属（BACILLUS SP.)菌株
[0001] 相关申请案的夺叉引用
[0002] 本申请案主张2012年8月14日申请的美国临时专利申请案第61/683, 174号和 2013年3月15日申请的美国专利申请案第13/835, 677号的益处；所述专利申请案的公开 内容特此出于所有目的以全文引用的方式并入。
技术领域
[0003] 本发明属于生物杀虫剂和害虫控制；特定言之微生物杀虫剂和产生所述微生物杀 虫剂的微生物菌株的领域。
【背景技术】
[0004] 天然产物是由微生物、植物和其它有机体产生的物质。微生物天然产物提供丰富 的化学多样性来源，并且出于医药目的利用天然产物存在悠久的历史。尽管强调天然产物 用于人类治疗法，其中超过50%衍生自天然产物，但仅有11 %的杀虫剂衍生自天然来源。 尽管如此，天然产物杀虫剂具有在常规和有机农场两者中在控制害虫方面起到重要作用的 潜能。由微生物（细菌、放线菌和真菌）产生的二级代谢物提供新颖的化合物，其可以单独 使用或与已知化合物组合使用以有效控制昆虫害虫并且降低抗性发展的风险。存在若干成 功作为农业杀虫剂的微生物天然产物的众所周知的实例（Thompson等人，2000 ;Arena等 人，1995 ;Krieg 等人 1983)。
[0005] 微生物杀虫剂的发展开始于在纯培养物中分离微生物。其随后在温室中和在野外 使用活体外、活体内或中试规模试验继续进行功效和波谱筛选。同时，由微生物产生的活性 化合物经分离和识别。为了商业化微生物杀虫剂，微生物必须通过以工业规模发酵并且与 审批通过的生物相容性添加剂一起调配来经济地生产，以增加功效并且最大化易于应用。 随着对化学杀虫剂逐渐增加的抗性发展，可用杀虫剂的范围变窄。另外，非天然存在的杀虫 剂可能具有有害的环境影响。因此，需要植物病原体尚未对其产生抗性并且具有最低限度 环境影响的新的天然存在的杀虫剂。
【发明内容】
[0006] 本文中公开一种具有杀虫活性的微生物菌株，芽孢杆菌属（Bacillus sp.)分离物 F727。这种菌株产生在控制害虫和促进植物生长中呈活性的生物活性代谢物。还公开了使 用芽孢杆菌属分离物727和其代谢物用于控制害虫和促进植物生长的方法。在一具体实施 例中，芽孢杆菌属可以具有NRRL B-50768的识别特征中的至少一个。
[0007] 此外，芽孢杆菌属可以具有16S rRNA基因序列，其与在SEQ ID NO: 3中阐述的共 有序列具有至少99%的一致性并且确切地说99. 5%的一致性，并且所述序列包含正向序 列，其与在SEQ ID NO: 1中阐述的序列具有至少99%的一致性并且确切地说995%的一致 性，以及反向序列，其与在SEQ ID N0:2中阐述的序列具有至少99%的一致性并且确切地说 99. 5%的一致性。
[0008] 更提供实质上纯的培养物或全细胞培养液，其包含所述菌株或细胞分离物、提取 物、上清液及/或衍生自所述菌株或其提取物的物质或化合物。
[0009] 更提供用于调节植物的害虫侵扰的方法，其包含向植物和/或其种子和/或用于 生长所述植物的基质施加有效调节所述害虫侵扰的量的所述芽孢杆菌属分离物F727 (和 /或培养物、细胞分离物、提取物、上清液及/或衍生自所述菌株或提取物的物质或化合 物）。在某些实施例中，害虫是植物真菌，例如霜霉属（Bremia)、葡萄孢属（Botrytis)、 核盘菌属（Sclerotinia)、单丝壳属（Sphaerotheca)、丝核菌属（Rhizoctonia)、炭 疽菌属（Colletotrichum)、镰孢菌属（Fusarium)、轮枝孢属（Verticillium)、疫霉 属（Phytophthora)或离懦孢属（Bipolaris)。在其它实施例中，害虫是细菌，例如欧 文菌属（Erwinia)、假单胞菌属（Pseudomonas)、黄单胞菌属（Xanthomonas)、食酸菌属 (Acidovorax)或棍状杆菌属（Clavibacter)。
[0010] 还提供促进植物生长和/或种子发芽的方法，其中所述方法包含向植物和/或其 种子和/或用于生长所述植物的基质施加有效促进植物生长和/或种子发芽的量的所述芽 孢杆菌属分离物F727(和/或培养物、细胞分离物、提取物、上清液和/或衍生自所述菌株 或提取物的物质或化合物）。
[0011] 在具体实施例中，所述芽孢杆菌产生选自由以下组成的群组的化合物：
[0012] (a)化合物 "A"，其
[0013] (i)可自芽孢杆菌属，确切地说芽孢杆菌属分离物727获得；
[0014] (ii)具有杀虫活性；
[0015] (iii)如通过液相色谱法/质谱分析（LC/MS)测定，具有约1020-1060并且更确切 地说1044的分子量；
[0016] (iv)具有 δ 7· 15、6· 72、4· 81、4· 70、4· 65、4· 40、4· 35、4· 25、4· 15、3· 85、3· 65、 3·50、3·22、2·85、2·80、2·65、2·45、2·35、2·30、2·20、1·95、1·55、1·31、1·20 和 0.85 的1H NMR 值；
[0017] (V)使用在0· 5mL/min流动速率下的水：乙腈（CH3CN)梯度溶剂系统（0-20min ; 90-0 % 水性 CH3CN, 20-24min ;100 % CH3CN, 24-27min ;0-90 % 水性 CH3CN, 27-30min ;90 % 水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18 HPLC (菲罗门（Phenomenex)，Luna 5 μ C18 (2) 100A，100 X 4. 60mm)管柱上具有约6-12分钟，更确切地说约8分钟并且甚至更确 切地说约8. 31分钟的高压液相色谱（HPLC)滞留时间；
[0018] (vi)任选地含有47个碳、72个氢、12个氮和15个氧；并且
[0019] (vii)任选地是肽，并且可以包含谷氨酰胺（1单位）、脯氨酸（1单位）、丝氨酸（1 单位）、酪氨酸（1单位）和天冬酰胺（3单位）；
[0020] (b)化合物 "B"，其
[0021] (i)具有杀虫活性；
[0022] (ii)如通过液相色谱法/质谱分析（LC/MS)测定，具有约1030-1080并且更确切 地说1058的分子量；
[0023] (iii)使用在0· 5mL/min流动速率下的水：乙腈（CH3CN)梯度溶剂系统（0-20min ; 90-0 %水性 CH3CN, 20-24min ; 100 % CH3CN, 24-27min ;0-90 %水性 CH3CN, 27-30min ;90 %水 性CH3CN)和在2IOnm下的UV检测，在反相C-18 HPLC管柱上具有约6-14分钟，更确切地 说约8分钟并且甚至更确切地说约8. 67分钟的高压液相色谱（HPLC)滞留时间；
[0024] (iv)任选地包含48个碳、74个氢、12个氮和15个氧；并且
[0025] (V)任选地是肽，并且可以包含谷氨酰胺（1单位）、脯氨酸（1单位）、丝氨酸（1单 位）、酪氨酸（1单位）和天冬酰胺（3单位）；以及
[0026] (c)化合物 " C "，其
[0027] (i)具有杀虫活性；
[0028] (ii)如通过液相色谱法/质谱分析（LC/MS)测定，具有约1050-1120并且更具体 地说1072的分子量；
[0029] (iii)使用在0· 5mL/min流动速率下的水：乙腈（CH3CN)梯度溶剂系统（0-20min ; 90-0 %水性 CH3CN, 20-24min ; 100 % CH3CN, 24-27min ;0-90 %水性 CH3CN, 27-30min ;90 %水 性CH3CN)和在2IOnm下的UV检测，在反相C-18 HPLC管柱上具有约6-14分钟，更确切地 说约9分钟并且甚至更确切地说约9. 19分钟的高压液相色谱（HPLC)滞留时间；
[0030] (iv)任选地含有49个碳、76个氢、12个氮和15个氧；并且
[0031] (V)任选地是肽，并且可以包含谷氨酰胺（1单位）、脯氨酸（1单位）、丝氨酸（1单 位）、酪氨酸（1单位）和天冬酰胺（3单位）。
[0032] 本文中还提供具有以下特征的芽孢杆菌菌株：
[0033] (a)以下中的至少一者：
[0034] (1)与在SEQ ID NO:3中阐述的16SrRRNA序列具有至少99. 5% -致性的核苷酸 序列；
[0035] (2)与在SEQ ID NO: 10中阐述的recA序列具有至少95% -致性的核苷酸序列， 以及
[0036] (3)与在SEQ ID NO: 13中阐述的反向phoR序列具有至少90%-致性的核苷酸序 列；
[0037] (b)产生一或多种化合物，其
[0038] Q)具有杀虫活性；
[0039] (ii)如通过液相色谱法/质谱分析（LC/MS)测定，具有约1020-1120的分子量，并 且
[0040] (iii)使用在〇· 5mL/min流动速率下的水：乙腈（CH3CN)梯度溶剂系统（0-20min ; 90-0 %水性 CH3CN, 20-24min ; 100 % CH3CN, 24-27min ;0-90 %水性 CH3CN, 27-30min ;90 %水 性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18HPLC管柱上具有约6-15分钟的高压液相 色谱（HPLC)滞留时间；
[0041] (iv)任选地是狀；
[0042] (c)对卡那霉素（Kanamycin)、氯霉素（Chloramphenicol)、氨节青霉素 (Ampicillin)、青霉素（Penicillin)、头抱呋辛（Cefuroxime)、口辰拉西林（Piperacillin)、 四环素具有抗性；并且
[0043] (d)具有碱性磷酸酶、酯酶、酸性磷酸酶以及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性。
[0044] 还提供包含所述芽孢杆菌属分离物F727、衍生自所述菌株或其提取物的实质上 纯的培养物、细胞分离物、提取物、上清液以及物质、代谢物或化合物，以及（a)可以是化学 或生物杀虫剂的第二物质中的至少一个和（b)载剂、稀释剂、表面活性剂、佐剂中的至少一 个。所述组合可以是组合物并且可以涂覆到种子上。
[0045] 更提供用于调节植物的害虫侵扰的方法，其包含向植物和/或其种子和/或用于 生长所述植物的基质施加有效调节所述害虫侵扰的量的所述组合。在某些实施例中，害虫 是植物真菌，例如霜霉属、葡萄孢属、核盘菌属、单丝壳属、丝核菌属、炭疽菌属、镰孢菌属、 轮枝孢属、疫霉属或离蠕孢属。在其它实施例中，害虫是细菌，例如欧文菌属、假单胞菌属、 黄单胞菌属、食酸菌属或棍状杆菌属。
[0046] 更提供组合物，任选地与一或多种第二物质组合以调配杀虫组合物的用途，其中 所述组合物选自由以下中的一或多者组成的群组：
[0047] (a)芽孢杆菌属分离物F727的实质上纯的培养物，
[0048] (b)芽孢杆菌属分离物F727的培养物的细胞分离物，
[0049] (c)自芽孢杆菌属分离物F727的培养物获得的上清液，
[0050] (d)自芽孢杆菌属分离物F727的培养物获得的滤液，
[0051] (e) (a)、（b)、（c)或（d)中的任一者的提取物，
[0052] (f)由芽孢杆菌属分离物F727的培养物产生的代谢物，
[0053] (g)化合物 A，
[0054] (h)化合物B，和
[0055] ⑴化合物C ;
[0056] 并且第二物质选自由以下组成的群组：
[0057] (a)杀虫剂，
[0058] (b)植物生长促进剂，
[0059] (C)载剂，
[0060] (d)佐剂，
[0061] (e)表面活性剂，
[0062] (f)肥料，以及
[0063] (g)抗植物病原剂。
【附图说明】
[0064] 图1显示用于自培养物培养液获得本发明化合物的纯化流程的示意性图示。
[0065] 图2描绘化合物"A"的ESI-LCMS色谱图。
[0066] 图3描绘化合物"A"的（+) ESMS。
[0067] 图4描绘化合物"B"的ESI-LCMS色谱图。
[0068] 图5描绘化合物"B"的（+) ESMS。
[0069] 图6描绘化合物"C"的ESI-LCMS色谱图。
[0070] 图7描