专利名称：一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种植物样品中内源性油菜素留醇的定量检测方法，属于分析化学领域。
背景技术：
油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)是一种多轻基化的甾醇类化合物，是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯之后发现的第六类植物激素。迄今为止，已经发现包括 28-norbrassinolide, 28-norcastasterone,油菜素内酯(brassinolide), 24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide),油菜素甾酮(castasterone), 24-表油菜素甾酮 (24-epicastasterone),高油菜素内酯(homobrassinolide)等几十种 BRs 类化合物。BRs 在植物体内含量极低，通常为0. 01-lng/g。油菜素留醇调控着植物的一系列生理学和代谢过程，包括种子的发芽，幼苗的生长到成熟，种子的发育等。同时，BRs还对植物细胞的伸长、分裂和分化，作物产量的增加，生殖，衰老，对乙烯生物合成的感应，根的生长和发展，花粉管的形成，质子泵的激活，光合作用以及对抗氧化系统的感知等特异性生理学过程有重要作用。近年来，关于油菜素留醇的生理学机能，例如BRs的生物合成，降解以及代谢路径的研究受到广泛关注。但由于植物的提取液中基质复杂且油菜素留醇含量极低，这些研究的开展受到一定限制。因此，建立高效的样品前处理方法并结合高灵敏度的检测方法是BRs 检测的关键。
目前，已报道的植物中油菜素甾醇的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、磁固相萃取和液相色谱纯化方法等。这些方法均对样品量提出很高的要求，多数要求40g鲜重以上，显然如此大的样品量对于部分珍贵的样品是无法实现的，同时也给样品前处理过程带来溶剂消耗大和成本高等问题。发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单、快速的植物样品的处理方法，并实现内源性油菜素留醇的定量检测。
本发明为解决上述技术问题所提出的技术方案为一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量检测方法，包括以下步骤
I)提取内源性油菜素留醇准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入同位素内标[2H3]油菜素内酯和[2H3]油菜素留酮，以乙腈提取后，-18°C 以下放置12h以上；
2)除水对步骤I)提取后的样品进行除水；
3)固相萃取除杂将步骤2)除水后的样品溶液通过活化后的双层固相萃取小柱， 解吸后收集上样流出液和解吸液，除去样品中的溶剂；
4)液液萃取除杂将步骤3)所得的样品以乙醚溶解，涡旋静置后弃水相，加入pH 为2 10的缓冲溶液，涡旋静置后弃水相，重复除杂3次或3次以上，取乙醚相，吹干，定容；
5)定容检测将步骤4)定容后的样品进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，测量出油菜素甾醇。
上述双层固相萃取小柱的填料为石墨化碳黑/乙二胺-N-丙基键合硅胶。
除水是将步骤I)提取后的样品离心，取上清液，向上清液中加入氯化钠，用涡旋混合仪剧烈震荡使水相与有机相分层，弃水相，再向有机相中加入无水硫酸镁除水。
缓冲溶液是用磷酸氢二钠、甲酸铵等缓冲盐配制的水溶液。
本发明的植物样品包括水稻、油菜、拟南芥、番茄、烟叶等植物的根、茎、叶、花、花粉等组织及其组织提取液。
在固相萃取步骤中，乙二胺-N-丙基键合硅胶是最常用的吸附剂，其在去除极性杂质(例如有机酸、极性色素、糖类)等方面表现出优良的性能。此外，植物基质中的疏水基质对后续的液相分离和质谱灵敏度也有一定影响。石墨化碳黑具有很强的疏水性，能和η 体系的化合物产生π-JI作用。植物提取液中的叶绿素为平面的31体系化合物，有望与石墨化碳黑通过作用结合而被去除。因此，石墨化碳黑和乙二胺-N-丙基键合硅胶结合可有效去除植物提取液中的极性和非极性杂质。
本发明以双层固相萃取柱(石墨化碳黑/乙二胺-N-丙基键合硅胶)可以有效地去除植物基质，需要的样品量小，同时实现快速、有效的油菜素甾醇检测方法，仅在Ig植物叶片和O. 5g花中实现了内源性油菜素甾醇的检测。
图I是7种油菜素甾醇的标准样品的多反应监测图，其中，I为 28-norbrassinolide 的标准样品，2 为 28-norcastasterone 的标准样品，3 为 brassinolide 的标准样品，4 为 24-epibrassinolide 的标准样品，5 为 castasterone 的标准样品，6为24-epicastasterone的标准样品，7为homobrassinolide的标准样品。
图2是应用本发明所提供的内源性油菜素甾醇的多反应监测图，其中A1和A2 是实施例5中的油菜叶样品出是实施例I中的水稻叶样品；(广(3是实施例6中油菜花的花荀样品！D1i^D4是实施例6中油菜开花后花的样品；I为28-norbrassinolide, 2为 28-norcastasterone, 3 为 brassinolide, 5 为 castasterone。
具体实施方式
实施例I
水稻叶中油菜素甾醇的测定
准确称量Ig水稻叶片置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，转移至IOmL离心管中，加入同位素内标[2H3]油菜素内酯(brassinolide)和[2H3]油菜素甾酮(castasterone) 各4ng,同时以5mL乙腈放置_18°C的冰箱中12h提取。样品以IOOOOrpm的转速离心IOmin, 取上清液。向上清液中加入250mg氯化钠，用涡旋混合仪剧烈震荡Imin使水相与有机相分层，弃水相。再向离心管中加入Ig无水硫酸镁进一步除水。以IOOOOrpm转速离心IOmin, 取上清液。接着将所得上清液过双层固相萃取小柱(事先经过5mL乙腈活化)通过固相萃取小柱，再以乙腈/甲醇(l/l，v/v，2mL)解吸。收集上样流出液和解吸液，氮气吹干。以4mL 乙醚溶解吹干的残渣，涡旋萃取杂质，静置后弃水相；再加入ImL pH为9的磷酸氢二钠缓冲溶液，涡旋萃取杂质，静置后弃水相；如此共重复3次。取乙醚相，吹干。定容至IOOuL,进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，进样体积为30 μ L。如图2所示，B为检测到的水稻中内源性油菜素甾醇。为实现样品中油菜素甾醇的定性，如图I所示，本发明提供了 7 种油菜素留醇的标准样品的多反应监测图。7种油菜素留醇的多反应监测模式定性和定量离子对如表I所示
表I. 7种油菜素留醇的多反应监测模式定性和定量离子对
权利要求
1.一种植物样品中内源性油菜素留醇的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)提取内源性油菜素留醇准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入同位素内标[2H3]油菜素内酯和[2H3]油菜素留酮，以乙腈提取后，-18°c以下放置12 h以上；2)除水对步骤I)提取后的样品进行除水；3)固相萃取除杂将步骤2)除水后的样品溶液通过活化后的双层固相萃取小柱，解吸后收集上样流出液和解吸液，除去样品中的溶剂；4)液液萃取除杂将步骤3)所得的样品以乙醚溶解，涡旋静置后弃水相，加入pH为 2^10的缓冲溶液，涡旋静置后弃水相，重复除杂3次或3次以上，取乙醚相，吹干，定容；5)定容检测将步骤4)定容后的样品进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，测量出油菜素甾醇。
2.根据权利要求I所述的一种植物样品中内源性油菜素留醇的定量检测方法，其特征在于所述的双层固相萃取小柱的填料为石墨化碳黑/乙二胺-N-丙基键合硅胶。
3.根据权利要求I或2所述的一种植物样品中内源性油菜素留醇的定量检测方法，其特征在于所述的除水是将步骤I)提取后的样品离心，取上清液，向上清液中加入氯化钠， 用涡旋混合仪剧烈震荡使水相与有机相分层，弃水相，再向有机相中加入无水硫酸镁除水。
4.根据权利要求I或2所述的一种植物样品中内源性油菜素留醇的定量检测方法，其特征在于所述的缓冲溶液是用磷酸氢二钠、甲酸铵等缓冲盐配制的水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量检测方法。该方法先以溶剂提取内源性油菜素甾醇，然后经过双层固相萃取小柱的固相萃取除杂和液液萃取的进一步除杂后，采用高效液相-电喷雾-串联质谱分析，进而实现内源性油菜素甾醇的定量检测。该方法操作简单快速，消耗的样品量少，同时有效去除了大部分植物基质，可实现低含量的内源性油菜素甾醇的定量检测。
文档编号G01N30/06GK102980953SQ20121048650
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者冯钰锜, 丁俊 申请人:武汉大学