靶内切核酸 酶可以相当于LAGLIDADG内切核酸酶、HNH内切核酸酶或(ΠΥ-YIG内切核酸酶。根据本发 明优选的寻靶内切核酸酶可以是I-CreI变体。
[0252] - "TALE-核酸酶"（TALEN)指的是融合蛋白，由通常来源于转录激活子样效应因 子（TALE)的核酸-结合结构域和用于断裂核酸靶标序列的一个核酸酶催化结构域组成。 催化结构域优选地是核酸酶结构域，并且更优选地具有内切核酸酶活性的结构域，如例如 I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在【具体实施方式】中，TALE结构域可以融合至入例如I-CreI 和I-OnuI或其功能变体的大范围核酸酶。在更优选的实施方式中，所述核酸酶是单体 TALE-核酸酶。单体TALE-核酸酶是以下TALE-核酸酶，其不要求用于特异性识别和断裂的 二聚化，如在W02012138927中描述的具有I-TevI催化结构域的工程化TAL重复序列的融 合物（fusion)。转录激活子样效应因子（TALE)是来源于包括大量重复序列的菌种黄单胞 菌属的蛋白质，每个重复序列包括在位置12和13处的二残基（RVD)，其对于核酸靶向序列 的每个核苷酸碱基是特异性的。具有类似模块化碱基-每-碱基核酸结合性能（modular base-per-base nucleic acid binding property，MBBBD)的结合结构域也可以来源于新的 模块化蛋白质（modular protein)，这些蛋白质最近被申请人在不同的菌种中发现。新的模 块化蛋白质具有比TAL重复序列显示更多序列可变性的优势。优选地，与不同核苷酸的识 别相关的RVD是识别C的HD，识别T的NG，识别A的NI，识别G或A的NN，识别A、C、G或T 的NS，识别T的HG，识别T的IG，识别G的NK，识别C的HA，识别C的ND，识别C的HI，识别 G的HN，识别G的NA，识别G或A的SN和识别T的YG，识别A的TL，识别A或G的VT和识别 A的SW。在另一种实施方式中，关键氨基酸12和13可以突变为其它氨基酸残基，以调整它 们对核苷酸A、T、C和G的特异性，并且尤其是增强这种特异性。已经描述了 TALE-核酸酶， 并且其用于刺激基因革El向和基因改变（Boch, Scholze et al. 2009 ;Moscou and Bogdanove 2009 ;Christian, Cermak et al. 2010 ;Li, Huang et al·)。工程化TAL-核酸酶是在商品名 TALEN?(Cellectis，8rue de la Croix Jarry，75013Pa;ris，France)下商购的。
[0253] -术语"断裂"是指多核苷酸的共价主链的断裂。可以通过各种方法引发断裂，包 括但不限于，磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链断裂和双链断裂都是可以的，由于两个不 同的单链断裂事件，双链断裂可以发生。双链DNA、RNA或DNA/RNA杂合体断裂可以导致平 端（钝端，blunt end)或者交错末端的产生。
[0254] - "融合蛋白"指的是在本领域中公知的以下过程的结果，其涉及原始编码单独的 蛋白质或它们的部分的两种或多种基因的连接，所述"融合基因"的翻译导致具有来源于每 种原始蛋白质的功能特性的单个多肽。
[0255] - "同一性"是指在两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。，通过比较在可以为 了比较目的而对齐的每个序列中的位置，可以确定同一性。当在被比较的序列中的位置由 相同的碱基占据时，则该分子在该位置处具有同一性。在核酸或氨基酸序列之间的相似性 或同一性的程度是在核酸序列共同的位置处相同或匹配的核苷酸的函数。各种对齐算法和 /或程序可以用于计算两个序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST，其作为GCG序列分析 包的部分是可用的（University of Wisconsin, Madison, Wis.)，并且可以利用，例如，默认 设置使用。例如，考虑到了与在本文中描述的特异性多肽具有至少70%、85%、90%、95%、 98%或99%同一性，并且优选地显示显著相同功能的多肽，以及编码这样的多肽的多核苷 酸。
[0256] - "相似性"描述了在两个或多个多肽的氨基酸序列之间的关系。BLASTP也可以 用于确定与使用类似基体（如BL0SUM45、BL0SUM62或BL0SUM80)的参考氨基酸序列具有 至少 70%、75%、80%、85%、87· 5%、90%、92· 5%、95%、97· 5%、98%、99%的序列相似性 的氨基酸序列。除非另有说明，相似性分数将是基于BL0SUM62的使用。当使用BLASTP时， 百分比相似性是基于BLASTP正分数，并且百分比序列同一性是基于BLASTP同一性分数。 BLASTP "同一性"示出了相同的高得分序列对中总残基的数量和分数；并且BLASTP "正"示 出了对齐分数具有正值并且彼此相似的残基的数量和分数。该公开内容考虑到和包括与本 文公开的氨基酸序列具有同一性或相似性的这些程度或者同一性或相似性的任何中间程 度的氨基酸序列。类似多肽的多核苷酸序列使用遗传密码来推导，并且可以通过常规手段 获得。例如，PT α的功能变体可以与SEQ ID NO: 107的氨基酸序列具有70%、75%、80%、 85%、87. 5%、90%、92. 5%、95%、97. 5%、98%、99%的序列相似性。编码这样的功能变体 的多核苷酸将由使用遗传密码反向翻译其氨基酸序列而产生。
[0257] - "信号转导结构域"或"协同刺激配体"是指在抗原呈递细胞上的分子，其特异性 地结合在T细胞上的同源协同刺激分子，从而提供以下信号，其除了通过例如，将TCR/CD3 复合物与载有肽的MHC分子结合而提供的主要信号外，还介导T细胞响应，包括但不限于， 增殖活化、分化等。协同刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、H)-L1、 PD-L2、4-1BBL、0X40L、可诱导的协同刺激配体（ICOS-L)、细胞间粘附分子（ICAM、CD30L、 CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM)、淋巴毒素 β 受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合 Toll配体受体的激动剂或抗体和特异性结合Β7-Η3的配体。除此之外，协同刺激配体也包 括与在T细胞上呈递的协同刺激分子特异性结合的抗体，如，但不限于，CD27、CD28、4-IBB、 0X40、CD30、CD40、PD-I、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-I (LFA-I)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、 B7-H3、与CD83特异性结合的配体。
[0258] "协同刺激分子"指的是在特异性结合协同刺激配体的T细胞上的同源结合配偶 体，从而介导通过细胞的协同刺激响应，如，但不限于增殖。协同刺激分子包括，但不限于 MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
[0259] 如在本文中使用的"协同刺激信号"是指以下信号，其与主要信号（如TCR/CD3结 合）组合，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
[0260] - "双特异性抗体"是指在单个抗体分子内对两种不同的抗原具有结合部位的抗 体。本领域技术人员将理解的是，除了标准的抗体结构外的其它分子可以由两种结合特异 性构建。将进一步理解的是，通过双特异性抗体结合的抗原可以是同时的或连续的。双特 异性抗体可以通过的化学技术（参见，例如，Kranz et al. (1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78, 5807)、通过"多瘤（polydoma)"技术（参见美国专利号4, 474, 893)或通过重组DNA技 术生产，这些技术本身全部已知。作为非限制的实例，每个结合结构域包括来自抗体重链 ("VH或H区"）的至少一个可变区，其中第一结合结构域的VH区特异性地结合至淋巴细胞 标记物（如CD3)，并且第二结合结构域的VH区特异结合至肿瘤抗原。
[0261] -如在本文中使用的术语"细胞外配体结合结构域"限定为能够结合配体的寡肽 或多肽。优选地，该结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择细胞外配体 结合结构域以识别配体，该配体充当在与具体的疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记 物。因此，可以充当配体的细胞表面标记物的实例，包括与病毒、细菌和寄生虫传染病、自身 免疫性疾病和癌症细胞相关的那些。
[0262] 如在本文中使用的术语"受试者"或"患者"包括动物界的所有成员，包括非人类 灵长类动物和人。
[0263] 本发明上面所写的描述提供了制造和使用它的方式和方法以使任何本领域技术 人员能够制造和使用它，尤其对于随附的权利要求的主题提供了这种能够，其构成原始描 述的一部分。
[0264] 其中，在本文中指出的数值限制或范围包括终点。此外，具体包括在数值限制或范 围内所有的值和子范围，如同明确写出。
[0265] 呈现的以上描述使得本领域技术人员能够制造和使用本发明，并且在具体的应用 和其要求的背景下提供了以上描述。对优选实施方式的各种改变对本领域技术人员来说将 是容易明了的，并且在本文中限定的一般原理在没有离开本发明的精神和范围的情况下， 可以应用于其它实施方式和应用。因此，本发明不限于显示的实施方式，而是根据与本文中 公开的原理和特征一致的最广泛的范围。
[0266] 已一般性地描述了本发明，进一步的理解可以通过参考某些具体实施例获得，除 非另有说明，其在本文中仅仅是为了例证而提供，并且不意图限制。
[0267] 实施例
[0268] 实施例1 :TALE-核酸酶断裂人GR基因
[0269] 设计和生产人GR基因的6个异源二聚体TALE-核酸酶靶向外显子。下表1表明 每种TALE-核酸酶断裂的靶标序列。GR TALE-核酸酶由两个独立的实体（称为半TALE-核 酸酶）组成，每一个包括工程化以结合和断裂GR靶标序列的重复序列，该GR靶标序列由被 15-bp间隔子分开的两个17-bp长序列（称为半靶标）组成。
【主权项】
1. 一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括： (a) 通过灭活至少以下各项改变T细胞： -表达免疫抑制剂的靶标的第一基因，和 -编码T细胞受体（TCR)的组件的第二基因， (b) 可选地在所述免疫抑制剂的存在下，扩增所述细胞。
2. 根据权利要求1所述的制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括以下步骤： (a) 提供T细胞； (b) 在表达免疫抑制剂的靶标的所述T细胞中选择基因； (c) 向所述T细胞中引入能够通过DNA断裂分别选择性地灭活以下各项的稀切内切核 酸酶： -编码所述免疫抑制剂的靶标的所述基因，和 -编码所述T细胞受体（TCR)的一种组件的至少一种基因， (d) 可选地在所述免疫抑制剂的存在下，扩增所述细胞。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫抑制剂的靶标是免疫抑制剂的受 体。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述转化的T细胞在患者的血液中 扩增。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述转化的T细胞在体内扩增。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述转化的T细胞在所述免疫抑制 剂的存在下扩增。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述基因表达其为CD52的免疫抑 制剂的靶标，并且所述免疫抑制剂是靶向CD52抗原的抗体。
8. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述基因表达糖皮质激素受体 (GR)，并且所述免疫抑制剂具体地是皮质类固醇，如地塞米松。
9. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，至少两种灭活的所述基因选自由 CD52 和TCRa、CD52 和TCR0、GR和TCRa、GR和TCR0 组成的组。
10. 根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶在步骤c)中 共转染。
11. 根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶是由mRNA 编码的。
12. 根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶在步骤（c) 中通过RNA电穿孔的方式引入至所述细胞。
13. 根据权利要求12所述的方法，在步骤（c)中包括使所述T细胞与编码稀切内切核 酸酶的RNA接触并施加由以下各项组成的agile脉冲序列： (a) -个电脉冲，具有2250至3000V/cm的电压范围、0?lms的脉冲宽度以及步骤（a) 和（b)的所述电脉冲之间0. 2至10ms的脉冲间隔； (b) -个电脉冲，具有2250至3000V的电压范围、100ms的脉冲宽度以及在步骤（b)的 所述电脉冲和步骤（c)的第一电脉冲之间100ms的脉冲间隔；以及 (c) 4个电脉冲，具有325V的电压、0. 2ms的脉冲宽度以及在4个电脉冲的每一个之间 2ms的脉冲间隔。
14. 根据权利要求2至13中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶是TALE-核 酸酶。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，这些TALE-核酸酶中的至少一种针对选自SEQ IDN0:37、SEQIDN0:57至SEQIDN0:60的TCRa的基因靶标序列中的一种。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中，这些TALE-核酸酶中的至少一种针对选自SEQ IDN0:38和SEQIDN0:39的TCR0的基因靶标序列中的一种。
17. 根据权利要求14所述的方法，其中，这些TALE-核酸酶中的至少一种针对选自SEQ IDN0:1至SEQIDN0:6的GR的基因靶标序列中的一种。
18. 根据权利要求14所述的方法，其中，这些TALE-核酸酶中的至少一种针对选自SEQ IDN0:40、SEQIDN0:61至SEQIDN0:65的CD52的基因靶标序列中的一种。
19. 根据权利要求1至18中任一项所述的方法，包括向所述T细胞中引入嵌合抗原受 体（CAR)。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体序列是SEQID:73。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体是多链嵌合抗原受体。
22. 根据权利要求1至21中任一项所述的方法，包括向所述T细胞中引入pTa多肽或 其功能变体。
23. 根据权利要求1至22中任一项所述的方法，包括向所述T细胞中引入能够通过DNA 断裂选择性地灭活⑶1或CTLA-4基因的TALE-核酸酶。
24. 根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中的所述T细胞来源 于炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。
25. 根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中在步骤a)中的所述T细胞来源于 ⑶4+T淋巴细胞和/或⑶8+T淋巴细胞。
26. -种分离的T细胞或细胞系，由权利要求1至25中任一项所述的方法可获得。
27. -种分离的T细胞，其中，选自由以下各项组成的组中的至少两种基因已灭活： CD52 和TCRa、CD52 和TCR0、GR和TCRa、GR和TCR0。
28. 根据权利要求26或27所述的分离的T细胞，进一步包括编码嵌合抗原受体的外源 多核苷酸序列。
29. 根据权利要求28所述的分离的T细胞，其中，所述嵌合抗原受体是多链嵌合抗原受 体。
30. 根据权利要求26至29中任一项所述的分离的T细胞，进一步包括以下外源核酸， 所述外源核酸包括pTa转基因的至少一个片段以支持CD3表面表达。
31. 根据权利要求26至30中任一项所述的分离的T细胞，其用作药物。
32. 根据权利要求26至30中任一项所述的分离的T细胞，用于治疗癌症或病毒感染。
33. 根据权利要求26至30中任一项所述的分离的T细胞，用于治疗淋巴瘤。
34. -种药物组合物，包含至少一种根据权利要求26至33中任一项所述的分离的T细 胞。
35. -种用于治疗需要其的患者的方法，包括： (a)根据权利要求1至25中任一项所述的方法制备T细胞的群； (b)将所述转化的T细胞给予所述患者。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中，所述患者正在利用在权利要求1至25所述的 方法中使用的所述免疫抑制剂治疗。
37. 根据权利要求35或36所述的方法，其中，所述患者诊断患有癌症、病毒感染、自身 免疫失调或移植物抗宿主疾病（GvHD)。 38?-种TALE-核酸酶，针对选自SEQIDNO: 37 和SEQIDNO: 57 至SEQIDNO:60 的TCRa基因的选定革巴标序列中的一种。
39.-种TALE-核酸酶，针对TCR0基因SEQIDNO: 38和SEQIDNO: 39的选定靶标序 列中的一种。 40?-种TALE-核酸酶，针对选自SEQIDNO:40 和SEQIDNO:61 至SEQIDNO:65 的 ⑶52基因的选定革El标序列中的一种。
41. 一种TALE-核酸酶，针对选自SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6的GR基因的选定靶标 序列中的一种。
42. 根据权利要求28至41所述的TALE-核酸酶，包括选自SEQIDNO:7至SEQID勵：18和5￡〇10勵:41至5￡〇10勵:48的多肽序列中的一种。
43. -种多核苷酸，包括编码根据权利要求38至42中任一项所述的TALE-核酸酶的多 核苷酸序列。
44. 一种分离的T细胞，包括至少一种根据权利要求43所述的多核苷酸。
45. -种分离的T细胞，包括至少两种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少第一TALEN和 第二TALEN，所述第一TALEN针对编码TCR的基因，并且所述第二针对编码免疫抑制剂的靶 标的基因。
46. 根据权利要求45所述的分离的T细胞，其中，所述第二TALEN针对编码⑶52或GR 的基因。
47. 根据权利要求44至46中任一项所述的分离的T细胞，其中，其进一步包括编码嵌 合抗原受体的多核苷酸序列。
48. 根据权利要求44至47中任一项所述的分离的T细胞，其中，其进一步包括以下多 核苷酸，所述多核苷酸包括pTa的至少一个片段以支持CD3表面表达。
【专利摘要】开发用于免疫疗法的工程化T细胞的方法，其是非同种反应性的且对免疫抑制药物具有耐受性。本发明涉及通过灭活编码免疫抑制剂的靶标和T细胞受体的基因、尤其是编码CD52和TCR的基因改变T细胞的方法。该方法涉及使用特异性稀切内切核酸酶、尤其是TALE-核酸酶(TAL效应因子内切核酸酶)和编码这种多肽的多核苷酸，以精确靶向T细胞中关键基因的选择，该T细胞从供体或从初级细胞的培养物可获得。本发明为治疗癌症和病毒感染的标准和可负担过继免疫疗法策略开辟了途径。
【IPC分类】C12N5-0783
【公开号】CN104718284
【申请号】CN201380039464
【发明人】罗曼·加莱托, 阿涅丝·古布勒, 斯蒂芬妮·格罗斯, 塞西尔·曼尼维, 劳伦特·普瓦罗, 安德鲁·沙伦贝格, 朱莉安娜·史密斯
【申请人】塞勒克提斯公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年5月13日
【公告号】CA2874609A1, CA2874611A1, EP2855666A1, EP2855667A1, US20130315884, US20150203817, WO2013176915A1, WO2013176916A1, WO2013176916A8