用于生物样品中的具有提高的性能的timp2测定的制作方法
【专利说明】用于生物样品中的具有提高的性能的ΤIMP2测定
[0001] 本申请要求2013年8月7日提交的美国临时专利申请61/863,073的优先权，所述申 请整体并入本文，包括所有表格、附图和权利要求。
[0002] 发明背景
[0003] W下发明背景论述仅提供来帮助读者理解本发明，并且并非承认描述或构成本发 明的现有技术。
[0004] 金属蛋白酶抑制剂2(Swiss-Prot P16035，又称为"金属蛋白酶组织抑制剂2"和 "TIMP2")是与金属蛋白酶复合并且通过结合至其催化锋辅助因子而使其不可逆地失活的 分泌蛋白。T IMP 2 已知会对 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-13、MMP-14、匪P-15、匪P-16W及MMP-19起作用。TIMP2据报道会压制内皮细胞的增殖。因此，已表明 编码蛋白会通过W下方式对组织动态平衡的维持产生一定的作用：响应于血管生成因子而 压制静态组织的增殖，并且抑制经受重建的组织的蛋白酶活性。
[0005] 此外，W02010/048346和W02011/075744(各自W引用的方式整体并入本文，包括所 有表格、附图和权利要求)描述了将TIMP2单独地且W多标志物组方式用于评价受试者的肾 状况。具体而言，通过免疫测定测量的TIMP2水平显示与肾状况的风险分级、诊断、分期、预 后、分类W及监控相关。
[0006] 从特异性结合测定诸如免疫测定获得的信号是一种或多种结合物质（例如，抗体） 与祀生物分子（即，分析物)和含有抗体所结合的必要表位的多肤之间形成复合物的直接结 果。免疫测定往往能够"检测"分析物;但由于抗体表位大约是8个氨基酸，所W被配置来检 测相关标志物的免疫测定还将检测与标志物序列相关的多肤，只要那些多肤含有结合至测 定中所使用的一个或多个抗体所需的表位即可。虽然运类测定可W检测全长生物标志物并 且将测定结果表述为相关生物标志物的浓度，但是来自测定的信号实际上是源于样品中存 在的所有运类"免疫反应性"多肤。运类结合测定还可W检测生物样品中存在的与另外的物 质诸如结合蛋白质、受体、肝素、脂质、糖等复合的免疫反应性多肤，前提是那些另外的物质 不干扰结合物质与祀生物分子之间的结合。然而，通常，特异性结合测定是使用纯化分析物 来配制，而不考虑复杂的形成和断裂模式。运在运类另外的结合物质的身份未知的情况下 尤其如此。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供尤其是在用于评价肾损伤时具有提高的临床性能的TIMP2免 疫测定。确切地说，我们描述了当用于复杂的临床样本诸如生物流体时，且尤其是用于快速 测定模式时展现出提高的测定性能的抗体和抗体对的选择和使用。
[000引在第一方面，本发明设及一种或多种特异地结合人TIMP-2的分离的单克隆抗体， 其中每一种分离的单克隆抗体W至少i08m-i的亲和力结合至多肤，所述多肤的序列由选自 由W下组成的组的序列组成：
[0009] QAFCNADWIRAKAVS邸EVD(SEQ ID N0:1)、
[0010] lYGNPIKRIQYEIKQI(沈Q ID N0:2)、
[0011] YEIKQIKMFKGP邸DIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDG(SEQ ID N0:3)、
[0012] YEIKQIKMFKGP邸DIEFIYTAPSSAV(SEQ ID NO:4)、
[0013] EFIYTAPSSAVCGVS(SEQ ID N0:5)、
[0014] TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQ ID N0:6)、
[0015] SLDVGGKKEYLIAGKAEGDGK(SEQ ID N0:7)、
[0016] SSPDE化WMDWVT邸NING册（SEQ ID N0:8)W及
[0017] CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQ ID N0:9)〇
[0018] 用于要求保护的方法的抗体可W获自多种物种。例如，本发明的抗体可W包含免 疫球蛋白序列，所述免疫球蛋白序列是兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼 或骆驼科动物序列、或运类序列的组合(所谓的嵌合抗体）。运类抗体也可W是单克隆的或 多克隆的。用于本发明的抗体可W通过其在免疫测定中的性能来鉴别，并且之后进一步通 过表位定位来表征W便理解与所述性能有关的表位。
[0019] 表位通常由分子的化学活性表面基团（诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有 特定Ξ维结构特征，W及特定电荷特征。构型性W及非构型性表位差别在于:在变性溶剂存 在下，对构型性表位的结合丧失，而不是非构型性表位。优选地，表位选自SEQ ID N0:l-9当 中，所述表位各自是获自人TIMP2序列的序列。用于本发明的优选的抗体特异地结合至运些 肤中的一个或多个。
[0020] 运类单克隆抗体可W缀合至信号发生成分（signal development element)或固 定在固体支持物上。此外，运类抗体可W用于许多竞争测定和夹屯、测定模式。
[0021] 通过举例，在竞争模式中，运些优选抗体中的一种或多种可W缀合至信号发生成 分W提供可检测标记抗体。生物样品中的TIMP2可W与固定在测试装置的预定区处的TIMP2 竞争结合至所述抗体，并且预定区处获得的信号的量将与样品中的TIMP2的量成反比。可替 代地，TIMP2可W缀合至信号发生成分W提供可检测标记分析物。生物样品中的TIMP2可W 竞争结合至固定在测试装置的预定区处的抗体，并且预定区处获得的信号的量将再次与样 品中的TIMP2的量成反比。
[0022] 在夹屯、测定的实例中，第一抗体(可检测标记的）和第二抗体（固定在测试装置的 预定区处)在测试装置的预定区处与样品中的TIMP2形成夹屯、复合物。在夹屯、测定中，第一 抗体和第二抗体可W是相同的（尤其是在使用多克隆抗体时)或不同的。因此，本发明的抗 体可W用于夹屯、对，或可W单独地与非为单克隆抗体诸如多克隆单体或适体的另一种结合 实体一起使用。
[0023] 本发明的抗体可W用作测试试剂盒中用于检测生物样品中的TIMP-2的试剂。运种 测试试剂盒可W例如包括一次性测试装置，所述一次性测试装置被配置来产生与生物样品 中的人TIMP-2的存在或量有关的可检测信号。可替代地，运种测试试剂盒可W被配制用于 在未利用一次性测试装置的临床分析器中执行测定。优选地，测试试剂盒是体外诊断。如本 文所使用的术语"体外诊断的"指代无论是单独使用还是组合使用生产商都意图体外使用 来检测来源于人体的试样(包括血液和组织捐赠品）的医疗装置，所述医疗装置为试剂、试 剂产品、校准器、控制材料、试剂盒、仪器、设备、器材或系统，所述医疗装置仅仅或主要是为 了提供与生理学或病理学状态有关的、或与先天性异常有关的信息，或者确定潜在接受体 的安全和相容性，或监控治疗性措施。
[0024] 在某些实施方案中，免疫测定W侧流模式执行。侧流测试是免疫测定的一种形式， 其中测试样品W色谱方式沿吸水性或非吸水性多孔固体衬底流动。侧流测试可W操作为竞 争或夹屯、模式测定。优选的侧流装置是一次性的、单次使用测试装置。在涂覆区将样品涂覆 到测试装置上并且使所述样品经过衬底，在所述衬底处，所述样品与已用抗体或抗原预处 理的线或区接触。如本文所使用的术语"测试区"指代侧流测试条上接受询查W便于产生与 相关分析物的存在或量有关的信号的离散位置。可检测信号可W通过将一次性测试装置插 入到分析仪器诸如反射计、巧光计或透射光度计中来视觉读取或获得。运个清单并非意味 着要限制。样品可W在未预处理的情况下涂覆到涂覆区上，或可W在涂覆之前与一种或多 种测定试剂预混合。在后一种情况下，抗体可W提供在与一次性测试装置分开的容器中。
[0025] 本发明的抗体可W分散性地固定到一次性测试装置内的表面上，W使得抗体在样 品接触表面时溶解到所述样品中。在夹屯、测定模式中，运种分散性结合的抗体可W结合至 样品中所述抗体的同源抗原，并且之后在抗原被检测区处非分散性地结合的第二抗体结合 时固定在所述检测区处。在竞争模式中，样品中所述抗体的同源抗原可W与提供为测试试 剂的标记抗原竞争结合至分散性结合的抗体。
[0026] 本发明的试剂盒还可W包括用于使可检测信号与TIMP-2的浓度相关的校准。通过 举例，校准曲线可W提供在由接收一次性测试装置的分析仪器读取的电子存储器装置上， 诸如ROM忍片、闪存驱动器、RFID标签等。可替代地，校准曲线可W提供在编码标记上，所述 编码标记被光学(诸如二维条形码)读取，或经由网络连接传输。分析仪器之后可W使用运 个校准曲线来使来自测定的可检测信号与TIMP-2浓度相关。
[0027] 在某一实施方案中，使用本发明的一种或多种抗体执行的测定方法提供与生物样 品中的人TIMP-2的存在或量有关的信号，其中测定方法中的TIMP-2的最小可检测浓度是 1 Ong/mL或更小、更优选地1 ng/mL或更小W及最优选地0.1 ng/mL或更小。
[0028] 在优选方面，本发明提供用于确定生物样品中的人TIMP2的存在或量的方法，所述 方法包括：
[0029] 用与人TIMP2-起形成夹屯、复合物的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体对所述生 物样品执行免疫测定，其中所述免疫测定提供与所述生物样品中结合在所述夹屯、复合物中 的人TIMP2的存在或量有关的可检测信号；W及
[0030] 使所述可检测信号与所述生物样品中的人TIMP2的所述存在或量相关。优选地，免 疫测定中的TIMP-2的最小可检测浓度是lOng/mL或更小、更优选地Ing/mL或更小W及最优 选是0.1 ng/mL或更小。
[0031] 在特别优选的实施方案中，第一单克隆抗体和第二单克隆抗体中的一种或两种是 特异地结合人TIMP-2的更为分离的单克隆抗体，其中每一种分离的单克隆抗体W至少10 8M ^的亲和力结合至多肤，所述多肤的序列由选自由W下组成的组的序列组成：
[0032] QAFCNADWIRAKAVS邸EVD(SEQ ID N0:1)、
[0033] lYGNPIKRIQYEIKQI(沈Q ID N0:2)、
[0034] YEIKQIKMFKGP邸DIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDG(SEQ ID N0:3)、
[0035] YEIKQIKMFKGP邸DIEFIYTAPSSAV(SEQ ID NO:4)、
[0036] EFIYTAPSSAVCGVS(SEQ ID N0:5)、
[0037] TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQ ID N0:6)、
[00；38] SLDVGGKKEYLIAGKAEGDGK(SEQ ID N0:7)、
[0039] SSPDE化WMDWVT邸NING册（SEQ ID N0:8)W及
[0040] CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQ ID N0:9)〇
[0041] 优选的测定方法包括执行检测人TIMP-2的免疫测定。运类免疫测定可W包括将所 述体液样品与检测标志物的抗体相接触，并且检测与所述抗体的结合。虽然本发明总体是 在免疫测定方面描述，但不基于免疫球蛋白支架的其他结合实体(例如，适体)也可W使用 来代替运类方法中的抗体。优选地，体液样品选自由尿液、唾液、血液、血清W及血浆组成的 组，并且最优选地是尿液。
[0042] 本公开的一个或多个实施方案的细节列举在W下附图和描述中。通过描述和附图 并且通过权利要求书，本公开的其他特征、目的和优点将显而易见。
[0043] 发明详述
[0044] 定义
[0045] ^文所使用，术语"金属蛋白酶抑制剂2"和"TIMP-2"指代生物样品中存在的衍 生自金属蛋白酶抑制剂2前体(人前体:5巧133斗'〇巧16035(560 10顯：10))的一种或多种 多肤。
[0046]
[0047] 已鉴别金属蛋白酶抑制剂2中的W下结构域：
[004引残基长度结构域ID
[0049] 1-26 26 信号肤
[00加]27-220 194金属蛋白酶抑制剂2
[0051] 除非本文另外确切说明，否则所使用的术语的定义是药物科学领域中使用的标准 定义。如说明书和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确规定之外，否则单数形式 "一个(a)"、" 一种(an)"和"所述(the)"包括复数指示物。因此，例如，提到"药物载体"包括 两个或更多个运类载体的混合物等。
[0052] 如本文所使用的术语"受试者"指代人或非人生物体。因此，本文所描述的方法和 组合物可适用于人和兽医疾病。另外，虽然受试者优选地是活生物体，但本文所描述的本发 明同样可W用于死后分析。优选的受试者是人，并且最优选地是"患者"，所述患者如本文所 使用指代正接收针对疾病或病状的医疗护理的活人。运包括针对病理体征进行研究的未患 有所定义疾病的人。
[0053] 优选地，分析物在样品中进行测量。运种样品可W获自受试者，或可W获自意图被 提供给受试者的生物材料。例如，样品可W获自对受试者体内的可能移植正进行评价的肾， 并且分析物测量用于评价肾的已经存在的损伤。优选的样品是体液样品。
[0054] 如本文所使用的术语"体液样品"指代出于对相关受试者诸如患者或移植捐献者 的诊断、预后、分类或评价的目的而获得的体液的样品。在某些实施方案中，运种样品可W 出于确定正在发生的病状的转归或治疗方案对病状的影响的目的而获得。优选的体液样品 包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、疲W及胸腔积液。此外，本领域技术人员将认识 到某些体液样品在分级分离或纯化程序(例如，将全血分离为血清或血浆组分)之后会更容 易分析。
[0055] 如本文所使用