专利名称：：一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法
技术领域：
：本发明涉及一种菌株筛选方法，尤其是涉及一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法。二
背景技术：
：弹性蛋白酶(Elastase)是一种以水解不溶性弹性蛋白为特征的广谱性蛋白水解酶。自从1949年被Balo和Banga发现以来，各国科学家对其的研究便表现得十分活跃，从最初的酶源和纯化研究到现今的分子遗传机理的探索，研究水平越来越深入，很大程度上拓宽了其应用领域。目前，弹性蛋白酶在医药、食品、农业、轻工业、服装加工、环保和生物技术等领域被广泛运用，并具有极大的开发潜力和商业价值。弹性蛋白酶主要用作治疗高血脂症，是防治动脉粥样硬化的有效生化药物，具有改善血清脂质水平，阻止主动脉冠状动脉斑块的形成功效；利用弹性蛋白酶降解一些难以处理的结缔组织如韧带、大动脉血管、筋腿等食物蛋白资源，因而被应用食品加工技术进行深加工可制作高蛋白工程食品和功能肤保健食品。在对食用蛋白质的水解能力方面，弹性蛋白酶比木瓜蛋白酶强一倍以上，用作嫩肉剂，弹性蛋白酶将比木瓜蛋白酶具有更大的优越性和可接受性，其应用前景十分广阔。弹性蛋白酶也是良好的日用化工原料，主要用于保健性化妆品的生产之中。弹性蛋白酶添加入化妆品中，能增进4皮肤的血液循环，增强皮肤、毛发的弹性和柔韧性，可延缓皮肤老化；此外，还能促进头发生长和防止脱发等，是一种新型的美容化妆品基料或加工原料，具有良好的美容保健作用。因此，利用微生物发酵法大规模生产弹性蛋白酶有着具有广阔的应用发展前景。在我国，弹性蛋白酶的生产还主要是从猪胰脏中提取，受到脏器资源不足、提取工艺复杂等因素的限制，利用微生物发酵技术进行大规模的生产基本上还是空白，而国外却已经进行微生物发酵生产并取得了巨大的经济效益。而采用微生物发酵生产碱性蛋白酶周期短、营养需求低、提取工艺简单，可实现自动化生产，不受原料限制而进行大规模生产，对国家的可持续发展策略具有深远的意义。另外，微生物生产弹性蛋白酶技术的开发还存在产物活性不高、性质差异大、基因工程菌不稳定等问题的制约，而筛选出弹性蛋白酶的高产菌株是解决诸多问题的关键所在，从自然中直接去筛选高产菌株，是一条最为直接和行之有效的方法。得到蛋白酶高产菌株，对于提高微生物资源的开发和利用，节约动、植物资源，促进酶制剂产业发展意义重大。
发明内容本发明为了解决上述
背景技术：
中的不足之处，提供一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其采用酪蛋白初筛和弹性蛋白复筛，选择性强，效率高，所得菌株具备作为工业菌株的能力。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法其特征在于具体筛选过程为:(1)采样样品采自杨凌高新区农场的秸秆；(2)纯化样品处理后采用涂布稀释法获得单菌落；(3)初筛选用以酪蛋白(脱脂奶粉)为底物的培养基进行初筛；(4)复筛选用以弹性蛋白(牛筋)为底物的培养基进行复筛。上述取样方法为雨后7-8天，采取麦秆及稻杆，装入灭菌的纸袋。上述初筛培养基以脱脂奶粉为底物，具体配方(％，w/v)为脱脂奶粉2.5,酵母膏0.1，葡萄糖0.1，MgS0,7H2O0.01，KH2P040.05，K2HP040.1，琼脂2.0，pH7.0上述复筛培养基以牛筋为底物，具体配方(％，w/v)为牛筋5.0，酵母膏O.1，葡萄糖O.1，MgS04.7H2O0.01，KH2P040.05，K2HP040.1，pH7.0上述牛筋的制备方法为称取新鲜牛筋，8(TC烘干或者自然晾干，用万能粉碎机将其粉碎至颗粒状。上述菌株的培养基a:斜面培养基(％，w/v):蛋白胨l.O，酵母浸膏0.5,NaCl1.0，琼脂2.0，pH7.0b:种子培养基(％，w/v):葡萄糖1.0蛋白胨0.5，酵母膏0.5，KH2P040.2，MgS040.01，上述培养基均于0.105Mpa蒸汽压力下灭菌30min。上述菌株的筛选过程为(1)样品处理取样品少许剪碎，放入250mL三角瓶中铺满底部，加蒸馏水浸过样品，装量不超过三角瓶容量的1/2，加少量石灰，塞好棉塞，煮沸10min，自然冷却后放置到恒温培养箱中38。C培养48h。(2)纯化将处理后的样品培养液在平板培养基上涂布稀释进行分离纯化，38°C培养24h。挑单菌落进行染镜检后接种于固体斜面，置于38'C恒温箱中培养18-24h后于4'C冰箱中保存。(3)初筛将纯化得到的单菌落点接于初筛平板培养基上，于恒温培养箱中38T:培养32h，测量并计算水解圈与菌落直径比值(HC值)。将初筛所得的HC值大于1.5的菌株进行摇瓶复筛。(4)复筛将初筛得斜面菌种移接于种子液体培养基，38'C培养18-24h后按5%的接种量接种于80ml牛筋复筛培养基，在旋转式摇床上3『C下170r/min培养48h后观察比较。将对牛筋分解效果最佳的菌株接种于斜面培养基于冰箱中4'C保存。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下1、对产蛋白酶菌株选择性强；2、筛选过程采用混合筛选，效率高；3、方法科学、时间周期短。四图l为菌株筛选流程框图。五具体实施方式-弹性蛋白酶(Elastase)是一种以水解不溶性弹性硬蛋白(elastin)为特征的蛋白水解酶，它可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得，其产生菌种类较多，且菌株产物活性产别很大。本发明的具体内容有采取农场秸秆为样品，分离纯化后，分别采用以酪蛋白和弹性蛋白为底物的选择性培养基进行筛选，最后得到一株弹性蛋白酶高产菌株LSF-An-63。实施例l:(参见图l)1、培养基制备斜面培养基(％，w/v):蛋白胨1.0，酵母浸膏0.5，NaCl1.0，琼脂2.0,pH7.0初筛培养基(％,w/v):脱脂奶粉2.5,酵母膏0.1，葡萄糖0.1，MgS(V7H200.01,KH2P040.05,K風O.1，琼脂2.0，pH7.0脱脂奶粉为市售，加入琼脂前应先用适当体积的蒸馏水进行溶解。复筛培养基a,w/v):牛筋5.0，酵母膏0.2，葡萄糖l.O，MgS04-7H200.01，KH2P040.05，K2HP040.1牛筋应以研磨好的颗粒状为宜，先单独分装于三角瓶。种子培养基(％，w/v):葡萄糖l.O，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，KH2P040.2，MgS040.01，以上培养基均于121。C下灭菌20min。2、采样雨后7-8天，采取农场麦秆，装入灭菌的纸袋。3、样品处理取样品少许剪碎，放入250rnL三角瓶中铺满底部，加蒸馏水浸过样品，装量不超过三角瓶容量的1/2，加入2-3g石灰，塞好棉塞，煮沸10min，自然冷却后放置到37。C培养48h。4、纯化将处理后的样品培养液在平板培养基上涂布稀释进行分离纯化，38°C培养24h。挑单菌落进行染镜检后接种于固体斜面，分别编号为LSF-An-1，LSF-An-2，LSF-An-3，……LSF-An-114，置于38。C恒温箱中培养18-24h后于4。C冰箱中保存。5、初筛将纯化得到的单菌落点接于初筛平板培养基上，于38。C培养32h，测量并计算水解圈与菌落直径比值(HC值)。将初筛所得的HC值大于1.5的菌株进行摇瓶复筛。表l产弹性蛋白酶初筛结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6、复筛:将初筛得斜面菌种移接于种子液体培养基进行扩大培养，38'C培养24h后按5%的接种量接种于80ml牛筋复筛培养基，在旋转式摇床上38'C下170r/min培养48h后观察比较。将对牛筋分解效果最佳的菌株测酶活，取具有作为工业菌株潜力的菌株LSF-An-63接种于斜面培养基于冰箱中4"C保存。表2产弹性蛋白酶复筛结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*牛筋部分水解，发酵液液体澄清**牛筋大部分分解，发酵液液浑浊***牛筋全部被水解，瓶底出现白色粘状物，发酵液呈乳黄色****牛筋全部被水解，瓶底无任何杂质，发酵液呈褐色透明权利要求1、一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其特征在于筛选过程为(1)采样样品采自秸秆；(2)纯化样品处理后采用涂布稀释法获得单菌落；(3)初筛选用以酪蛋白为底物的培养基进行初筛；(4)复筛选用以弹性蛋白为底物的培养基进行复筛。2、根据权利要求1所述的一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其特征在于取样方法为雨后7-8天，采用麦秆及稻杆，装入灭菌的纸袋。3、根据权利要求1或2所述的一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其特征在于初筛培养基以脱脂奶粉为底物，由以下组分组成96w/v:脱脂奶粉2.5，酵母膏0.1，葡萄糖O.1，MgS04.7H2O0.01，KH2P040.05,K異0.1,琼脂2.0,pH7.0。4、根据权利要求3所述的一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其特征在于复筛培养基以牛筋为底物，由以下组分组成％w/v:牛筋5.0,酵母膏0.1，葡萄糖O.1，MgS0/7H2O0.01，KH2P040.05，K2HPO40.1，pH7.0。5、根据权利要求4所述的一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其特征在于牛筋的制备方法为称取新鲜牛筋，80'C烘干或者自然晾干，用万能粉碎机将其粉碎至颗粒状。6、根据权利要求5所述的一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其特征在于菌株的培养基a:斜面培养基％,w/v:蛋白胨1.0，酵母浸膏0.5，NaCl1.0,琼脂2.0，pH7.0;b:种子培养基％，w/v:葡萄糖l.O蛋白胨0.5，酵母膏0.5,KH2P040.2,MgS040.01;上述培荞基均于0.105Mpa蒸汽压力下灭菌30min。7、根据权利要求5所述的一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其特征在于菌株的筛选过程为(1)样品处理取样品少许剪碎，放入250mL三角瓶中铺满底部，加蒸馏水浸过样品，装量不超过三角瓶容量的1/2，加少量石灰，塞好棉塞，煮沸10min，自然冷却后放置到恒温培养箱中38。C培养48h。(2)纯化将处理后的样品培养液在平板培养基上涂布稀释进行分离纯化，38'C培养24h，挑单菌落进行染镜检后接种于固体斜面，置于38。C恒温箱中培养18-24h后于4"冰箱中保存；(3)初筛将纯化得到的单菌落点接于初筛平板培养基上，于恒温培养箱中38'C培养32h，测量并计算水解圈与菌落直径比值，将初筛所得的比值大于1.5的菌株进行摇瓶复筛；(4)复筛将初筛得斜面菌种移接于种子液体培养基，3S。C培养18-24h后按5%的接种量接种于80ml牛筋复筛培养基，在旋转式摇床上38。C下170r/min培养48h后观察比较，将对牛筋分解效果最佳的菌株接种于斜面培养基于冰箱中4'C保存。全文摘要本发明涉及一种蛋白酶高产菌株LSF-An-63的筛选方法，其采用酪蛋白初筛和弹性蛋白复筛，选择性强，效率高，所得菌株具备作为工业菌株的能力。本发明具体筛选过程为(1)采样样品采自农场的秸秆；(2)纯化样品处理后采用涂布稀释法获得单菌落；(3)初筛选用以酪蛋白(脱脂奶粉)为底物的培养基进行初筛；(4)复筛选用以弹性蛋白(牛筋)为底物的培养基进行复筛。文档编号C12N1/02GK101508958SQ20091002161公开日2009年8月19日申请日期2009年3月19日优先权日2009年3月19日公开号200910021612.8发明者刘双发,安德荣申请人:西北农林科技大学