用于生物样品中的具有提高的性能的timp2测定的制作方法_6

文档序号:9768817阅读:来源:国知局
所述板。在 稀释剂中制备0.化g/mL中性链亲和素-皿P缀合物溶液,并且将10化L运种溶液添加到每个 孔中。在室溫下将所述板解育1小时,并且进行洗涂。将10化L 1-step ultra TMB底物添加 到每个孔中,在室溫下避光解育10分钟,之后是50化终止液。用波长设定为45化m的酶标仪 测量每个孔中的光密度。
[0140] 实施例4:用患者样品筛选抗体(侧流条测试方法)
[0141] 材料;
[0142] 硝化纤维素膜
[0143] 背衬卡
[0144] 样品垫
[0145] 忍吸垫
[0146] 膜封闭缓冲液:1 OmM憐酸钢、0.1 % 薦糖、0.1 % BSA、0.2 % PVP-40,抑 8.0
[0147] 样品垫封闭缓冲液:5mM棚酸、0.1 % Tween-20、0.25 % PVP-40、0.5 % BSA,pH 8.5 [014 引 运行缓冲液J:500mMTris、0.2%10G、0.35%Tween-20、0.25%PVP-40,抑8.5
[0149] 巧光共辆抗体
[0150] 测试线抗体
[0151 ]山羊-抗-小鼠阳性对照抗体
[0152] 重组人 TIMP-2
[0153] 划线涂布组件
[0154] 使用AD3050抽吸分配系统用测试线抗体来划线涂布硝化纤维素膜,用膜封闭缓冲 液进行封闭,并且在37°C下干燥30分钟。在干燥器中固化过夜之后,用忍吸垫和用样品垫封 闭缓冲液预处理过的样品垫将成条的且封闭的硝化纤维素膜层压到背衬卡上。将所述卡切 割成5mm宽的测试条,之后将所述测试条置于药筒中。
[0155] 样品制备
[0156] 将纯化的重组TIMP-2分析物渗入到运行缓冲液J中并且连续稀释W产生覆盖一定 浓度范围的一组标准样品。将冷冻的患者样品的单次使用等分试样在室溫水浴中解冻10分 钟,并且之后用运行缓冲液J稀释到所需水平。
[0157] 测试程序
[015引将10化巧光共辆抗体(0.025ygAiL)的PBS添加到1(Κ)化样品中。之后将1(Κ)化运种 溶液装载到药筒上的输入口中。在t = 20分钟时使用巧光读取器和相关联软件来读取结果。
[0159] 实施例5:表位定位
[0160] 材料:96孔高结合微量滴定板、中性链亲和素、生物素酷化的肤、未缀合的抗体、小 鼠 I gG、兔I gG、山羊I gG、HRP缀合至抗小鼠 I gG的HRP缀合物、抗兔I gG HRP缀合物、抗山羊I gG HRP缀合物、TMB底物、2N硫酸用于表位定位实验。
[0161] 将中性链亲和素固定在96孔高结合微量滴定板的各个孔中。洗涂所述板W去除未 反应的中性链亲和素,之后是封闭步骤。将生物素酷化的肤在缓冲水溶液中溶解到lOyg/mL 的浓度。将50化肤溶液添加到中性链亲和素涂布的微量滴定板的每个孔中。将运些板在室 溫下解育一小时,并且之后进行洗涂W去除未结合的肤。将未缀合的小鼠和兔抗体稀释到5 yg/mL,并且Κ?(Κ)μLν孔添加到板上。将抗小鼠 IgG(在小鼠抗TIMP2中)或抗兔IgG(在兔抗 TIMP2的情况下)添加到邻近孔中作为阴性对照。在室溫下将板解育1小时,并且进行洗涂。 将缀合至抗小鼠 IgG的皿P(在小鼠抗TIMP2和小鼠 IgG阴性对照的情况下似及缀合至抗兔 IgG的HRP(在兔抗TIMP2和兔IgG阴性对照的情况下)稀释到0.2yg/mL,并且将100化添加到 所述板的每个孔中。在室溫下将运些板解育20分钟,并且进行洗涂。Κ?(Κ)μLν孔添加 TMB底 物,并且将板解育20分钟,同时避免暴露于光。将50μ1/孔终止液(2Ν硫酸)添加到板的每个 孔上W终止反应。在设定为在450nm下测量光密度的分光光度式96孔酶标仪上读取吸光度。 [01创实施例6:丙氨酸扫描肤定位
[0163] 丙氨酸扫描是广泛使用的诱变方法,其中祀蛋白中的残基在所选位置处通过定点 诱变系统性取代为丙氨酸,进行表达并且测定功能。用丙氨酸残基进行取代消除了侧链相 互作用,而不需改变主链构象或引入位阻效应或静电效应。使用自动化诱变方案,祀多肤中 的每个残基被改变为丙氨酸,并且可W确定包含每个抗体结合结构域的关键残基。
[0164] 实施例7:结果
[0165] 使用组合的丙氨酸扫描和肤定位结果,鉴别并选择独特的TIMP-2单克隆抗体。先 前在可商购的TIMP-2单克隆抗体中并未观察到运些抗体的结合中设及的表位。
[0166]
[0167]
[0168] 虽然本发明W使得本领域技术人员能够制得并使用它的足够细节来描述和例示, 但是各种替代方案、修改和改进应是显而易见的,而不背离本发明的精神和范围。本文中提 供的实施例代表优选实施方案,为示例性的,并且并非意图作为本发明的范围的限制。本领 域技术人员将想到本文的修改和其他用途。运些修改都涵盖在由权利要求书的范围所界定 的本发明的精神范围内。
[0169] 除非另外陈述,否则本文"或"的使用意指"和/或"。类似地,"包含(comprise)"、 。包含(comprises)"、。包含(comprising)"、。包括(include)"、。包括(includes)" W及。包 括(including)"是可互换的并且不意图是限制性的。
[0170] 应进一步理解在各种实施方案的描述使用了术语"包含"的地方,本领域技术人员 将理解在一些具体的例子中,实施方案可W使用语言"基本上由……组成"或"由……组成" 来替代地描述。
[0171] 除非另外定义,否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域 中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然可W在所公开的方法和组合物的实践中使 用类似或等效于本文所描述的那些方法和试剂的任何方法和试剂,但是现在描述了示例性 的方法和材料。
[0172] 出于描述和公开描述于出版物中、可能与本文的描述结合使用的方法学的目的, 本文所提及的所有出版物均W引用的方式整体并入本文。说明书中提到的所有专利和出版 物指示在本公开的提交日期之前的本发明所属领域中的普通技术人员的水平。在本文中没 有任何内容应该解释为承认发明人无权先于因先前发明所作的此类公开。
[0173] 本领域技术人员将容易显而易见的是,在不脱离本发明的范围和精神的情况下可 W对本文中所公开的发明进行可变的替换和修改。
[0174] 本文中适当地说明性地描述的发明可W在缺少在本文中并未具体公开的任何一 个或多个元件、一个或多个限制的情况下实践。因此,例如,在本文中的每一个例子中,术语 "包含"、"主要由……组成"和"由……组成"中的任何术语都可W由其他两个术语中的任何 一个代替。已采用的术语和措辞是用作描述而非限制的术语,并且在使用运类术语和措辞 时并非意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物,但是应认识到,各种修改可 能处在要求保护的本发明范围内。因此,应理解,尽管本发明已由优选实施方案和任选特征 具体公开,但是本领域技术人员可W采用本文中公开的概念的修改和变化,并且运类修改 和变化被视为处在如由所附权利要求书所界定的本发明的范围内。
[0175]在W上权利要求书内阐述其他实施方案。
【主权项】
1. 一种特异地结合人??ΜΡ-2的分离的单克隆抗体,其中所述单克隆抗体以至少108]^ 1 的亲和力结合至多肽,所述多肽的序列由选自由以下组成的组的序列组成: QAFCNADVVIRAKAVSEKEVD(SEQ ID ΝΟ:1)^ IYGNPIKRIQYEIKQI(SEQ ID NO:2)、 YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAE⑶G(SEQ ID NO:3)、 YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAV(SEQ ID N0:4)、 EFIYTAPSSAVCGVS(SEQ ID N0:5)、 TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQ ID N0:6)、 SLDVGGKKEYLIAGKAE⑶GK(SEQ ID N0:7)、 SSPDECLffMDWVTEKNINGHQ(SEQIDN0:8)W& CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQ ID N0:9)〇2. 根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体缀合至信号发生成分。3. 根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体固定在固体支持物上。4. 根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体被提供为试剂盒中的试剂, 所述试剂盒还包括一次性测试装置,所述一次性测试装置被配置来产生与生物样品中的人 TIMP-2的存在或量有关的可检测信号。5. 根据权利要求4所述的分离的单克隆抗体,其中所述一次性测试装置是侧流测试装 置。6. 根据权利要求4或5中一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体固定到所述一次 性测试装置内的表面上。7. 根据权利要求4或5中一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体提供在与所述一 次性测试装置分开的容器中。8. 根据权利要求4-7中一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述试剂盒还包括特异地 结合人TIMP-2的第二抗体,其中所述分离的单克隆抗体和所述抗体与人TIMP-2形成夹心复 合物。9. 根据权利要求8所述的分离的单克隆抗体,其中所述第二抗体是以至少ΙΟ^Γ1的亲和 力结合至多肽的单克隆抗体,所述多肽的序列由选自由以下组成的组的序列组成: QAFCNADVVIRAKAVSEKEVD(SEQ ID N0:1)^ IYGNPIKRIQYEIKQI(SEQ ID N0:2)、 YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAE⑶G(SEQ ID NO:3)、 YEIKQIKMFKGPEKDIEFIYTAPSSAV(SEQ ID N0:4)、 EFIYTAPSSAVCGVS(SEQ ID N0:5)、 TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQ ID N0:6)、 SLDVGGKKEYLIAGKAE⑶GK(SEQ ID N0:7)、 SSPDECLffMDWVTEKNINGHQ(SEQIDN0:8)W& CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQ ID N0:9)〇10. 根据权利要求4-9中一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述试剂盒还包括用于使 所述可检测信号与TIMP-2的浓度相关的校准。11. 根据权利要求10所述的分离的单克隆抗体,其中所述校准是提供在电子存储器装 置上的校准曲线。12. 根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体,其中所述分离的单克隆抗体被提供为体 外诊断中的试剂。13. 根据权利要求4-10中一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述试剂盒被配置来执 行测定方法,所述测定方法提供与生物样品中的人??ΜΡ-2的存在或量有关的信号,并且其 中所述测定方法中的??ΜΡ-2的最小可检测浓度是1 Ong/mL或更小。14. 根据权利要求1-13中一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述分离的单克隆抗体 是兔、小鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲盤或胳盤科动物抗体。15. 根据权利要求1-13中一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述分离的单克隆抗体 是兔抗体。16. -种用于确定生物样品中的人??ΜΡ2的存在或量的方法,其包括: 用与人??ΜΡ2-起形成夹心复合物的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体对所述生物样 品执行免疫测定,其中所述免疫测定提供与所述生物样品中结合在所述夹心复合物中的人 TIMP2的存在或量有关的可检测信号;以及 使所述可检测信号与所述生物样品中的人??ΜΡ2的所述存在或量相关。17. 根据权利要求11所述的方法,其中所述免疫测定中TIMP-2的最小可检测浓度是 1 Ong/mL或更小。18. 根据权利要求16或17所述的方法,其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗 体中的一个或两个是根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体。19. 根据权利要求16-18中一项所述的方法,其中所述免疫测定是以侧流模式执行。20. 根据权利要求16-18中一项所述的方法,其中所述免疫测定是体外诊断。21. 根据权利要求16-20中一项所述的方法,其中所述免疫测定通过将所述人患者样品 涂覆到一次性测试装置上来执行,并且所述可检测信号通过将所述一次性测试装置插入到 分析仪器中来获得,其中包含所述第一抗体和所述第二抗体的所述夹心复合物被固定用于 在所述一次性测试装置的预定区内进行检测,并且其中所述分析仪器检测所述固定的夹心 复合物以提供所述可检测信号。22. 根据权利要求16-21中一项所述的方法,其中所述第一抗体缀合至信号发生成分。23. 根据权利要求22所述的方法,其中所述第一抗体与所述人患者样品形成反应混合 物,并且所述人患者样品通过将所述反应混合物涂覆到所述一次性测试装置上来涂覆到所 述一次性测试装置上。24. 根据权利要求22或23所述的方法,其中所述第二抗体固定在固体支持物的预定区 处。25. 根据权利要求11-18中一项所述的方法,其中所述第一抗体和所述第二抗体各自是 兔、小鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲5它或胳5它科动物抗体。26. 根据权利要求11-18中一项所述的方法,其中所述第一抗体和所述第二抗体各自是 兔抗体。
【专利摘要】本发明提供尤其是在用于评价肾损伤时具有提高的临床性能的TIMP2免疫测定。所述免疫测定依赖于当用于复杂的临床样本诸如生物流体时,且尤其是用于快速测定模式诸如侧流测试装置时展现出提高的测定性能的抗体和抗体对的选择和使用。
【IPC分类】C07K16/38
【公开号】CN105531291
【申请号】CN201480048192
【发明人】R·A·维贾延德兰, S·万卡塔苏巴劳
【申请人】阿斯图特医药公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年8月7日
【公告号】CA2920521A1, EP3030582A1, WO2015021308A1
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