用于从单一植物样品中分离dna、rna和蛋白质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用于分离基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法。更具体地，本发明设及 用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的简单且快速的系统和方 法。
【背景技术】
[0002] 提取DNA、RNA和蛋白质是分子生物学研究的第一步。随着分子生物学的深入，常 常需要对一份样品进行多层次的研究，如：DNA的SNP分析、mRNA的表达量分析W及蛋白质 的双向电泳分析等。对许多珍贵植物样品，如：植物突变体等，由于数量少按照传统的方法 只能获取到DNA、RNA或蛋白质的一种。此外，不同样品在DNA、RNA和蛋白研究也存在组织 差异性，而对实验结果产生影响。建立一套能同步从组织样品中提取DNA、RNA和蛋白的方 法有重要实践意义。已报到的试剂中TRIzol试剂具有从同一样品中分离DNA、RNA和蛋白 质的功能，但在植物组织样品的分离中存在W下问题：1.DNA分离效果不稳定，在植物样品 中分离的量比较少；2.分离的蛋白质纯粹较低，不适用于后续蛋白质组学分析。
[0003] 植物组织中富含糖类、脂类、色素、酪、酿及其他多种次生代谢产物，运些物质将严 重干扰DNA、RNA和蛋白质的纯化。本发明依据TRIzol的基本原理，对其试剂成分进行了改 良，提高了分离植物样品的DNA的稳定性，提高了分离蛋白质的纯度，分析表明其分离蛋白 质完成适用于后续蛋白质组学分析。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了用于从单个植物材料中高效、简单地提取基因组DNA、RNA和蛋白质 的纯化的方法。 阳0化]本发明的另一个发明目的是制备一种改良型的TRIzol试剂。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法，所述 方法包括步骤：
[0008] ①.提取液的制备：按照水饱和苯酪：异硫氯酸脈=2:1(V/W)的比例配置成混合 液，其后按照2%体积比加入吐溫20,加入50mMΞ径甲基氨基甲烧，使用肥1调节抑7,形 成混合液A;
[0009] ②.组织样品的粉碎
[0010] 取植物组织样品0. 5g，放入灭菌并预冷的研鉢中，并加入约50mgPVPP混合，液氮 研磨成细粉，将粉末转入离屯、管；
[0011] ③.组织样品的裂解
[0012] 向离屯、管中加入5ml混合液A，上下混匀10-15S，室溫放置5min;按0.2ml氯仿/ml 混合液A加入氯仿，按照2% (w/v)DTT，轻微振荡10-15S，室溫放置3-4min;在4°C，8000Xg 条件下离屯、15min;
[0013] 离屯、后混合物分为Ξ层，移取上层水相a至新离屯、管，用于后续RNA制备；取下层 酪相b至另外一个离屯、管，用于蛋白质提取；剩余部分C用于DNA制备。
[0014] ④.RNA样品制备
[0015] 取所述水相a到新离屯、管，按照0. 5ml异丙醇/ml混合液a加入异丙醇，混匀，室 溫放置5-lOmin;在4°C，12000Xg条件下离屯、lOmin，弃上清；加入1ml75%乙醇，经06口〔 处理悬浮沉淀，4°C,SOOOXg条件下离屯、5min，去上清；室溫惊干沉淀，加入适量DEPC处理 水溶解RNA，-80°C冰箱保存；
[0016] ⑥.蛋白质样品制备
[0017] 取所述酪相b到新离屯、管，按1. 5ml异丙醇/ml混合液a加入下层酪相，4°C解育 20min，每5-lOmin震荡混匀10-20S;4°C，10000Xg条件下离屯、lOmin;去上清，按2ml洗液 /mlTrizol加入蛋白质沉淀物，所述洗液为0. 3M盐酸脈/95 %乙醇，室溫解育15-20min; 4°C，20000Xg条件下离屯、5min，重复2次；最后一次沉淀后，用1ml无水乙醇代替洗液洗涂 蛋白；沉淀真空冻干燥，干粉保存于-80°C备用； 阳0化]⑥.DNA样品制备
[0019] 在剩余部分C加入65°C的CTAB提取液900μL65°C水浴15至20min;冷却后加入 500μL氯仿和异戊醇，所述氯仿：异戊醇=24:l(V/V)，室溫，10000Xg条件下离屯、10min; 取上清液，加入1/10体积的3M醋酸钢和等体积的异丙醇，摇匀至出现絮状沉淀；室溫， lOOOOXg条件下离屯、5min，倒掉上清液；用75%酒精清洗，室溫干燥比后溶于TE缓冲液。
[0020] 一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的改良提取 液，其特征在于，所述的提取液的制备为：按照水饱和苯酪：异硫氯酸脈=2:1 (V/W)的比例 配置成混合液，其后按照2%体积比加入吐溫20,加入50mMS径甲基氨基甲烧，使用肥1调 节抑7。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 1.本发明对TRIzol试剂中有效成分进行了改良，选取了非离子表明活性剂 TWEEN-20替换阴离子表明活性剂十二烷基肌氨酸钢，十二烷基肌氨酸钢为阴离子表明活性 剂与蛋白质结合会对蛋白质的带电荷产出影响，TWEEN-20与蛋白结合力强，用于防止物质 分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。使用Tris代替醋酸钢/巧樣酸钢 组成的混合缓冲剂，醋酸钢和巧樣酸钢为有机盐，将会对最终提取纯化蛋白产生影响。
[0023] 2.在植物样品粉碎中添加了交联聚乙締化咯烧酬（PVP巧，PVPP是一种大分子有 机物，能强烈的吸附植物组织中酪类，酿类等有机物，从而提高了分离成分，尤其是蛋白质 的纯度。在分离过程中添加了二硫苏糖醇值TT)，是一种强还原剂，其不能阻止酪类对蛋白 的氧化，但是可W减少蛋白质二硫键的形成，而减少RNA酶、DNA酶和蛋白酶的对目标物的 影响。
【附图说明】
[0024]图1是琼台糖凝胶电泳检测提取DNA样品比较的凝胶图像；
[0025] 图2是琼台糖凝胶电泳检测提取RNA样品比较的凝胶图像；
[00%]图3是本发明的水稻幼苗双向电泳图谱；
[0027] 图4是现有技术的水稻幼苗双向电泳图谱； 阳02引图5是本发明的白Ξ叶双向电泳图谱；
[0029] 图6是现有技术的白Ξ叶双向电泳图谱；
[0030] 图7是本发明的紫花首猜幼苗双向电泳图谱；
[0031]图8是现有技术的紫花首猜幼苗双向电泳图谱；
[0032] 图1中左边1，2, 3本实施方案分离结果，右边4, 5, 6为常用的十六烷基Ξ甲基漠 化锭（CTAB)方案获分离结果；其中1，4为水稻幼苗；2, 5为白Ξ叶；3, 6为紫花首猜幼苗。
[0033] 图2中左边1，2, 3本实施方案分离结果，右边4, 5, 6为常用的TRIzol试剂盒方案 获分离结果；其中1，4为水稻幼苗；2, 5为白Ξ叶；3, 6为紫花首猜幼苗。
【具体实施方式】
[0034] 具体地：
[00对 1.提取液的制备：按照水饱和酪：异硫氯酸脈=2:1 (v/w)的比例配置成混合液， 其后按照2% (V/V)体积加入吐溫20灯WEEN-20)，加入50mMS径甲基氨基甲烧，使用肥1 调节抑7,形成混合液A。
[0036] 2.组织样品的粉碎
[0037] 取组织样品（水稻、白Ξ叶、紫花首猜等组织样品）0. 5g，放入灭菌并预冷的研鉢 中，并加入约50mgPVPP混合，液氮研磨成细粉，将粉末转入离屯、管。 阳03引 3.组织样品的裂解
[0039] 向离屯、管中加入5ml混合液A，上下混匀10-15S，室溫放置5min;按0. 2ml氯仿/ml 混合液A加入氯仿，按照2% (w/v)DTT，轻微振荡10-15S，室溫放置3-4min;在4°C，8000Xg 条件下离屯、15min。离屯、后混合物分为Ξ层，移取上层水相a至新离屯、管，用于后续RNA制 备；取下层酪相b至另外一个离屯、管，用于蛋白质提取；剩余部分C用于DNA制备。
[0040] 4.RNA样品制备
[0041] 取上步水相a到新离屯、管，按照0. 5ml异丙醇/ml混合液a加入异丙醇，混匀，室 溫放置5-lOm