单克隆抗体命名为8D2)。
[0088]杂交瘤细胞株LTOOl(CTLA4-8D2)，其于2014年6月18日保藏于中国典型培养物 保藏中必（CCTCC)，保藏编号为CCTCCN0:C2014113,保藏地址为中国.武汉.武汉大学，由E 编：430072。
[008引 7.抗体8D2的制备
[0090]用含10%的低IgG胎牛血清对本发明CTLA4-8D2 (LTOOl)细胞株进行培养，7天后 收集细胞培养上清进行纯化制备抗体8D2。
[00川 8.抗体8D2的SDS-PAGE电泳检测：
[0092] 将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样 缓冲液，煮沸后进行检测。检测结果显示，还原型蛋白样品目标蛋白大约在50kD和25kD处， 非还原型蛋白样品目标蛋白大约在150kD处（图2)。
[0093] 连施例2 :单克降杭体8D2的耗链巧軍链序列的巧得
[0094] 按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒灯iangen，货号DP430)的方法，从实施例1 制得的CTLA4-8D2杂交瘤细胞株化TOOl细胞）中提取mRNA。
[0095]按照InvitrogenSuperscript饭IIIFirst-StrandSynthesisSystemfor RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操 作参照祀ASY-TlCloningKit灯ransgenCT101)试剂盒说明书进行。将TA克隆的产物直 接进行测序，测序结果如下：
[009引重链可变区的DNA测序结果；（34化P)
[009引其编码的蛋白序列；（115aa)
[0100] 轻链可变区的DNA测序结果；（318bp)
[0102] 其编码的蛋白序列；（l〇6aa)
4]连施例3:人源化杭体8D2H1LK8D2肥L2巧8D2册L3的耗链巧軍链序列的巧计[010引根据CTLA4蛋白的H维晶体结构（化t.Struct.Biol. (1997) 4p. 527)W及实施例2 获得的抗体8D2的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体8D2H1L1、 8D2肥L2和8D2册L3的可变区序列（抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库），可变区序列如 下：
[0106] 1.单克隆抗体8D2H1L1的轻链和重链序列
[0107] 重链可变区的DNA序列；（34化P)
[0109] 其编码的蛋白序列；（115aa)
[011U 轻链可变区的DNA序列；（32化P)
[0113] 其编码的蛋白序列；（107aa)
[0115] 2. 8D2人源化单克隆抗体8D2肥L2的轻链和重链序列
[0116] 重链可变区的DNA序列；（34化P)
[011引其编码的蛋白序列；（115aa)
[0120] 轻链可变区的DNA序列；（324bp)
[0122] 其编码的蛋白序列；（IOSaa)
[0124] 3. 8D2人源化单克隆抗体8D2册L3的轻链和重链序列
[01巧]重链可变区的DNA序列；（34化P)
[0127]其编码的蛋白序列；（115aa)
[0129] 轻链可变区的DNA序列；（32化P)
[0131]其编码的蛋白序列；（l〇7aa)
阳13引连施例4 :8D2軍纽杭体8D2 (Re)W及8D2人源化杭体8D2H1LK8D2肥L2巧 8D2册L3的制各巧SDS-PAGE由泳檢郷I
[0134] 1. 8D2重组抗体即8D2 (Re)的制备和SDS-PAGE电泳检测
[0135] 将8D2的重链cDNA序列（其可变区序列如SEQIDNO;5所示）和轻链的cDNA序 列（其可变区序列如SEQIDNO;7所示）分别克隆到PU巧7simple(金斯瑞公司提供）载 体中，分别获得pUC57Simp1e-8D2H和pUC57Simp1e-8D化质粒。
[0136]分别将质粒pUC57simple-8D2H和pUC57simple-8D2L进行酶切化indlll&EcoRI)， 电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到PCDNA3. 1载体中，提取重组质粒共转染293F细胞。 细胞培养7天后，将培养液通过高速离必、微孔滤膜抽真空过滤W及化化approteinAHP 柱进行纯化，并将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳 上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测。如图3所示，还原型蛋白样品目标蛋白大约 在50kD和25邸处，非还原型蛋白样品目标蛋白大约在150kD处。
[0137] 2. 8D2人源化抗体8D2H1LU8D2肥L2和8D2册L3的制备和SDS-PAGE电泳检测
[0138] 将8D2H1LU8D2肥L2和8D2册L3的重链cDNA(其可变区序列分别如沈QIDNO;9、 沈QIDN0;13、沈QIDN0;17所示）和轻链的cDNA(其可变区序列分别如沈QIDN0;11、 569 10^;15、569 10^;19所示）分别克隆到91105731111916(金斯瑞公司提供）载体中， 获得pUC57simple-8D2HlLl、pUC57simple-8D2肥L2 和pUC57simple-8D2册L3 质粒，并分别 亚克隆到PCDNA3. 1载体中，方法同前述8D2 (Re)。
[0139] 将重组质粒转染293F细胞，将培养液纯化后进行检测（同上所述8D2 (Re)的方 法），结果分别如图4、图5和图6所示，还原型蛋白样品目标蛋白大约在50kD和25KD处， 非还原型蛋白样品目柄蛋白大约在150kD处。 。140] 连施例5 :杭体的动力学参敬郷I定
[0141] 使用化Kebio分子相互作用仪测定抗体8D2及人源化8D2H1LU8D2肥L2、8D2册L3 与抗原CTLA4(NCBIGeneID: 1493,编码核酸序列为SEQIDNO;21，所编码的氨基酸序列为 SEQIDNO;22)结合的动力学参数。
[0142] 1.用TEV蛋白酶酶切CTLA4-mFc蛋白（CTLA4-mFc合成方法同实施例1中所述 CTLA4ECD-mFc的合成），并过柱纯化获得CTLA4抗原。
[0143] 基因CTLA4的序列：化36bp)
[0145] 编码对应的氨基酸序列：（212aa)
[0147] 2.分别将抗体8D2及其人源化抗体8D2H1LU8D2肥L2、8D2册L3采用氨基偶联的方 式固定于AR2G传感器表面，经己醇胺封闭，于PBST中平衡后，与抗原CTLA4结合，CTLA4用 PBST两倍稀释，浓度为 300、150、75、37. 5、18. 75、9. 38、4. 69、0nM，于PBST中解离。人源化 8D2H1L1、肥L2、册L3的检测方法与8D2相同，抗原浓度为180、90、45、22. 5、11. 25、5. 625、 2.813、0nM。
[0148] 抗体8D2及其人源化抗体8D2H1L1、8D2肥L2、8D2册L3动力学参数见表1，动力学特 征参数检测结果分别如图7-10所示。
[0149]表I;抗体 8D2、8D2H1L1、8D2肥L2、8D2册L3 动力学参数
[0151]KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD= kdis/kon。
[0152] 结果表明，四种抗体均与抗原有较好的亲和力，其中抗体8D2、8D2H1L1与抗原的 亲和力强于8D2肥L2、8D2册L3。 阳1閲 连施例6 :流式细胸化方法檢测杭体与杂帘概细胸株表面杭原CTLA4的结合活巧
[0154] 首先构建表达CTLA4抗原的宿主细胞293F;然后用本发明中制备的单克隆抗体 8D2 (见实施例1)W及制备的8D2 (Re)及8D2人源化抗体8D2H1LU8D2肥L2和8D2册L3 (见 实施例4)对改宿主细胞进行标记。然后采用流式细胞术分析验证抗体8D2,8D2 (Re)及8D2 人源化抗体8D2H1LU8D2肥L2和8D2册L3对细胞表面具有天然构象的抗原具有特异性的结 A 口O
[0155] 具体步骤如下：
[0156] 1.表达CTLA4抗原的宿主细胞293F的构建
[0157] 按照Iipofectamin转染试剂盒（购自Invitrogen公司）方法将包含CTLA4的载 体pLenti6. 3-CTLA4 (载体pLenti6. 3购自Invitrogen公司）转染293F细胞，经筛选获得 稳定表达CTLA4的克隆群体。
[0158] 2.抗体标记和流式细胞仪检测
[0159] 采用常规膜酶消化方法上述步骤获得的表达CTLA4抗原的宿主细胞293F，并使每 个收集管细胞数为2X105，用PBSa%BSA)配制浓度分别为20nM，10nM，5nM，lnM，0.1nM， 0.OlnM,OnM的8D2抗体稀释液，冰上与表达CTLA4的293F细胞赔育2小时，每管加入100UL FITC-Goat-Anti-MouseIgGQ;500)冰上赔育1小时并加入300ULPBS后，在流式细胞仪 上用FITC通道检测英光信号。其它抗体的检测参照8D2抗体。
[0160] 3.实验结果
[0161]LTOOl的CTLA4表达验证结果如图1