一种玉米胚根鞘内源激素检测工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及种子科学领域，特别是关于一种玉米胚根鞘内源激素检测工艺。
【背景技术】
[0002] 种子萌发是种胚从生命活动相对静止状态恢复到生理代谢旺盛的生长发育阶段。 种子萌发过程伴随着各种生理生化变化过程，如：细胞的活化和修复、种胚的生长和合成代 谢等。这些生理生化变化过程均离不开植物内源激素的参与。植物内源激素是植物体内合 成的对植物生长发育有显著作用的微量有机物，能从产生部位转移到作用部位，在低浓 度下就能调节植物的生长发育，几乎参与了种子萌发的每一过程。玉米属一年生禾本科草 本植物，是重要的农作物之一。玉米全基因组测序完成以来，它已成为一种研宄禾本科作物 种子萌发机理的模式植物。胚根鞘作为禾本科植物特有器官，相关研宄表明，胚根鞘在增大 伸长协助胚根突破种皮完成萌发等方面发挥重要作用，故探讨激素调节胚根鞘伸长机理对 研宄玉米种子萌发机理方面具有非常重要的意义。然而植物内源激素含量极低，性质不稳 定，容易受其他次生代谢产物的干扰，此外胚根鞘组织非常小，采集量很少，而且不同植物 样品内源激素提取工艺存在差异，故不断摸索和优化玉米胚根鞘内源激素提取、纯化、检测 方法和流程，提高胚根鞘内源激素检测精准度和效果对研宄玉米种子萌发机理等方面非常 关键。传统植株内源激素提取检测方法存在样品需要量大、易受环境影响、检测误差大、检 测灵敏度低、溶剂消耗量大等问题。无法满足玉米种子萌发机理研宄中胚根鞘内源激素超 微定量定性检测的技术要求。
【发明内容】
[0003] 针对上述问题，本发明目的是提供一种玉米胚根鞘内源激素检测工艺，以提高玉 米胚根鞘内源激素检测效率和精准度，实现内源激素含量的有效检测，满足玉米种子萌发 机理研宄需要，并为其他植物组织内源激素检测提供参考。
[0004] 为实现上述目的，本发明基于GC-MS内标法，采用"横竖剥+浸提+固相萃取+ Agilent DB-17ms"技术组合提高玉米胚根鞘中8种内源激素（GApGA3、GA4、IAA、JA、DHJA、 cis-ABA和trans-ABA)检测效率和精准度。本发明采用以下技术方案：一种玉米胚根鞘内 源激素检测工艺，其包括如下工序：（1)样品采集作业；（2)样品浸提作业；（3)纯化与富集 作业；（4) GC-MS/S頂检测作业；（5)后处理。所述作业（1)中，采用"横竖剥"法采集胚根 鞘组织样品；所述作业（2)中，采用80%甲醇(冷）浸提，萃取内源激素，包括研磨提取、低温 静置、注入内标、抽滤、浓缩至水相、冻融除杂、离心取上清和萃取浓缩共8个步骤；所述作 业（3)中，采用固相萃取柱S印-Pak C18柱进行样品纯化富集，包括试剂准备、S印-Pak C18 柱清洗、激素萃取、S印-Pak C18柱重生、浓缩、甲酯化处理、转尖底试管、转毛细玻璃管和真 空干燥共9个步骤。所述作业（4)中，利用GC-MS Agilent DB-17ms进行激素检测；所述作 业（5)中，通过优化GC-MS检测条件、测量激素峰面积、计算内源激素含量、打印、保存等后 处理获得激素含量。
[0005] 本发明的有益效果是：基于GC-MS内标法，采用"横竖剥+浸提+固相萃取 +Agilent DB-17ms"技术组合提高玉米胚根鞘中8种内源激素（GA^GA3、GA4、IAA、JA、DHJA、 cis-ABA和trans-ABA)检测效率和精准度，实现玉米胚根鞘内源激素含量的有效检测。本 发明可应用于玉米种子萌发机理研宄，并为其他植物组织内源激素检测提供参考。
【附图说明】
[0006] 图1为本发明的工艺流程图。
[0007] 图2为本发明的玉米胚根鞘样品采集示意图。
【具体实施方式】
[0008] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
[0009] 如图1、图2所不，本发明基于GC-MS内标法，米用"横竖剥+浸提+固相萃取+ Agilent DB-17ms"技术组合提高玉米胚根鞘中8种内源激素（GApGA3、GA4、IAA、JA、DHJA、 cis-ABA和trans-ABA)检测效率和精准度。本发明涉及的玉米胚根鞘内源激素检测工艺包 括样品采集作业、样品浸提作业、纯化与富集作业、GC-MS/S頂检测作业、后处理等工序。 [0010] 本发明涉及的玉米胚根鞘内源激素检测工艺【具体实施方式】如下。
[0011] (1)样品采集作业：对玉米种子进行卷纸发芽，在采样时间点将萌发中的玉米种子 取出，使用医用手术刀片在体式镜下采用"横竖剥"法采集胚根鞘组织样品。
[0012] (2)样品浸提作业：采用80%甲醇(冷）浸提，萃取内源激素共8个步骤。分别为： ?研磨提取：样品(鲜重0. 2-0. 5g)置洁净预冷的研钵中，加少量石英砂、极少量PVPP (1-3 个小晶粒)和液氮，研磨，加入少许80 %甲醇(冰)，冰浴研磨至匀浆，用小玻棒将匀浆液转入 100mL烧杯中，并用80 %甲醇(冰)充分清洗研钵上的植物残留样品至烧杯中，以避免提取液 流失；IM氏温静置：将装有匀浆液的小烧杯连同插在其中的小玻棒用铝箔纸封口后，置4°C 冰箱中静置12_24h，让激素充分渗出。注：烧杯上贴上标签防止样品混杂；③注入内标：用 IOOul微量进样器向盛有样品的烧杯中注入相应定量的激素内标，在内标更换时，需将进样 器反复吸打甲醇入废液缸30遍以上，注内标时需快速，以防针尖吸附内标小液滴，同时避 免将激素内标打到烧杯壁上，影响测定结果。最后用插在烧杯中的小玻棒将提取液及激素 内标搅匀；S抽滤：安装好抽滤装置，打开抽气泵工作开关，在布氏漏斗中垫入相同规格的 滤纸1-2层，用80%甲醇封边，将烧杯中的提取液倒在滤纸中部，避免碰到漏斗壁，用80% 甲醇清洗烧杯3-5遍，清洗液也倒在滤纸中部。此外，用80%甲醇滴洗滤纸中的样品残渣 若干次。充分抽滤后，先将皮管从抽滤瓶上拔下，后关电源，避免杂质入管进入抽滤瓶污染 抽滤液，最后弃残渣；⑤浓缩至水相：将滤液倒入鸡心瓶中（鸡心瓶口贴上标签防止样品混 杂)，用80%甲醇清洗抽滤瓶3遍并将清洗液也倒入鸡心瓶，然后在鸡心瓶中加入1滴浓氨 水，以促进酸性离子进入水相。打开真空泵，将盛有滤液的鸡心瓶安装在旋蒸仪上，调整鸡 心瓶使瓶底与水浴锅液面接触(水温不超过40°C，以避免鸡心瓶内液体沸腾，影响浓缩)，设 定旋转速度后开始减压浓缩，当冷凝管中液滴下降速度变慢或鸡心瓶内液体体积降为原体 积的1/3-1/5时则表明甲醇已排净。浓缩结束后将鸡心瓶内液体移入IOml具塞玻璃试管中 (试管中上部贴上标签防止样品混杂)，并取少量超纯水将鸡心瓶内壁充分清洗，清洗液也 倒入同一试管中，但试管内最终溶液体积应小于5ml，以方便后期配平离心；:1;冻融除杂： 将装有浓缩液的试管在_20°C条件下反复冻融3-5次，使液体中杂质充分冻融出来，结冻时 间长短不影响检测结果。解冻时将试管放在低于40°C的温水或室温自来水中，解冻温度不 能太高，避免造成试管破裂以及影响激素溶解效果。注：判断甲醇是否已除干净：取出已结 冻的试管，打横观察，如果最顶端无流动液体则表明甲醇已除干净，否则需重新浓缩；离 心取上清：向冻融处理后的试管中加入少量PVPP，充分摇勾，静置10_20min，以充分去除色 素、酚类等物质。利用空的具塞玻璃试管加超纯水与样品试管配平，然后低温或室温离心 20-30min (3000r/min);I；:萃取浓缩：离心完毕，将上清液用玻璃吸管吸出或直接缓慢倒入 至新的试管中（转移中避免带入试管底部杂质），然后用2M HCl调上清液pH值至2. 5-3. 0。 用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相至鸡心瓶中，冷冻处理，水相与有机相分层(鸡 心瓶底会存在少量水相)，用玻璃吸管插至水相，将其吸除，然后向鸡心瓶加1滴浓氨水，利 用旋蒸仪水浴浓缩至干（35 °C -40 °C)。
[0013] (3)纯化与富集作业：采用固相萃取柱S印-Pak C18柱纯化富集样品共9个步骤。 分别为试剂准备：准备〇. IM HAC(乙酸)、甲醇、17%甲醇（甲醇：0.1 M HAC=17 :83)、40% 甲醇（甲醇：0.1 M HAC=40 :60)、60