医生的判断之内，并且取决于患者的临床病症。细胞或细胞群可以从任何来源，如血库或供 体中获得。当个体需要变化时，针对具体的疾病或病症的给予细胞类型的有效量的最佳范 围的确定在本领域技术范围内。有效量指的是提供治疗学或预防益处的量。给予的剂量将 取决于接受者的年龄、健康和体重，同时治疗的种类，如果有，治疗的频率以及期望的效果 性质。
[0213] 在另一种实施方式中，非肠道地给予细胞或包括这些细胞的组合物的所述有效 量。所述给予可以是静脉给予。在肿瘤内通过注射可以直接进行所述给予。
[0214] 在本发明的某些实施方式中，细胞给予至患者，这与（例如，之前、同时或之后）任 意数量的相关治疗形式结合，包括但不限于，用诸如抗病毒疗法、西多福韦和白介素-2的 试剂治疗，用于MS患者的阿糖胞苷（也称为ARA-C)或那他珠单抗（nataliziimab)治疗， 或用于银肩病患者的依法利珠单抗（efaliztimab)治疗或用于PML患者的其它治疗。在 进一步的实施方式中，本发明的T细胞可以用于与化疗、辐射、免疫抑制剂（如环孢菌素、 硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506)、抗体或其它免疫烧蚀（immunoablative)剂（如 CAM、PATH、抗-⑶3抗体或其他抗体疗法）、细胞毒素、氟达拉滨（fludaribine)、环孢菌素、 FK506、雷帕霉素、麦可酚酸（麦考酚酸，霉酚酸，mycoplienolic acid)、类固醇、FR901228、 细胞因子和照射相结合。这些药物抑制钙依赖性钙神经素磷酸酶（环孢霉素和FK506)， 或者抑制对于生长因子诱导的信号（雷帕霉素）重要的P70S6激酶（Liu et al. ,Cell 66:807-815, 11 ;Henderson et al.，Immun. 73:316-321，1991 ;Bierer et al. ,Citrr. Opin. mm n. 5:763-773,93)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物给予至患者，与 以下结合：（例如，之前、同时或之后）骨髓移植，使用化疗剂如氟达拉滨、外粒子束辐射疗 法（XRT)、环磷酰胺，或抗体如0KT3或CAMPATH的T细胞烧蚀的疗法。在另一种实施方式 中，在B细胞烧蚀治疗（如，与CD20,例如Rituxan反应的试剂）之后，给予本发明的细胞组 合物。例如，在一种实施方式中，受试者在紧接着外周血干细胞移植之后，可以经受用高剂 量的化疗的标准治疗。在某些实施方式中，在移植之后，受试者接受本发明的扩增的免疫细 胞的输注。在另外的实施方式中，在外科手术之前或之后给予扩增的细胞。在本发明具体 的方面中，通过本文描述的任何一种方法获得的所述改变的细胞可以用于治疗需要其的患 者对抗宿主抗移植物（HvG)反应和移植物抗宿主疾病（GvHD);因此，在本发明的范围内是 一种治疗需要其的患者对抗宿主抗移植物（HvG)反应和移植物抗宿主疾病（GvHD)的方法， 包括通过给予所述患者有效量的包括灭活的TCR α和/或TCR β基因的改变的细胞来治疗 所述患者。
[0215] 工稈化用于免痔疗法的人异基闵细朐的方法的实施例
[0216] 为了更好的理解本发明，在图5中示出了工程化用于免疫疗法的人异基因细胞的 方法的一个实例。该方法包括以下步骤中一个或几个的结合：
[0217] 1.提供来自细胞培养物或来自一个个体患者的血液样本或来自血库的T细胞，并 且使用抗-CD3/C28活化剂珠粒活化所述T细胞。珠粒提供T细胞的活化和扩增所需的主 要和协同刺激信号。
[0218] 2. a)用ρΤα或其功能变体转基因转导所述细胞，以支持⑶3表面表达和通过 CD3复合物的刺激允许细胞扩增。期望TCR中断以使TCR复合物消除并且去除同种反应性 (GvHD)，但是由于CD3信号组件的损失可以改变异体细胞扩增。期望转导的细胞表达ρΤ α 链或其功能变体。这种PT α链与TCR β链和CD3信号组件配对以形成前TCR复合物，从而 恢复功能性CD3复合物和支持灭活的TCRa细胞的活化或刺激。具有ρΤ α慢病毒载体的 T细胞的转导可以在TCRa灭活之前或之后实现。
[0219] b)用多链CAR转导所述细胞，使重定向T细胞针对在来自各种恶性肿瘤（包括淋 巴瘤和实体瘤）的靶细胞表面处表达的抗原。为了改善协同刺激结构域的功能，本发明人 已经设计了来源于如先前描述的Fc ε RI的多链CAR。转导可以在TCRa和⑶52基因灭活 之前或之后实现。
[0220] 3.工程化非同种反应性和免疫抑制耐受性T细胞：
[0221] a)可以在所述细胞中灭活TCRa以从细胞表面消除TCR，并且通过异体的TCR防 止宿主组织识别为外来物，从而避免GvHD。
[0222] b)也可以灭活编码用于免疫抑制剂的靶标的一种基因以使得所述细胞耐受免疫 抑制治疗，从而防止移植物排斥而不影响移植的T细胞。在该实施例中，免疫抑制剂的靶标 是CD52并且免疫抑制剂是人化单克隆抗-CD52抗体。
[0223] 本发明人已经显示，通过在T细胞内允许较高比率的DSB事件的TALE-核酸酶的 使用特别有利于在T细胞中实现上面的双灭活。优选地，TCRa和CD52基因通过用编码靶 向所述基因的TALE-核酸酶的mRNA电穿孔T细胞灭活。本发明人已经发现，使用mRNA产 生的高转化率不太损害T细胞，并且因此在工程化T细胞的过程中是关键的。随后，使用磁 珠粒分类灭活的T细胞。例如，表达⑶52的T细胞通过在固体表面上固定而去除，并且使 灭活的细胞不暴露于通过柱的压力下。这种温和的方法增加适当工程化T细胞的浓度。
[0224] 4.在给予至患者之前体外扩增工程化T细胞，或在给予患者之后通过⑶3复合物 的刺激体内扩增。在给予步骤之前，患者经受免疫抑制治疗，如CAMPATH1-H、人化单克隆抗 体抗-CD52。
[0225] 5.可选地，在给予至患者之前，用双特异性抗体离体暴露所述细胞，或者在给予患 者之后在体内将工程化细胞带至靶标抗原附近。
[0226] 其灾宙义
[0227] -在本文中根据一个字母代码指定在多肽序列中的氨基酸残基，其中，例如，Q指 的是Gln或谷氨酰胺残基，R指的是Arg或精氨酸残基，并且D指的是Asp或天冬氨酸残基。
[0228] -氨基酸取代指的是将一个氨基酸残基替换成另一个，例如用在肽序列中用谷氨 酰胺残基替换精氨酸残基是氨基酸取代。
[0229] -按以下指定核苷酸：一个字母代码用于指定核苷的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧 啶，c是胞喃啶，并且g是鸟嗓呤。对于简并的核苷酸，:r代表g或（嗓呤核苷酸），k代表g 或t，s代表g或c，w代表或a或t，m代表a或c，y代表t或c (喃啶核苷酸），d代表g、a 或t，V代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，并且η代表g、a、t或c。
[0230] 如在本文中使用的，"核酸"或"多核苷酸"是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核 糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)、寡核苷酸、聚合酶链反应（PCR)产生的片段和通过任何连 接、剪切、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用产生的片段。核酸分子可以由天然产生的核 苷酸（如DNA和RNA)的单体组成，或天然产生的核苷酸（例如，天然产生的核苷酸的对映 体形式）的类似物，或两者的结合。改变的核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱部分 中具有改变。例如，糖改变包括将一个或多个羟基替换成卤素、烷基基团、胺和叠氮基基团， 或者糖可以被醚或酯官能化。此外，整个糖部分可以用空间和电子类似结构，如氮杂-糖 (aza-sugar)和碳环糖类似物替换。碱基部分改变的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶，酰基化 嘌呤或嘧啶，或其它众所周知的杂环取代。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这种连键的类 似物连接。核酸可以是单链或双链。
[0231] - "多核苷酸连续包括与所述双链断裂的上游序列同源的第一区域，在所述细胞 的基因组中要插入的序列和与所述双链断裂的下游序列同源的第二区域"意指包括与原位 DNA靶标的区域5'和3'同源的第一和第二部分的DNA结构或基体（matrix)。DNA结构也 包括位于第一和第二部分之间的第三部分，其包括与原位相应DNA序列的一些同源性或可 替换地不包括与原位DNA靶标的区域5'和3'的同源性。在DNA靶标断裂之后，在感兴趣的 基因座中包含的包括靶标基因的基因组和这种基体之间刺激同源重组事件，其中，包括DNA 靶标的基因组序列由基体的第三部分和所述基体的第一和第二部分的可变部分取代。
[0232] - "DNA靶标"、"DNA靶标序列"、"靶标DNA序列"、"核酸靶标序列"、"靶标序列"或 "加工部位"指的是可以通过根据本发明的稀切内切核酸酶靶向和加工的多核苷酸序列。这 些术语指的是具体的DNA位置，优选地，在细胞中基因组位置，而且部分遗传物质可以独立 于诸如质粒、附加体（游离体，episome)、病毒、转座子的遗传物质的主体存在，或在如作为 非限制的实例的线粒体的细胞器中。作为TALE-核酸酶靶标的非限制的实例，靶向的基因 组序列通常由被15-bp间隔子（间隔基因，spacer)分开的两个17-bp长序列（称为半靶 标）组成。在EFl-α启动子或T7启动子控制下，通过在质粒中编码的作为非限制的实例 的在表1、5、6和10中列出的TALE-核酸酶的重复子（重复序列，repeat)识别每个半靶标。 正如在表1、5、6和10中指出的，核酸靶标序列由所述靶标的一条链的5'至3'序列限定。
[0233] -嵌合抗原受体（CAR)是指将结合结构域与T细胞受体活化细胞内结构域组合的 分子，该结合结构域针对靶细胞上存在的组件，例如基于抗体对于期望抗原（例如，肿瘤抗 原）的特异性，从而产生显示出特异性抗靶标细胞免疫活性的嵌合蛋白质。一般来说，CAR 由融合至T细胞抗原受体复合物ζ链的细胞外信号结构域的细胞外单链抗体（scFvFc) (scFvFc: ζ)组成，并且当在T细胞中表达时，具有基于单克隆抗体的特异性重定向抗原识 别的能力。在本发明中使用的CAR的一个实例是针对CD 19抗原的CAR，并且可以包括作为 非限制的实例的氨基酸序列：SEQ ID NO:73。
[0234] - "递送载体"或"多种递送载体"是指可以在本发明中使用以达到细胞接触（即 "接触"）或在细胞或亚细胞区室内递送（即"引入"）本发明所需的试剂/化学品和分子 (蛋白质或核酸）的任何递送载体。它包括但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物 递送载体、化学载体、聚合物载体、脂复合物、多聚复合物（polyplex)、树枝状大分子、微泡 (超声造影剂）、纳米颗粒、乳液或其它的适合的转移载体。这些递送载体允许分子、化学 品、大分子（基因、蛋白质）或其它载体（如质粒，由Diatos开发的肽）的递送。在这些情 况中，递送载体是分子载体。"递送载体"或"多种递送载体"也是指进行转染的递送方法。
[0235] -术语"载体"或"多种载体"指的是能够运输已连接至其的另外的核酸的核酸分 子。本发明的"载体"包括，但不限于，病毒载体、质粒、RNA载体、或者线性或环状DNA、或 RNA分子，其可以由染色体、非染色体、半合成或合成的核酸组成。优选的载体是能够自主复 制（附加体载体）和/或表达它们连接至其的核酸（表达载体）的那些。大量适合的载体 是本领域技术人员众所周知的并且可商购的。
[0236] 病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒（例如腺相关病毒）、冠状病毒、诸 如正粘病毒（例如，流感病毒）的负链RNA病毒、弹状病毒（例如，狂犬病和水疱性口膜炎 病毒）、副粘病毒（例如麻瘆和仙台）、正链RNA病毒（如小RNA病毒和甲病毒）、以及双 链DNA病毒（包括腺病毒、疱瘆病毒（例如，单纯疱瘆病毒1型和2型、艾普斯登-巴尔 病毒（Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒）、和痘病毒（例如，牛痘、鸟痘和金丝雀痘））。 其它病毒包括，例如，诺沃克病毒、外衣病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳头多瘤空泡病毒、嗜 肝性DNA病毒（hepadnavirus)和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：鸟造白细胞组织增 生 -肉瘤（avian leukosis-sarcoma)、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢 病毒、泡沫病毒（Coffin, J.M·，Retro viridae:The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds.,Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)〇
[0237] - "慢病毒载体"指的是基于HIV的慢病毒载体，由于它们相对较大的包装能力、降 低的免疫原性和它们高效稳定转导大范围不同细胞类型的能力，因而它们对基因递送来说 是非常有前景的。
[0238] 慢病毒载体通常在三种（包装、包膜和转移）或更多种质粒瞬时转染至生产细胞 之后产生。像HIV-样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面受体的相互作用进入 靶细胞。在进入后，病毒RNA经历逆转录，其由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录的产物 是双链线性病毒DNA，其是受感染的细胞的DNA中用于病毒整合的底物。"整合慢病毒载体 (或LV) "指的是作为非限制的实例的这些载体，其能整合靶细胞的基因组。"非整合慢病毒 载体（或NILV) "相对地指的是有效基因递送载体，这些载体不通过病毒整合酶的作用整合 靶细胞的基因组。
[0239] -递送载体和载体可以与任何细胞渗透技术（如，声孔效应或电穿孔或这些技术 的衍生技术）相关或相结合。
[0240] -细胞或多种细胞是指从用于体外培养的这些生物体获得的任何真核活细胞、初 级细胞和细胞系。
[0241] - "初级细胞"或"多种初级细胞"是指直接取自活组织（即，活体解剖材料）并且 在体外建立用于生长的细胞，其已经历非常少的群体倍增，并且因此更代表它们来源的组 织的主要功能成分和特征，与连续肿瘤发生或人工永生细胞系相比较。
[0242] 作为非限制的实例的细胞系可以选自由CHO-Kl细胞；HEK293细胞；Caco2细胞； U2-0S 细胞；NIH 3T3 细胞；NSO 细胞；SP2 细胞；CHO-S 细胞；DG44 细胞；K-562 细胞，U-937 细胞；]?1^5细胞；頂1?90细胞；】证1?^细胞；!1印62细胞 ；海拉细胞；!11'-1080细胞；!1(：1'-116 细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞组成的组。
[0243] 所有这些细胞系可以通过本发明的方法改变以提供细胞系模型，从而生产、表达、 量化、检测、研宄感兴趣的基因或蛋白质；这些模型也可以用于筛选在研宄和生产以及各个 领域（作为非限制的实例的如化学品、生物燃料、治疗学和农业）的感兴趣的生物学活性分 子。
[0244] - "突变"是指在多核苷酸（cDNA、基因）中或多肽序列中取代、缺失、插入至多达 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50或更多个核苷酸/氨基酸。突变 可以影响基因的编码序列或其调控序列。它也可以影响基因组序列的结构或编码的mRNA 的结构/稳定性。
[0245] - "变体"是指重复序列变体、变体、DNA结合变体、TALE-核酸酶变体、在母本分子 的氨基酸序列中通过至少一个残基的突变或替换获得的多肽变体。
[0246] - "功能变体"是指蛋白质或蛋白质结构域的催化活性突变；这样的突变可以具有 与其母本蛋白质或蛋白质结构域相比相同的活性或附加的性质，或更高或更低的活性。
[0247] - "基因"是指遗传的基本单位，由沿着染色体以线性方式排布的DNA的区段组成， 其编码具体的蛋白质或蛋白质的区段。基因通常包括启动子、5'非翻译区、一个或多个编码 序列（外显子）、可选的内含子、3'非翻译区。基因可以进一步包括终止子、增强子和/或 沉默子。
[0248] -如在本文中使用的，术语"基因座"是在染色体上（例如，基因的）DNA序列的具 体实际位置。术语"基因座"可以指的是在染色体上稀切内切核酸酶靶标序列的具体实际 位置。这样的基因座可以包括以下靶标序列，其通过根据本发明的稀切内切核酸酶识别和 /或断裂。应当理解的是，本发明感兴趣的基因座不仅可以定性存在于细胞的（即，在染色 体中的）遗传物质的主体中的核酸序列，而且部分遗传物质可以独立于遗传物质的所述主 体存在，作为非限制的实例，如质粒、附加体、病毒、转座子或在诸如线粒体的细胞器中。
[0249] -术语"内切核酸酶"是指在DNA或RNA分子内，优选地，DNA分子内，在核酸分子之 间能够催化键水解（断裂）的任何野生型或变体酶。无论其序列，内切核酸酶不断裂DNA或 RNA分子，而是在特定多核苷酸序列处识别和断裂DNA或RNA分子，进一步称为"靶标序列" 或"靶标部位"。当通常具有长度大于12个碱基对（bp)，更优选地，14-55bp的多核苷酸识 别部位时，可以将内切核酸酶分类为稀切内切核酸酶。在限定的基因座处通过诱导DNA双 链断裂（DSB)，稀切内切核酸酶显著增加 HR(Rouet, Smih et al. 1994 ;Choulika, Perrin et al. 1995 ;Pingoud and Silva 2007)。例如，稀切内切核酸酶可以是寻革巴（homing)内切核酸 酶（Paques and Duchateau 2007)，由具有诸如 FokI (Porteus and Carroll 2005)的限制 酶催化结构域的工程化锌指结构域的融合得到的嵌合锌指核酸酶（ZFN)，或化学内切核酸 酶（Eisenschmidt, Lanio et al. 2005 ;Arimondo, Thomas et al. 2006)。在化学内切核酸酶 中，化学或肽断裂物（cleaver)结合至核酸的多聚体或识别特定祀标序列的另一种DNA，从 而革G向特定序列的断裂活性。化学内切核酸酶也包括如邻菲略啉（orthophenanthroline) 的结合物、DNA断裂分子以及三链体形成寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotide， TF0)(已知与特定DNA序列结合（Kalish and Glazer 2005))的合成核酸酶。这样的化学 内切核酸酶包括在根据本发明的术语"内切核酸酶"中。
[0250] 稀切内切核酸酶也可以是例如TALE-核酸酶，一种使用FokI催化结构域和来源于 转录激活子样效应因子（TALE)的DNA结合结构域的新型嵌合核酸酶，其中转录激活子样效 应因子（TALE)是黄单胞菌属的植物病原体在感染过程中使用的蛋白家族（Boch，Scholze et al. 2009 ；Moscou and Bogdanove 2009 ;Christian，Cermak et al. 2010 ；Li, Huang et al.)。基于FokI的TALE-核酸酶（TALE-核酸酶）的功能布局基本上是具有通过TALE结构 域取代的锌指DNA结合结构域的ZFN。这样，通过TALE-核酸酶的DNA断裂需要在非特异性 中心区两侧的两个DNA识别区。在本发明中包括的稀切内切核酸酶也可以来源于TALE-核 酸酶。
[0251] 稀切内切核酸酶可以是寻靶内切核酸酶，也已知称为大范围核酸酶。这样的寻靶 内切核酸酶是本领域众所周知的（Stoddard 2005)。寻靶内切核酸酶识别DNA靶标序列并 且产生单-或双-链断裂。寻靶内切核酸酶是高度特异性的，识别长度范围为12至45碱 基对（bp)，通常长度范围为14至40bp的DNA靶标部位。例如，根据本发明的寻