干细胞的体内迁移诱导方法

干细胞的体内迁移诱导方法【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗损伤的组织的移植组合物及治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法。根据本发明，可将与本发明的趋化因子（如白细胞介素-8或巨噬细胞炎症蛋白质-3α）进行反应的生物降解性支架移植到损伤的位点（如关节软骨或皮肤），来诱导/促进用于组织再生的细胞的归巢，以治疗损伤的组织。因此，本发明的组合物其本身与现有技术相比，不仅能够更加简便且有效地适用于损伤的骨组织、关节软骨或皮肤组织的治疗，而且在利用同种异体细胞的细胞治疗中能够有效地活用稀少性较高的治疗用细胞资源，来利用为有用的治疗辅助剂。【专利说明】干细胞的体内迁移诱导方法【【
技术领域：
】】[0001]本发明涉及一种用于治疗损伤的组织的移植组合物及治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法。【【
背景技术：
】】[0002]干细胞(stemcell)是一种可以将组成生物组织的生物分化为多种细胞的细胞，是可以从胚胎、胎儿及成体的各个组织得到的分化(differentiation)之前的步骤的未分化细胞的总称。干细胞的特征在于，被分化刺激(环境)分化为特定细胞，与停止细胞分裂的被分化的细胞不同，可通过细胞分裂来生产(自我复制，self-renewal)与自身相同的细胞，因此具有增殖(proliferation;膨胀(expansion))的特性,上述干细胞也可以通过其他环境或其他分化刺激来分化为其他细胞，使得分化具有可塑性(plasticity)。[0003]关节软骨为主要由蛋白多糖和第二型胶原组成的缺血性组织，并包含组织体积的大约5%的软骨细胞[I]。关节软骨损伤时，存在软骨细胞几乎不迁移到缺损部位，且损伤的关节软骨不进行自发愈合的缺点[2]。用于治疗损伤的关节软骨的代表性的生物学方法有自体软骨细胞移植法和骨髓穿孔术等。自体软骨细胞移植法是一种培养自体软骨细胞来将该自体软骨细胞移植到缺损部位的方法，呈现较好的结果，但存在需要反复进行手术和供体部受限的缺点。骨髓穿孔术是利用穿孔软骨缺损部的软骨下骨来与骨髓一起引入缺损部位的骨髓来源间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell),来治疗损伤的软骨的方法。该方法虽然比较简单且经济，但存在结果不恒定且引入的间充质干细胞的数量不充分时组织再生不顺畅的缺点[3-7]。[0004]间充质干细胞可以分化为骨、软骨、脂肪细胞，并与软骨细胞相比较快地增殖，因而该间充质干细胞为用于关节软骨再生的重要的细胞源，并且为了克服现有关节软骨疗法的缺点，上述间充质干细胞正受关注。为了通过间充质干细胞来使损伤的关节软骨再生，需要使充分数量的间充质干细胞引入软骨缺损部位，并使聚集的间充质干细胞粘附于关节软骨基质，增殖及分化为软骨细胞，来生成软骨基质。在自然愈合过程中，间充质干细胞向关节软骨损伤部位迁移，会经过分化为软骨细胞的过程。间充质干细胞的软骨分化需要聚集的间充质干细胞的凝集和细胞-细胞及细胞-软骨基质之间的相互作用[8]。[0005]细胞周围微环境在间充质干细胞的软骨分化中起到重要的作用。[0006]间充质干细胞和与细胞相邻的胶原的相互作用促进间充质干细胞的软骨分化[9、10]。[0007]为了治疗包括软骨的多种损伤的组织，向组织损伤部内充分引入骨髓来源间充质干细胞的过程非常重要[11-13]。将在血液或骨髓内循环的间充质干细胞聚集到组织损伤部的现象称为归巢(homing)，间充质干细胞的归巢经过多个步骤由细胞粘附蛋白和趋化因子(chemokine)来实现[14-17]。趋化因子为大约810kDa的较小的细胞因子。目前为止，已知有大约50余种的趋化因子，上述趋化因子起到诱导多种细胞的趋化性的功能[18-20]。趋化因子粘附于G蛋白受体之一的趋化因子受体(chemokinereceptor)来诱导细胞趋化性。目前，据报告，有大约19种的趋化因子受体，在间充质干细胞中也出现利用趋化因子的皮肤等的组织再生[21-23]。[0008]对目前使用的关节损伤的疗法(例如，药物疗法、手术、基因疗法等)无法使关节软骨损伤部位恢复到正常关节软骨。此外，考虑到移植物的物理特性，为了移植自体或同种间骨-软骨组织或者补充再生所需的充分的数量的软骨细胞，正在实施自体软骨细胞移植术，这与其他疗法相比呈现较好的治疗效果，但无法克服如下缺点:因供体部或供体受限制而对实际实施带来困难；患者需要负担较高的治疗费用，并需要接受两次以上的手术；被移植的细胞的功能明显下降。[0009]最近，为了克服这种缺点，正活跃地研究由在生物降解性合成高分子涂敷有细胞的复合体形成的人工代用品，来试图应用于临床上，但该方法也未能克服现有的问题。像这样，为了使损伤的关节软骨组织再生，开发了细胞和生物相容性材料的移植技术等多种治疗方法，但临床上应用细胞和生物相容性材料复合衍生物受限并仍有不足之处。[0010]因此，目前，迫切地需要开发一种利用细胞的同时可最大限度地维持其性质，并克服现有的缺点的治疗方法。[0011]在本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并显示其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容作为参照全部插入于本说明书中，以使本发明所属【
技术领域：
】的水平及本发明的内容变得更加明确。【【
发明内容】】[0012]【技术问题】[0013]本【发明者】正努力开发一种能够有效地将组织再生所需的细胞诱导至损伤部位的方法，以治疗损伤的组织部位。[0014]其结果，本【发明者】发现了如下内容:作为趋化因子的白细胞介素(IL，interleukin)_8及巨卩遼细胞炎症蛋白质(MIP,MacrophageInflammatoryProtein)-3a高效地促进间充质干细胞(优选为骨髓来源间充质干细胞)或角质形成细胞(keratinocyte)引入到损伤的部位，并使包含上述趋化因子的生物降解性支架(biodegradablescaffolds)移植到损伤的部位，来能够既简便又有效地治疗，从而完成本发明。[0015]因此，本发明的目的在于，提供一种用于治疗损伤的组织的移植组合物(implantablecompositions)。[0016]本发明的再一目的在于，提供一种治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内(invivo)迁移的诱导方法。[0017]通过【
发明内容】、权利要求及附图，更加明确本发明的其他目的及优点。[0018]【技术解决方法】[0019]根据本发明的一实施方式，本发明提供一种用于治疗损伤的组织的移植组合物，该用于治疗损伤的组织的移植组合物包含生物降解性支架作为有效成分，其中，上述生物降解性支架包含选自包含白细胞介素_8、巨噬细胞炎症蛋白质-3a、它们的衍生物及它们的组合的组中的一个以上化学趋化因子。[0020]本【发明者】正努力开发一种能够有效地将组织再生所需的细胞诱导至损伤的部位的方法，以治疗损伤的组织部位。[0021]其结果，本【发明者】发现了如下内容:作为趋化因子的白细胞介素-8及巨噬细胞炎症蛋白质-3a高效地促进间充质干细胞(优选为骨髓来源间充质干细胞)或角质形成细胞(keratinocyte)引入到损伤的部位,并使包含上述趋化因子的生物降解性支架移植到损伤的部位，来能够既简便又有效地治疗。[0022]本【发明者】确认了如下内容:对在人骨髓来源间充质干细胞中表达，并在软骨或体外皮肤损伤条件(invitroinjury)下的表达增加的趋化因子受体进行筛选,并将包含其配体的生物降解性支架移植到损伤的骨组织、关节或皮肤组织，来诱导间充质干细胞归巢，从而能够有效地治疗关节或皮肤损伤。[0023]本说明书的术语“趋化性(chemotaxis)”意味着被化学刺激诱导的迁移性细胞的阳性(即，朝向刺激的方向)或阴性(即，远离刺激的方向)迁移，细胞膜被相应的化学趋化因子(chemotacticsubstances;趋化因子)激活,这将相应的细胞表面受体(趋化因子受体)作为媒介。[0024]本说明书的术语“化学趋化因子”意味着从组织扩散而使趋化性激活的细胞外基质分子及分泌的蛋白质，例如，包含转化生长因子(TGF,transforminggrowthfactor)家族、骨形态发生蛋白(BMP,bonemorphogeneticprotein)家族、软骨源性形态发生蛋白(CDMP,cartilage-derivedmorphogeneticproteins)家族、成纤维细胞生长因子(FGF,fibroblastgrowthfactor)家族、结缔组织生长因子(CTGF,connectivetissuegrowthfactors)家族、血小板衍生生长因子(PDGF,platelet-derivedgrowthfactor)家族、血管内皮生长因子(VEGF,vascularendothelialgrowthfactor)家族、细胞外基质分子(例如，骨桥蛋白(osteopontin)、纤连蛋白(fibronectin)、透明质酸(hyaluronicacid)、月干素(heparin)、血小板反应蛋白(thrombospondin)、胶原蛋白(Collagen)、玻连蛋白(vitronectin)等)及趋化因子。[0025]根据本发明的优选实施例，本发明的化学趋化因子包含趋化因子。[0026]趋化因子是在像血液干细胞的造血功能及白细胞的趋化性(chemotaxis)—样的多种过程中起到重要的生理学功能的蛋白质(5_20kDa)。[0027]所有趋化因子的氨基酸序列均类似，并可以被4个半胱氨酸(cysteine)的连续性的排列特征化。趋化因子家族划分为如下4个亚族。(a)CCL；(b)CXCL；(c)CX3CL;以及(d)XCL(Murphy,etal.,Internationalunionofpharmacology,XXII,Nomenclatureofchemokinereceptors,PharmacolRev,52:145-176(2000))。[0028]根据本发明的优选实施例，本发明中可利用的趋化因子包含CCL20(MIP-3ci)、CCL19、CCL21、CCL27、CCL28、CXCL8(IL-8)、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12(SDF-1)、CXCL16、CXCLl3、CXCL5、CXCL6、CCL2(MCP-1)、CCL8、CCLl3、CCL25、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL14、CCL15、CCL16、CCL23、CX3CLUXCLUXCL2、CCL1、CCL17、CCL22、CCL11、CCL24、CCL26、CXCL1、CXCL2、CXCL3及CXCL7，优选地，包含CCL20、CCL19、CCL21、CCL27、CCL28、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCLl1、CXCLl2、CXCL16、CXCLl3、CXCL5、CXCL6、CCL2、CCL8、CCLl3及CCL25,更加优选地,包含CCL20、CXCL8、CCL2及CXCLl2，最优选地，包含CCL20及CXCL8。[0029]上述CCL20及CXCL8的氨基酸序列分别记载于序列表第I位及序列表第2位。[0030]根据本发明的优选实施例，就本发明中所利用的趋化因子的浓度而言，每生物降解性支架(Ig)的趋化因子浓度为10-1000ng/ml，优选地，每生物降解性支架(Ig)的趋化因子浓度为20-800ng/ml，更加优选地，每生物降解性支架(Ig)的趋化因子浓度为35_700ng/ml,最优选地,每生物降解性支架(Ig)的趋化因子浓度为50-500ng/ml。[0031]本说明书的术语“生物降解性支架(biodegradablescaffolds)”意味着由含有上述化学趋化物质的生物降解性聚合物形成的三维结构体，并起到通过移植来诱导损伤组织再生所需的细胞向靶位点(例如，损伤的关节软骨或皮肤组织)迁移的支架的功能。优选地，本发明的生物降解性支架为生物相容性物质，通常形成多孔微细支架来提供用于迁移的细胞的物理支架，提供该支架的目的是为了将治疗或再生用细胞引入移植的位点。[0032]本发明的生物降解性支架具有趋化性，由此促进损伤的组织所需的细胞(优选为干细胞或角质形成细胞)归巢。被引入的细胞在损伤的靶部位发挥再生功效。[0033]根据本发明，本发明的生物降解性支架的移植使被迁移的细胞数明显增加(参照图2b及图4d)，也使迁移距离及迁移速度(图2c)明显增加。并且，上述移植仅使细胞迁移增加，而并没有对细胞分化产生任何影响(图3a及图3b)。这意味着本发明的生物降解性支架仅促进损伤的组织再生所需的细胞的引入。[0034]根据本发明的优选实施例，本发明中可利用的生物降解性支架也能够在生物体内可分解的条件下利用为任何大小、形态或组合物。[0035]根据本发明的优选实施例，本发明中可利用的生物降解性支架选自包含聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA,poly(lactic-co-glycolicacid))、聚乳酸(PLA,polylacticacid)、聚乙醇酸(PGA,polyglycolicacid)、聚_e_己内酯(PCL,poly-e-caprolactone)、聚(氨基酸)(PAA,poly(aminoacid))、聚酐(polyanhydride)、聚原酸酯(polyorthoesters)、它们的衍生物、共聚物及它们的混合物；胶原蛋白凝胶(collagengel)、聚乙烯醇海绵(polyvinylalcoholsponge)、多糖(polysaccharide,如藻酸盐(alginate))、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙烯酸酯(polyacrylate)及聚环氧乙烧-聚丙二醇嵌段(polyethyleneoxide-polypropyleneglycolblock)共聚物的组中,更加优选地，选自包含PLGA、PLA、PGA、PCL、PAA、聚酐、聚原酸酯及它们的衍生物、共聚物及它们的混合物的组中，最优选为PLGA。[0036]根据本发明的优选实施例，利用本发明的组合物来治疗的损伤组织为骨组织、关节组织或皮肤组织。[0037]关节软骨损伤(jointorcartilageinjury)由于软骨细胞几乎不向损伤部位迁移，因而不能自发愈合。作为关节软骨损伤的疗法，有自体软骨细胞移植法及骨髓穿孔术等，但存在如下缺点:(a)反复的手术；(b)供体部的限制性；以及(C)难以充分引入间充质干细胞。[0038]最近，为了克服以往的关节软骨损伤疗法的缺点，间充质干细胞作为软骨损伤治疗源而备受瞩目。[0039]间充质干细胞(MSCs,mesenchymalstemcells)作为可以分化及再生为骨、软骨、肌肉、韧带、腱及脂肪等间充组织(mesenchymaltissues)的非造血基质细胞(nonhematopoieticstromalcells)存在于多个组织。例如，已知少量(例如，每10000个单核细胞中大约有I个)的MSCs存在于骨髓。并且，即使不能永生化，MSCs也可以具有维持生长及多向分化潜能的同时以数十倍被培养而增殖的能力。并且，即使MSC被视为向损伤的组织迁移，也不能准确地理解它们的迁移(trafficking)及组织归巢的过程。例如，已知趋化因子及其受体中的CXCR4对造血干细胞及癌细胞转移比较重要(ZouYR,etal.，FunctionofthechemokinereceptorCXCR4inhaematopoiesisandincerebellardevelopment,Nature,393:595-599(1998))，但在MSC体外迁移及MSC体内归巢中，有关CXCR4表达的必要性未得到评价。并且，根据一些报告，已知运输至损伤的组织的MSCs可以诱导恢复，但是，证明了只有受限的MSCs才分化为复原的组织。这种不一致可以用如下理由来说明。(a)在复原的组织中出现的分离MSCs的技术性困难；(b)愈合步骤中所包括的MSC分化为细胞的程度的鉴定；(c)可通过MSC活性机制来诱导MSC的再生，而不是分化。[0040]如上所述，临床上，有众多对用于适用MSCs的研究，但是MSCs回归(recruit)至损伤部位而生存，使得用于发挥体内治疗功效的有效方法的开发尚处于不充分的状态。[0041]本发明的组合物使MSCs向除了关节组织(jointtissue)之外的普通骨(骨组织)损伤部位进行归巢，以便于组织再生，从而可治疗骨相关疾病。可移植本发明组合物的骨组织包含肋骨、头骨、髂骨、肱骨、椎骨、盆骨、肩骨等体内所有骨骼部位，但并不局限于此。[0042]根据本发明的优选实施例，可移植本发明组合物的关节部位包含髋关节、肩、膝、脚腕、手腕、肘、跗骨、尺骨、椎骨、腕骨、髂骨及颞下颌关节，但并不局限于此。[0043]本发明的损伤的关节软骨部位包含透明软骨(hyalinecartilage;例如,位于关节、鼻子、喉头或胸骨的透明软骨)、弹性软骨(elasticcartilage;例如,位于耳朵的弹性软骨)及纤维软骨(fibrocartilage;例如,椎间盘),但并不局限于此。[0044]可通过本发明的组合物来治疗的骨疾病或关节软骨疾病包括含有骨关节炎及类风湿关节炎的关节炎、骨质疏松症、骨软骨症、骨软骨炎、成骨不全症、骨髓炎、骨赘、软骨发育异常、软骨炎、软骨瘤、软骨肉瘤、椎间盘突出症、短颈畸形、变形性骨炎、囊状纤维性骨炎及因事故、骨折、伤口、关节损伤、自体免疫疾病、糖尿病及癌症而产生的与组织损伤相关的关节软骨疾病，但并不局限于此。[0045]本发明的组合物也可`以有用地利用于损伤的皮肤组织的再生及治疗。根据本发明，在本发明中筛选的作为化学趋化因子的IL-8及MIP-3CI向损伤的皮肤组织大幅引入人角质形成细胞，来可促进皮肤表皮、真皮及皮下组织的再生。[0046]本说明书的术语“角质形成细胞(Keratinocyte)”在本发明所属【
技术领域：
】中也被称为“皮肤细胞”、“角质细胞”或“角蛋白形成细胞”，由于存在于表皮的基底层而也被称为“基底细胞(basalcell)”或“基底角质形成细胞(basalkeratinocyte)”,因而上述“角质形成细胞”包含所有这些细胞。[0047]通过免疫反应、上皮再生(reepithelialization)、肉芽组织形成(granulation)、纤维组织形成(fibropIasia)、伤口组织的收缩(contraction)等多种过程来进行皮肤的再生或伤口治疗，在皮肤再生的一系列的过程中，角质形成细胞的迁移、增殖、分化起到重要的作用。角质形成细胞作为占组成皮肤的最外层的表皮(epidermis)的95%的细胞,主要功能为形成保护膜来防止受到病原菌(细菌、寄生虫、病毒等)、热、紫外线及失水等外部的损害。角质形成细胞生成在基底层，并朝向表面的颗粒层(granularlayer)上升,在这里所生成的角蛋白代替现有的细胞结构及皮肤组织，最终有助于皮肤的再生。因此，诱导角质形成细胞有效地迁移至皮肤组织的损伤部位的本发明的组合物可以应用为有效的皮肤疾病治疗用组合物。[0048]可通过本发明的组合物来治疗的皮肤疾病包含烧伤、冻伤、创伤(wound)、瘢痕疙瘡、组织化学破坏、擦伤(abrasion)、骨坏死、裂伤(laceration)、撕脱伤(avulsion)、贯通伤(penetratedwound)、切伤、挫伤(contusionorbruise)、皮肤溃瘍、皮肤角化症、褥疮、卧疮及痤疮，但并不局限于此。[0049]根据本发明的优选实施例，可移植本发明组合物的皮肤组织包含表皮、真皮及皮下组织，但并不局限于此。[0050]根据本发明的优选实施例，在本发明中被引入的细胞为干细胞或角质形成细胞。上述干细胞包含自体(autologous)干细胞或非自体(non-autologous)干细胞,优选为自体干细胞，更优选为自体间充质干细胞或自体外胚层干细胞，最优选为骨髓来源间充质干细胞或皮肤干细胞(keratinocytestemcell)。[0051]本发明的组合物也可以提供为如下的药剂学组合物，该药剂学组合物包含:(a)上述生物降解性支架的药剂学有效量；以及(b)药剂学上接受的载体。[0052]本说明书的术语“药剂学有效量”意味着达成上述损伤组织的治疗或再生活性所需的充分的量。[0053]在本发明的组合物制备为药剂学组合物的情况下，本发明的药剂学组合物包含药剂学上接受的载体。在制剂时，通常利用本发明的药剂学组合物中包含的药剂学上接受的载体，其包含乳糖(lactose)、葡萄糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯胶(acaciagum)、磷酸|丐(calciumphosphate)、藻酸盐、明胶(gelatin)、娃酸?丐(calciumsilicate)、微晶纤维素(microcrystallinecellulose)、聚乙烯吡咯烧酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖衆(syrup)、甲基纤维素(methylcellulose)、轻苯甲酯(methylhydroxybenzoate)、轻苯丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸续(magnesiumstearate)及矿物油(mineraloil)等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。药剂学上接受的适合的载体及制剂在Remington’sPharmaceuticalSciences(19thed.,1995)中有详细的记载。[0054]本发明的药剂学组合物可直接给药到损伤的部位，例如可通过皮下注入、肌肉注A、经皮给药、关节腔内注射等方式进行给药。[0055]本发明的药剂学组合物的适当的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性等因素而开多种处方。[0056]本发明的药剂学组合物可根据本发明所属【
技术领域：
】的普通技术人员能够容易地实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂，来进行制剂化，从而制备为单位容量形态，或者装入大容量容器内而制备。此时，剂型可以是油性或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、散剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包含分散剂或稳定剂。[0057]根据本发明，本发明的组合物可移植到活的哺乳动物，更加优选地，可移植到损伤的关节部位(例如，关节软骨)或皮肤组织。[0058]根据本发明的优选实施例，上述哺乳动物不受特别的限制，优选地，包括人、小鼠、大鼠、兔、猴、猪、马、牛、羊、羚羊、狗及猫，更优选地，包括人及小鼠。[0059]根据本发明的再一实施方式，本发明提供一种治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，该方法包括如下步骤:[0060]步骤(a)，向包含选自包含白细胞介素-8、巨噬细胞炎症蛋白质_3a、它们的衍生物及它们的组合的组中的一个以上化学趋化因子(chemotacticfactors)的溶液中浸溃生物降解性支架；以及[0061]步骤(b)，使上述生物降解性支架移植到损伤的关节部位。[0062]以上，已对本发明的方法中所利用的化学趋化因子及生物降解性支架进行了说明，因而省略其记载，以避免过多的重复。[0063]根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种损伤的组织的治疗方法，该治疗方法包括如下步骤:[0064]步骤(a)，向包含选自包含白细胞介素-8、巨噬细胞炎症蛋白质_3a、它们的衍生物及它们的组合的组中的一个以上化学趋化因子的溶液中浸溃生物降解性支架；以及[0065]步骤(b)，使上述生物降解性支架移植到损伤的组织部位。[0066]以上，已对本发明的方法中所利用的化学趋化因子及生物降解性支架进行了说明，因而省略其记载，以避免过多的重复。[0067]【有利的效果】[0068]对本发明的特征及优点进行归纳如下:[0069](a)本发明提供一种用于治疗损伤的组织的移植组合物及治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法。[0070](b)根据本发明，可将与本发明的化学趋化因子(例如，IL-8或MIP-3ci)进行反应的生物降解性支架移植到损伤的位点(例如，骨组织、关节软骨或皮肤)，来诱导/促进用于组织再生的细胞的归巢，从而可治疗损伤的组织。[0071](c)因此，本发明的组合物其本身与现有技术相比，不仅能够更加简便且有效地适用于损伤的骨组织、关节软骨或皮肤组织的治疗，而且在利用异体细胞的细胞治疗中能够有效地应用稀少性较高的治疗用细胞资源，从而可用作有用的治疗辅助剂。【【专利附图】【附图说明】】[0072]图1是在被促炎性细胞因子刺激的人骨髓来源间充质干细胞中表示趋化因子受体的发生变化的基因表达的结果。A:RT-PCR;B:反向斑点杂交(reversedot-blot)。对照组、正常间充质干细胞组；IL-4h，4小时被IL-1^-刺激的组；IL-24h，24小时被IL-1P-刺激的组；IL-48h，48小时被IL-1^-刺激的组；TNF-4h，4小时被TNF-a-刺激的组；TNF-24h，24小时被TNF-a-刺激的组；以及TNF_48h，48小时被TNF-a-刺激的组。[0073]图2a、图2b及图2c是表示细胞增殖及迁移中趋化因子的效果的结果。图2a是表示细胞增殖(cellproliferation)的结果，图2b是表示伤口愈合效果的结果，图2c是表示迁移率(migratorycapacity)的结果。[0074]图3a及图3b是表示在细胞分化中的趋化因子的效果的结果。图3a的顶部图面中表示马森三色(Massontrichrome)染色结果，底部图面是勘查软骨标记基因的表达的结果。图3b是表示冯库萨(Vonkossa)染色结果的结果。简称:N.C,阴性对照组；以及P.C.,阳性对照组。[0075]图4a、图4b、图4c及图4d是分别表示骨髓间充质干细胞(bMSCs)及角质形成细胞的体外趋化性的结果。[0076]图5是表示bMSCs的体内趋化性的结果。顶部图面表示动物实验结果(W，周)，底部图面表示含有趋化因子的PLGA支架移植说明图。[0077]图6a及图6b是观察bMSCs的体内趋化性之后表示肉眼观察a及病理学观点b的结果。【【具体实施方式】】[0078]下面，将通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的要点，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属【
技术领域：
】的普通技术人员来说是显而易见的。[0079]【实施例】[0080]【对象及方法】[0081]【细胞培养】[0082]人骨髓来源间充质干细胞在需要做自体髂骨移植术的患者的同意下经过机构审查委员会(IRB，InstitutionalReviewBoard)审核之后，从后黯嵴(posterioriliaccrest)吸引骨髓并离心分离，来使骨髓内细胞沉淀，由此制备颗粒，在除去上清液之后，利用在杜氏改性伊格尔氏培养基-低葡萄糖(DMEM-LG，Dulbecco’sModifiedeagle’sMedium-lowglucose；GIBC0-BRL公司，格兰德艾兰，纽约，美国)培养液中添加有10%(v/v)牛胎儿血清(FBS,fetalbovineserum；GIBC0BRL公司，格兰德艾兰(GrandIsland),纽约(NY)，美国(USA))、100units/ml的青霉素G(GIBCO)及0.lmg/ml链霉素(GIBCO)的基本培养液来清洗之后，分别注`入在T-75cm2细胞培养瓶(泛高(Falcon)，德国(Germany))中，并培养了4天。随后，除去未粘附于培养瓶底面的细胞，就对于粘附于底面的间充质干细胞而言，每隔3天交换培养液，当培养液填充到培养瓶的约90%左右时，实施了继代培养。对于所分离的骨髓间充质干细胞，使细胞增殖至2或3继代培养，所有实验使用了2或3继代的细胞。[0083]【形成体外软骨损伤条件】[0084]通过处理作为炎症细胞因子的白细胞介素-1P(IL-1P)(R&DSystemsInc.，明尼阿波利斯(Minneapolis)，明尼苏达州(MN)，美国(USA))或肿瘤坏死因子-a(TNF-a)(R&DSystemsInc.)来营造体外软骨损伤条件。在不包含牛胎儿血清的杜氏改性伊格尔氏培养基-低葡萄糖培养液中，将间充质干细胞培养12小时之后，以10ng/ml的浓度将IL-1^或TNF-a添加于培养液，来分别将细胞培养4小时、24小时、48小时之后，使用于实验中。[0085]【逆转录聚合酶链式反应(ReverseTranscriptase-PolymeraseChainReaction)][0086]为了对在正常间充质干细胞中表达的趋化因子受体进行筛选，利用提取试剂盒(RNeasykit)(凯杰公司(Qiagen),巴伦西亚(Valencia),加州(CA),美国(USA))来提取间充质干细胞的总核糖核酸(RNA,RibonucleicAcid),并通过逆转录聚合酶链式反应,来分析趋化因子受体的基因表达。分析的趋化因子受体分别为CCR1-10、CXCR1-7、CX3CR、XCR1，共19个(表1)。通过利用3100基因测序仪(300GeneticAnalyser;应用生物系统公司(AppliedBiosystemslnc.),福斯特市(FosterCity),加州(CA),美国(USA))的脱氧核糖核酸(DNA,Deoxyribonucleicacid)碱基序列分析法,确认了扩增的趋化因子受体的DNA没有相互重复的序列。[0087]【表1】[0088]【逆转录聚合酶链式反应中所利用的引物序列】[0089]【权利要求】1.一种用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述用于治疗损伤的组织的移植组合物包含生物降解性支架作为有效成分，上述生物降解性支架包含选自包含白细胞介素-8、巨噬细胞炎症蛋白质-3a、它们的衍生物及它们的组合的组中的一个以上的化学趋化因子。2.根据权利要求1所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述化学趋化因子为白细胞介素-8及巨噬细胞炎症蛋白质-3a。3.根据权利要求1所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述生物降解性支架选自包含聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-e-己内酯、聚(氨基酸)、聚酐、聚原酸酯、胶原蛋白凝胶、水凝胶、聚乙烯醇海绵、明胶、多糖、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物及它们的混合物的组中。4.根据权利要求1所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述损伤的组织为骨组织、关节组织或皮肤组织。5.根据权利要求4所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述关节组织为髋关节、肩、膝、脚腕、手腕、肘、跗骨、尺骨、椎骨、腕骨、髂骨或颞下颌关节。6.根据权利要求5所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述皮肤组织为表皮、真皮或皮下组织。7.根据权利要求1所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述用于治疗损伤的组织的移植组合物用于增大向损伤的组织部位迁移的干细胞或角质形成细胞的细胞迁移率。8.根据权利要求7所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述干细胞为自体干细胞。9.根据权利要求7所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述干细胞为间充质干细胞或外胚层干细胞。10.根据权利要求1所述的用于治疗损伤的组织的移植组合物，其特征在于，上述用于治疗损伤的组织的移植组合物能够适用于哺乳动物。11.一种治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤:步骤(a)，向包含选自包含白细胞介素_8、巨噬细胞炎症蛋白质_3a、它们的衍生物及它们的组合的组中的一个以上的化学趋化因子的溶液中浸溃生物降解性支架；以及步骤(b)，使上述生物降解性支架移植到损伤的组织部位。12.根据权利要求11所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述化学趋化因子为白细胞介素-8及巨噬细胞炎症蛋白质-3a。13.根据权利要求11所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述生物降解性支架选自包含聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-e-己内酯、聚(氨基酸)、聚酐、聚原酸酯、胶原蛋白凝胶、水凝胶、聚乙烯醇海绵、明胶、多糖、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物及它们的混合物组成的组中。14.根据权利要求11所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述损伤的组织为骨组织、关节组织或皮肤组织。15.根据权利要求14所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述关节组织为髋关节、肩、膝、脚腕、手腕、肘、跗骨、尺骨、椎骨、腕骨、髂骨或颞下颌关节。16.根据权利要求14所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述皮肤组织为表皮、真皮或皮下组织。17.根据权利要求11所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述治疗用细胞为干细胞或角质形成细胞。18.根据权利要求17所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述干细胞为自体干细胞。19.根据权利要求17所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述干细胞为间充质干细胞或外胚层干细胞。20.根据权利要求11所述的治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法，其特征在于，上述治疗用细胞向损伤的组织部位进行体内迁移的诱导方法能够适用于哺乳动物。21.一种损伤的组织的治疗方法，其特征在于，包括如下步骤:步骤(a)，向包含选自包含白细胞介素_8、巨噬细胞炎症蛋白质-3a、它们的衍生物及它们的组合的组中的一个以上化学趋化因子的溶液中浸溃生物降解性支架；以及步骤(b)，使上述生物降解性支架移植到损伤的组织部位。22.根据权利要求21所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，上述化学趋化因子为白细胞介素-8及巨噬细胞炎症蛋白质-3a。23.根据权利要求21所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，上述生物降解性支架选自包含聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-e-己内酯、聚(氨基酸)、聚酐、聚原酸酯、胶原蛋白凝胶、水凝胶、聚乙烯醇海绵、明胶、多糖、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物及它们的混合物的组中。24.根据权利要求21所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，上述损伤的组织为骨组织、关节组织或皮肤组织。25.根据权利要求24所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，上述关节组织为髋关节、肩、膝、脚腕、手腕、肘、跗骨、尺骨、椎骨、腕骨、髂骨或颞下颌关节。26.根据权利要求24所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，上述皮肤组织为表皮、真皮或皮下组织。27.根据权利要求21所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，治疗用细胞为干细胞或角质形成细胞。28.根据权利要求27所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，上述干细胞为自体干细胞。29.根据权利要求27所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，上述干细胞为间充质干细胞或外胚层干细胞。30.根据权利要求21所述的损伤的组织的治疗方法，其特征在于，上述损伤的组织的治疗方法能够适用于哺乳动物。【文档编号】A61L27/54GK103561788SQ201280011945【公开日】2014年2月5日申请日期:2012年1月26日优先权日:2011年3月8日【发明者】李溱祐,朴敏成,金伦希申请人:泰高科学株式会社