专利名称：一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法，属于分析化学领域。
背景技术：
细胞分裂素(cytokinins，CKs)是一类腺嘌呤衍生物，根据N_7位上的取代基的不同分为异戊烯基腺嘌呤和芳香基腺嘌呤。在植物体内，细胞分裂素以自由碱，细胞分裂素核苷、核苷酸和细胞分裂素糖苷形式存在，现已被发现的细胞分裂素有四十多种。细胞分裂素在植物体整个生命中起着重要的调节作用，包括细胞的分裂与分化，根、芽的形成与生长、损伤后的再生，消除顶端优势等。近年来，关于细胞分裂素的生理学机能，例如CKs的生物合成、降解、代谢路径以及与其他激素之间的相互作用的研究收到广泛关注。但由于植物的提取液中基质复杂且细胞分裂素的含量低，这些研究的开展受到一定限制。因此，建立高效的样品前处理方法并结合高灵敏度的检测方法是CKs检测的关键。目前，已报道的植物中细胞分裂素的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、磁固相萃取和液相色谱纯化方法等。较其他方法相比，固相萃取因具有操作简便，可选商品化的填料种类多而被广泛使用。但是，这些方法一般是多步或多层不同性质(反相型、离子交换型和混合模式型)的填料的组合，操作过程繁琐，且细胞分裂素在实际样品中的回收率低，消耗的植物样品量多(一般需要200毫克)，且在处理过程中用到多种不同种类的溶剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单、快速的植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法。本发明为解决上述技术问题所提出的技术方案为一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法，包括以下步骤I)提取内源性细胞分裂素准确称量植物样品后用液氮冷冻，研磨至粉末状，加入同位素内标[2H6]异戊烯基腺嘌呤，[2H6]异戊烯基腺嘌呤核苷，[2H6]异戊烯基腺嘌呤9-糖苷，[2H5]反式玉米素，[2H5]反式玉米素核苷，[2H5]反式玉米素9-糖苷，[2H3] 二氢玉米素，[2H3] 二氢玉米素核苷，然后加入乙腈，_20°C以下放置12小时以上；2)除固体将步骤I)所得样品离心，取上清液；3)固相萃取除杂将步骤2)所得的上清液通过事先用平衡液平衡后的固相萃取小柱，清洗后收集解吸液，除去收集到的解吸液中的溶剂；4)定容检测将步骤3)所得样品定容后进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，检测细胞分裂素。所述的固相萃取小柱填料为亲水性填料。作为一种优选，所述的固相萃取小柱填料为硅胶。本发明所述的植物样品包括水稻、油菜、拟南芥、番茄、烟叶等植物的根、茎、叶、花、花粉等组织及其组织提取液。细胞分裂素是一类腺嘌呤的衍生物，其结构中均含氮原子的杂环或糖苷键，赋予其一定的亲水性。因此，我们利用亲水作用来富集纯化细胞分裂素。在固相萃取步骤中，硅胶是廉价易得的吸附剂，利用亲水作用富集提取液中的细胞分裂素，再通过清洗步骤，除去非极性杂质(非极性色素等)。此外，植物基质中的极性基质在分离过程中最先出来，实现杂质与目标的细胞分裂素的分离。本发明利用亲水作用通过固相萃取柱(硅胶)可以有效地富集细胞分裂素，除去非极性杂质，需要的样品量少，操作简单，实现快速的细胞分裂素检测方法，使细胞分裂素在实际样品中有较高的回收率，仅在20mg植物叶片和根中实现了内源性细胞分裂素的检测。
图1是应用本发明所提供的8种细胞分裂素标准样品的多反应监测谱图，其中，I为反式玉米素9-糖苷(t-Z9G) ,2为反式玉米素(t-Z) ,3为二氢玉米素(DHZ),4为反式玉米素核苷(t-ZR)，5为二氢玉米素核苷(DHZR)，6为异戊烯基腺嘌呤9-糖苷(iP9G)，7为异戊烯基腺嘌呤(iP)，8为异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)。图2为检测到的水稻叶中内源性细胞分裂素多反应监测谱图，其中，I为反式玉米素9-糖苷(t-Z9G)，2为反式玉米素(t-Z)，3为二氢玉米素(DHZ)，4为反式玉米素核苷(t-ZR)，6为异戊烯基腺嘌呤9-糖苷(iP9G)，7为异戊烯基腺嘌呤(iP)，8为异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)。图3为检测到的水稻根中内源性细胞分裂素多反应监测谱图，其中，I为反式玉米素9-糖苷(t-Z9G), 3为二氢玉米素(DHZ), 4为反式玉米素核苷(t_ZR), 6为异戊烯基腺嘌呤9-糖苷(iP9G)，7为异戊烯基腺嘌呤(iP)，8为异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)。
具体实施例方式实施例1水稻叶中细胞分裂素的测定准确称量20mg水稻叶片液氮冷冻，置于1. 5mL离心管中，用球磨机研磨至粉末状后，加入同位素内标[2H6]异戊烯基腺嘌呤，[2H6]异戊烯基腺嘌呤核苷，[2H6]异戊烯基腺嘌呤9-糖苷，[2H5]反式玉米素，[2H5]反式玉米素核苷，[2H5]反式玉米素9-糖苷，[2H3] 二氢玉米素，[2H3] 二氢玉米素核苷各O. lng，同时以2001^乙腈-201放置1211。样品以IOOOOrpm的转速离心lOmin，取上清液。然后将所得上清液通过事先经过2mL乙腈/水(1/1，v/v)、2mL乙腈/水(9/1，v/v)和2mL乙腈平衡的固相萃取小柱。然后再以ImL乙腈清洗；最后，以乙腈/水(l/4，V/V，lmL)，解吸。收集解吸液，氮气吹干，定容至IOOyL,进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，进样体积为20 μ L。检测到的水稻叶中内源性细胞分裂素，如图2所示。为实现样品中细胞分裂素的定量，本发明提供了 8种细胞分裂素的标准样品的多反应监测谱图，如图1所示。8种细胞分裂素 的多反应监测模式离子对如表I所示表1. 8种细胞分裂素的多反应监测模式定量离子对
权利要求
1.一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤 1)提取内源性细胞分裂素准确称量植物样品后用液氮冷冻，研磨至粉末状，加入同位素内标[2H6]异戊烯基腺嘌呤，[2H6]异戊烯基腺嘌呤核苷，[2H6]异戊烯基腺嘌呤9-糖苷，[2H5]反式玉米素，[2H5]反式玉米素核苷，[2H5]反式玉米素9-糖苷，[2H3] 二氢玉米素，[2H3]二氢玉米素核苷，然后加入乙腈，_20°C以下放置12小时以上； 2)除固体将步骤I)所得样品离心，取上清液； 3)固相萃取除杂将步骤2)所得的上清液通过事先用平衡液平衡后的固相萃取小柱，清洗后收集解吸液，除去收集到的解吸液中的溶剂； 4)定容检测将步骤3)所得样品定容后进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，检测细胞分裂素。
2.根据权利要求1所述的一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量测定方法，其特征在于所述的固相萃取小柱填料为亲水性填料。
3.根据权利要求1或2所述的一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量测定方法，其特征在于所述的固相萃取小柱填料为硅胶。
全文摘要
本发明公开了一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法。该方法先以乙腈提取细胞分裂素，再以硅胶固相萃取小柱富集除杂后，吹干、定容，采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，进而实现内源性细胞分裂素的定量检测。该方法操作简单快速，样品用量少，使用溶剂种类少，有效除去了大部分植物基质，回收率较高，可实现低含量的内源性细胞分裂素的检测。
文档编号G01N30/08GK103048404SQ20121055574
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者冯钰锜, 蔡保东 申请人:武汉大学