一种富集唾液酸化糖肽、唾液酸化聚糖或唾液酸化糖苷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种富集唾液酸化糖肽、唾液酸化聚糖或唾液酸化糖苷的方法。
【背景技术】
[0002] 唾液酸是一类极其重要的神经氨酸衍生物，它通常连接在聚糖的末端，是聚糖结 构和功能多样化的重要物质基础之一，广泛参与信号分子的靶向传递，如配体/受体、抗原 /抗体、以及酶/底物的靶向识别与黏附，异常的唾液酸化聚糖会导致疾病的发生、发展。研 究表明，异常生理状态(如脑部发育异常、癌症发生转移、病毒感染、心律失常等）与体内一 些分子的唾液酸化聚糖水平异常密切相关。唾液酸化糖蛋白是目前研究较为普遍的一类生 物分子，精确地表征此类分子中唾液酸化糖肽水平的变化对于发现预测疾病进展标志物以 及对疾病的预后评估具有重要意义。但是，由于此类分子普遍具有高度的结构复杂性、低丰 度、且不稳定的特点，使得对其进行精确的结构表征仍是一项尚未解决的技术难题。目前， 对唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液酸化糖苷进行富集分离是进行其含有水平 及其结构研究的关键一步。
[0003] 凝集素亲和色谱法是目前应用于唾液酸化糖肽富集的主要方法。利用特定凝集素 (如接骨木凝集素、怀槐凝集素等）可对带有特异性唾液酸化糖链的唾液酸化糖肽或蛋白进 行富集分离。但是，每种凝集素只针对一种特定类型的唾液酸化糖链，且该方法所用材料价 格昂贵，并不适用高通量的唾液酸化糖蛋白的结构研究。血清素耦合硅胶材料可被用于固 相萃取从而对唾液酸化糖肽有一定的富集作用，但该方法伴随着对非唾液酸化糖肽和/或 非唾液酸化聚糖的富集。强阳离子色谱及两性离子型亲水相互作用液相色谱被证明可被广 泛用于多种唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖的富集分离，但其繁琐的操作过程会造成唾 液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖的水解，且引入了大量无机盐离子，增加了后续糖链分析 的难度，此外该方法的特异性差。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种富集唾液酸化糖肽、唾液酸化聚糖或唾液酸化糖苷的方 法。
[0005] 本发明要求保护毛白杨杨絮在富集唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液 酸化糖苷中的应用。
[0006] 本发明还要求保护毛白杨杨絮在制备用于富集唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚 糖和/或唾液酸化糖苷的柱填料中的应用。
[0007] 本发明还要求保护毛白杨杨絮作为富集唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或 唾液酸化糖苷的柱填料的应用。
[0008] 本发明还保护一种富集唾液酸化糖肽的方法，包括如下步骤：
[0009] (1)将毛白杨杨絮填充至柱容器内，得到Popcat柱；
[0010] (2)采用所述Popcat柱从唾液酸化糖蛋白的酶切产物中富集唾液酸化糖肽。
[0011] 所述酶切产物是将唾液酸化糖蛋白进行单酶切或双酶切得到的产物。所述酶切产 物优选为将唾液酸化糖蛋白进行单酶切得到的产物。所述单酶切具体可为胰酶酶切，所述 双酶切具体可为胰酶和蛋白酶K酶切。
[0012] 在进行所述方法前，可按如下方法预处理毛白杨杨絮：洗涤并烘干。所述洗涤的具 体方法为：用40%-70%(优选50%)乙腈水溶液超声洗涤(超声参数具体可为20KHZ，10-20S)。
[0013] 所述步骤（1)和所述步骤（2)之间还可包括如下步骤甲：用70%_90% (优选80%) 乙腈水溶液洗漆所述Popcat柱。
[0014] 所述步骤（1)和所述步骤（2)之间，所述步骤甲之后，还可包括如下步骤乙：依次 用去离子水、乙腈和80%乙腈水溶液洗涤所述Popcat柱。
[0015] 所述步骤（2)具体如下：①将所述唾液酸化糖蛋白的酶切产物上样；②完成步骤 ①后，依次用水和5mM碳酸氢铵水溶液洗脱并收集流出液，即为富含唾液酸化糖肽的溶液。
[0016] 所述步骤①和所述步骤②之间还可包括如下步骤丙：用70%_90% (优选80%)乙腈 水溶液洗涤。
[0017] 所述柱容器具体可为最大上样体积为200 μ L的Tip。
[0018] 当采用最大上样体积为200μ L的Tip作为柱容器时，毛白杨杨絮的填充量可 为3mg，步骤乙中可依次用50 μ L去离子水、50 μ L乙腈和50 μ L80%乙腈水溶液洗涤所述 Popcat柱，步骤丙中可依次用80 μ L80%乙腈水溶液和80 μ L80%乙腈水溶液洗涤，步骤② 中，可依次用30μ L去离子水和50μ L5mM碳酸氢铵水溶液洗脱并将流出液合并，即为富含 唾液酸化糖肽的溶液。
[0019] 本发明还保护一种用于富集唾液酸化糖肽的试剂盒，包括毛白杨杨絮和5mM碳酸 氢铵水溶液。所述试剂盒还可包括胰酶和/或蛋白酶K。所述试剂盒还可包括70%-90%(优 选80%)乙腈水溶液。所述试剂盒还可包括40%-70% (优选50%)乙腈水溶液。所述试剂盒 还可包括柱容器，如Tip。
[0020] 所述毛白杨杨絮的直径范围为6-8 μ m。
[0021] 所述唾液酸化糖蛋白具体可为牛胎球蛋白。
[0022] 本发明发现毛白杨杨絮对唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液酸化糖苷 具有很好的富集效果，富集产物纯度接近100%，回收率100%。本发明提供的方法中，采用温 和的洗脱液洗脱目标物，与其它洗脱液（25%ΝΗ 3 ·Η20水溶液或0. 2%甲酸水溶液）相比，以及 与其他富集方法(二氧化钛富集，石墨碳/活性炭富集)相比，本发明提供的方法中条件温和 (降低了唾液酸化糖肽结构中唾液酸的解离风险)、柱填料成本低廉、特异性高，富集效果显 著。采用本发明提供的方法进行所述富集，可以保持唾液酸化糖链和或聚糖的结构信息，保 留完整的特定肽段信息，有利于后续的质谱分析，反映了蛋白质天然的糖基化状态，对临床 诊断标志物和疾病机制研究具有重要意义。
【附图说明】
[0023] 图1为实施例1中的质谱图谱，其中质/荷是指分子质量与电荷数之比。
[0024] 图2为代表性唾液酸化糖肽的串联质谱图，其中质/荷是指分子质量与电荷数之 比。
[0025] 图3为杨絮与脱脂棉在表面扫描电子显微镜下的形态的对比图。
[0026] 图4为杨絮与脱脂棉表面成分傅立叶变换红外吸收光谱的对比图。
[0027] 图5为杨絮与脱脂棉疏水性考察及Miule /Wiesner组织学染色对比；" + "代表阳 性结果，代表阴性结果。
[0028] 图6为二氧杂环乙烷分步萃取法萃取提纯杨絮木质素、半纤维素、及纤维素成分 的实验流程。
[0029] 图7为傅里叶变换红外吸收光谱对比图；A:萃取木质素与杨絮表面成分傅里叶变 换红外吸收光谱对比图；B ;分步萃取半纤维素傅立叶变换红外吸收光谱对比图；C :萃取纤 维素与脱脂棉表面成分傅立叶变换红外吸收光谱对比图。
[0030] 图8为杨絮结构成分示意图。
[0031] 图9为杨絮唾液酸化糖肽特异性富集有效成分的考察；a :去木质素杨絮的Miiule /Wiesner组织学染色对比；b :杨絮去木质素处理不同时间后对唾液酸化糖肽特异性富集 效能；菱形表示两质谱峰之间相差一个唾液酸化残基（291Da);其中质/荷是指分子质量与 电荷数之比。
【具体实施方式】
[0032] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的试验结果，均设置三次重复实验，结果取平 均值。唾液酸化糖肽即唾液酸化糖蛋白酶切后得到的具有唾液酸化糖链的多肽片段。以下 实施例中的"％"，如无特殊说明，均代表体积百分含量。
[0033] 本发明的发明人在长期试验过程中，发现以毛白杨杨絮(简称杨絮）作为分离固定 相制备的P〇pcat-tip层析柱可以高效、特异、温和地分离富集唾液酸化糖肽。
[0034] 牛胎球蛋白（高唾液酸化糖蛋白质）：购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号： F3004。移液器吸头（Tip)(最大上样体积为200yL):购自Axygen Scientific公司， 产品目录号：T-200-Y。碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、乙腈、甲酸、三氟乙酸均购自 Sigma-Aldrich 公司，产品目录号依次为 A6141、150460、16125、14261、14265、302031。石墨 碳(粒度范围为5-8 μ m)、活性碳(粒度范围为3-5 μ m)均购自Sigma-Aldrich公司，产品目 录号依次为332461和C2889。胰酶：购自Ro