一种编码β-葡萄糖苷酶的基因bglG及其应用的制作方法

一种编码β-葡萄糖苷酶的基因bglG及其应用的制作方法
【专利摘要】一种编码β-葡萄糖苷酶的基因bglG，其核苷酸序列如序列表No.1所示；氨基酸残基的序列如序列表No.2所示。序列表No.1中的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到1407个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个完整的ORF，自5’端的第1-3位核苷酸为bglG基因的起始密码子ATG，自5’端的第1405-1407位核苷酸为bglG基因的终止密码子TAA。本发明所述的编码β-葡萄糖苷酶的基因bglG在生产烷基葡萄糖苷方面有重要的意义和广泛的用途。
【专利说明】—种编码β -葡萄糖苷酶的基因bgIG及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种编码β-葡萄糖苷酶的基因bglG及其应用。
【背景技术】
[0002]烷基葡萄糖苷是一种具有重要应用价值的非离子表面活性剂，具有生物降解彻底、无毒和无刺激特性，作为主活性物广泛用于洗涤、乳化、增溶、保湿等功能制品。烷基葡萄糖苷可以通过化学法或生物酶法合成，工业化生产的烷基葡萄糖苷主要采用化学法合成。化学法主要有Koenings-Khorr反应制备法，乙酰化醇解法，糖的缩酮物醇解法以及直接糖苷法和转糖苷法等。其中化学法合成生产烷基葡萄糖苷主要采用应用直接糖苷化法和双醇交换法。目前国内已有辽宁鞍山化工一厂和江苏南京梅山化工总厂等厂家采用化学法小规模生产烷基葡萄糖苷，但是在产品的色泽、气味等指标上与国外产品有较大差距，难以和国外厂商竞争，因而目前国内使用的烷基葡萄糖苷主要是从国外进口，用于高档洗涤用品。并且，传统上的化学合成法成本高，工艺复杂，易造成环境污染，存在产物纯度低和立体专一性问题。研究与开发酶法生物合成烷基葡萄糖苷，具有反应条件温和、工艺简单的优点，可以解决产物纯度低和立体专一性问题。因此，作为酶法生物合成烷基葡萄糖苷的β-葡萄糖苷酶，对其研究也就受到了广泛的重视。
[0003]β -葡萄糖苷酶(beta-glucosidase, Bgl, EC3.2.1.21),是一类糖基水解酶,广泛地存在于自然界的细菌、真菌和动植物组织等中发挥其生理生化功能。β-葡萄糖苷酶可以通过缩合反应和葡萄糖基转移作用合成烷基葡萄糖苷。在缩合反应途径中，β_葡萄糖苷酶催化一个分子的单糖与一个分子的醇反应生成一个分子的烷基葡萄糖苷和一个分子的水，而在葡萄糖基转移作用途径中，其催化一个分子的二糖与一个分子的醇反应生成一个分子的烷基葡萄糖苷和一个分子的单糖。20世纪90年代以来，有不少学者尝试利用不同来源的β -葡萄糖苷酶生物合成烷基 葡萄糖苷。例如Smaali等通过β -葡萄糖苷酶的葡萄糖基转移作用，以300mg/mL的纤维二糖为供体，与受体己醇反应30h后，可以生成18.3mM的己基葡萄糖苷(Hexyl glucoside)。Fischer等比较了市售的杏仁β -葡萄糖苷酶的反向水解反应和葡萄糖基转移作用:以纤维二糖为供体，通过葡萄糖基转移作用，烷基葡萄糖苷的产量达到44.9% (V/V)，而以葡萄糖为供体，通过反向水解反应，烷基葡萄糖苷的产量为
11.3%(V/V)等。
[0004]根据葡萄糖苷酶在细胞中的存在位置，可以分为胞内葡萄糖苷酶和胞外 葡萄糖苷酶，物种不同，葡萄糖苷酶存在位置也有所不同。在细菌中，基因一般多为
单拷贝。不同来源的葡萄糖苷酶都遵循双取代的反应机制:首先葡萄糖苷酶与底物结合形成米氏复合物；其次，葡萄糖苷酶的活性中心通过变构效应与底物紧密结合，实现了 β -葡萄糖苷酶的底物专一性，酶的亲核基团通过酸催化机制进攻异头碳，即形成共价酶与底物中间体；最后水分子按照碱催化机制进攻异头碳，酶恢复到初始质子化态，生成相应产物。
[0005]β -葡萄糖苷酶生物合成烷基葡萄糖苷需在水/醇两相系统中进行，醇既作为溶剂，又作为反应受体。醇浓度越高，越有利于反应向产物(烷基葡萄糖苷)方向进行。而β-葡萄糖苷酶的活性需要一定水相来维持，醇浓度越高，β-葡萄糖苷酶活性越低。现有研究表明β-葡萄糖苷酶在水/醇两相系统中的转化效率是限制其工业化生产的一个关键问题。因此，筛选新型β -葡萄糖苷酶，并研究其在水/醇两相系统中高效合成烷基葡萄糖苷能力已经成为当前研究的一个热点。
[0006]目前认为限制β-葡萄糖苷酶催化反应的主要问题还在于酶的催化效率、成本以及产物提取分离困难等。尤其是β_葡萄糖苷酶在对强有机溶剂的耐受性方面，该酶的合成效率较低，虽然可用固定化和基因工程技术等改进β-葡萄糖苷酶在有机溶剂中的稳定性，来提高反应效率，但是改善的程度也是十分有限，且耗时耗力耗资。所以，从自然环境中筛选高效产葡萄糖苷酶的菌种显得非常重要。获得编码葡萄糖苷酶的新基因，不仅可以研发新的生物生产工艺提高烷基葡萄糖苷产量，也可以为构建高产葡萄糖苷酶的基因工程菌提供新的理论依据和参考模式。

【发明内容】

[0007]本发明的目的是提供一种编码β_葡萄糖苷酶的基因bglG及其应用。通过构建DNA文库，采用酶的底物活性筛选策略，从基因文库里面分离得到了编码β -葡萄糖苷酶的新基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产葡萄糖苷酶，对于研发新的生物工艺大量生产烷基葡萄糖苷具有重要的意义和广泛的用途。
[0008]本发明所提供的一种编码β -葡萄糖苷酶的基因，名称为bglG，来源于本实验室从广西南宁市某污染环境中筛选分离得到的微小杆菌Exiguobacterium sp.GXG2，具有下列核苷酸序列之一:
[0009]I) 一种编码β -葡萄糖苷酶的基因bglG，其核苷酸序列为序列表N0.1所示。
[0010]2)所述基因编码的蛋 白质，其氣基酸序列如序列表N0.2所不。
[0011]携带该基因的质粒E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，分类命名为大肠埃希氏菌Escher i ch i a Co I i，编号为CGMCCN0.7829，保存日期为2013年6月28日，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0012]序列表N0.1的DNA是克隆重组质粒pETBG所含的外源DNA片段中携带的完整开放阅读框架(0RF，Open Reading Frame)，该ORF由1407个碱基组成，GC含量为50.25%。为一个可能完整的新型葡萄糖苷酶基因，新基因被命名为bglG。从5’端第I个核苷酸开始起始密码子ATG到1407个碱基以终止密码子TAA结束，为一个完整的0RF，自5’端的第1-3位核苷酸为bglG基因的起始密码子ATG，自5’端的第1405-1407位核苷酸为bglG基因的终止密码子TAA。该ORF—共1407个核苷酸可编码由468个氨基酸组成的蛋白。通过Blastx分析该氨基酸序列和来自于菌株“Bacillus megaterium WSH-002(巨大芽抱杆菌 WSH-002)、Exiguobacterium sp.S17 (微小杆菌 S17)和 Exiguobacteriumsp.ATlb (ATlb)” 的 “glycosyl hydrolase family protein (糖苷水解酶家族蛋白)、aryl-phospho-β -D-glucosidase (乙酸憐酸化-β-D-葡萄糖苷酶)和 β-glucosidase(β -葡萄糖苷酶)”基因(全基因组测序结果，暂未见有关其功能注释的报道)存在最高的87%—致性，其余一致性均在74%以下。
[0013]本发明提供的一种编码β -葡萄糖苷酶的基因的克隆方法包括下列步骤:[0014](I)从本课题组提取微小杆菌Exiguobacterium sp.GXG2基因组DNA,构建DNA文库；
[0015](2)基于底物活性的筛选策略，从DNA文库中分离含有葡萄糖苷酶活性的克隆。
[0016]本发明提供的编码葡萄糖苷酶的新基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产β_葡萄糖苷酶，在构建新的生物工艺生产烷基葡萄糖苷方面具有广泛的用途。
【专利附图】

【附图说明】
[0017]图1 为微小杆菌 Exiguobacterium sp.GXG2 基因组 DNA。
[0018]图2为DNA文库克隆的限制性内切酶EcoRI和PstI酶切分析以判断文库质量。
[0019]图3为原始克隆pGEMBO的酶切检测结果。
[0020]图4为bglG基因DNA序列以及编码产物分析图。
[0021]图5为重组表达克隆E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG的构建检测分析。
[0022]图6为携带bglG基因的重组质粒pETBG的DNA转化大肠杆菌E.coliTuner (DE3)PLacI后得到的重组表达克隆的蛋白的SDS-PAGE分析结果。
[0023]图7为不同温度对BglG重组蛋白的酶活影响。
[0024]图8为不同pH值对BglG重组蛋白的酶活影响。
[0025]图9为薄层层析技术分析甲基葡萄糖苷和正辛基葡萄糖苷的合成。
【具体实施方式】
[0026]在本发明的实施例中所用到的主要材料包括:EcoRI限制性内切酶、PstI限制性内切酶、T4DNA连接酶、pGEM-3Zf (+)载体购自Promega公司，胰蛋白胨、p_NPG(英文全称:p-nitrophenyl- β -D-glucopyranoside)购自上海生物工程有限公司。
[0027]实施例1
[0028]一种编码β -葡萄糖苷酶的基因bglG的克隆；主要包括下述步骤1、2、3、4、5。
[0029]步骤1:从微小杆菌Exiguobacterium sp.GXG2中提取基因组DNA,采用BioFlux公司的Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒，详细的方法步骤描述如下。
[0030](1)收集适当的微小杆菌Exiguobacterium sp.GXG2菌液,通过离心尽可能地去除
上清液。
[0031](2)向菌体中加入100 μ L EL Buffer (EL缓冲液)，并用枪头吹打混匀。
[0032](3)将其放入37°C中进行温育40min (革兰氏阳性菌适当延长时间)。
[0033](4)向其中加入 RS Buffer (RS 缓冲液)100 μ L 和 PK Solution (PK 溶液)10 μ L并彻底混匀，然后再加入20mg/mL的RNase A (RNA溶解酶)2 μ L并混匀。
[0034](5)将其在 56°C中放置 15min。
[0035](6)向其中加入GA Buffer (GA缓冲液)200 μ L并进行混匀。
[0036](7)在12000Xg条件下进行离心lmin。
[0037](8)取一个新的1.5mL离心管，将上清液移入其中。
[0038](9)向其中加入BA Buffer (BA缓冲液)400 μ L并进行混匀。
[0039](10)取出离心柱，并将混合液移入其中，在10000Xg条件下进行离心lmin，并去除接液管的液体。
[0040](11)再将G Binding Buffer (G结合缓冲液)500 μ L加入离心柱中，在10000 X g条件下进行离心30s，然后去除接液管液体。
[0041](12)将Wash Buffer (洗脱缓冲液)500 μ L加入离心柱中，在10000X g条件下进行离心30s,然后去除接液管液体。
[0042]( 13)把12.的操作再重复一次。
[0043](14)再把离心柱在10000 Xg条件下进行离心lmin，然后取一个新的1.5mL离心
管，并将离心柱转至其中 。
[0044](15)将IOOyL Elution Buffer (洗涤缓冲液)加入到离心柱中，并在室温下放置Imin0
[0045](16)将其在12000Xg条件下进行离心lmin，离心管中即是DNA溶液，丢弃离心柱。
[0046](17)将DNA溶液放置于-20°C保存。
[0047]步骤2:采用BioFlux公司的Biospin胶回收试剂盒回收3_10kb的酶切后基因组DNA，详细的方法步骤描述如下。
[0048](I)首先用干净的刀片，将含有目的DNA片段琼脂糖凝胶进行切割，放进离心管中。
[0049](2)向离心管中加入提取缓冲液，加入的提取缓冲液的微升体积:切下来的凝胶质量毫克数=3: I。
[0050](3)将其放入50°C水浴锅中进行温育大约15min。
[0051](4)向其中加入异丙醇，加入异丙醇的微升体积:切下来的凝胶质量毫克数=1: I。
[0052](5)取出离心柱，将液体移入其中，在6000rpm条件下离心lmin，并倒掉接液管中液体。
[0053](6)将提取缓冲液500 μ L加入离心柱中，在12000rpm条件下进行离心lmin，并倒
掉接液管中的液体。
[0054](7)将洗脱缓冲液750 μ L加入离心柱中，并在12000rpm条件下进行离心lmin，并
倒掉接液管中的液体。
[0055](8)再在12000rpm条件下将离心柱离心lmin，然后把离心柱转移到新的离心管中。
[0056](9)把梯度淋洗缓冲液或者蒸馏水40-60 μ L加入到离心柱中，并放置l_2min。
(10)把离心柱于12000rpm条件下进行Imin离心，丢掉离心柱，离心管中的液体即是DNA溶液，放于零下20°C进行保存。
[0057]对照图1。在实施主要步骤I和2中，其中泳道I为λ/HindIII标准样，片段大小从大到小依次为:23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb ;泳道2为微小杆菌Exiguobacterium sp.GXG2 基因组 DNA,跑样量为 3 μ L。
[0058]步骤3:微小杆菌 Exiguobacterium sp.GXG2DNA 文库的构建。
[0059]首先采用BioFlux公司的Biospin质粒DNA小量提取试剂盒提取克隆载体pGEM-3Zf(+)质粒DNA，获得较高纯度质粒DNA，其主要形式是超螺旋CCC，经过EcoRI和PstI酶双酶切，变为线性DNA分子，直接用来连接部分酶切微小杆菌Exiguobacteriumsp.GXG2 基因组 DNA。
[0060]用EcoRI和PstI对纯化好的微小杆菌Exiguobacterium sp.GXG2基因组DNA进行部分酶切，琼脂糖电泳分离酶切产物，将这些片段与pGEM-3Zf(+) DNA连接，连接产物用化学转化方法导入大肠杆菌DH5 α ,在含有X-gal、IPTG、氨节青霉素的Luria-Bertani固体平板上检测含有重组子的白色大肠杆菌菌落。X_gal、IPTG、氨苄青霉素的浓度分别为:40μ g/mL、40 μ g/mL、50 μ g/mL。
[0061]将阳性单菌落挑板至含有50 μ g/mL氨节青霉素的加有七叶苷的Luria-Bertani固体平板上，37°C培养至菌落为2-3mm后，再次挑板，将转化子挑取到文库保存培养基于96孔培养板孔中，37°C恒温培养24h左右，然后保存于_80°C低温冰箱中。最终得到了 10080个左右的白色克隆。随机挑取11个转化子提取质粒，然后用EcoRl和Pstl双酶切检测，发现8个有随机插入的外源DNA片段，理论平均长度为3.0kb左右。
[0062]对照图2，其中，泳道I和15为Ikb ladder标准样，片段大小从大到小依次为:
10.0kb, 8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb，3.0kb, 2.5kb, 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb，750bp，500bp, 250bp ;泳道2和14为经过EcoRI和PstI酶切的pGEM_3Zf (+)质粒DNA ;其它泳道
3-13分别为文库克隆质粒DNA经过EcoRI和PstI酶切以后的分析结果。
[0063]步骤4:从DNA文库中分离筛选表达β -葡萄糖苷酶活性的克隆。 [0064]采用底物活性分离筛选方法，在含有七叶苷的Luria-Bertani固体平板上进行点板，有黑色圈形成的菌落即为阳性克隆。得到一个编号为pGEMBO的阳性克隆，携带一个可能的编码β_葡萄糖苷酶的基因。电泳检测结果表明，PGEMBO克隆所携带的外源DNA片段大小为6.5kb。
[0065]对照图3。其中，泳道I为Ikb ladder标准样,片段大小从大到小依次为:10.0kb,8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb，3.0kb, 2.5kb, 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp,250bp ;泳道2为经过EcoRI和PstI酶切的pGEM_3Zf (+)质粒DNA ;泳道3_5为EcoRI和PstI酶切阳性克隆pGEMBO质粒DNA的结果。
[0066]步骤5:重组质粒E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG上表达β -葡萄糖苷酶活性的基因的测序和开放阅读框ORF分析。
[0067]用软件DNAStar对直接测序所得到的序列进行拼接,用NCBI (National Centerfor Biotechnology Information, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)上的软件对DNA序列进行分析，如 ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), Blast (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)。
[0068]对照图4，外源DNA片段中携带的可能的编码β -葡萄糖苷酶的新基因大小为1407bp。从5’端第I个核苷酸开始起始密码子ATG到1407个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个最有可能的完整的0RF，自5’端的第1-3位核苷酸为bglG基因的起始密码子ATG，自5’端的第1405-1407位核苷酸为bglG基因的终止密码子TAA。经过Blastn软件比较，目标ORF序列在DNA水平上只能与Exiguobacterium sp.ATlb (微小杆菌ATlb)的全基因组序列能匹配上。表达葡萄糖苷酶活性的基因bglG编码一个含468个氨基酸的蛋白质，用简单组件结构研究工具(英文名称:Simple Modular Architecture Research Tool,SMART, http://smart, embl-heidelberg.de)分析，由DNA序列推测的表达β -葡萄糖苷酶活性的BglG蛋白组件结构，发现一个可能的独立催化区域功能结构，该催化结构域由第I个氨基酸开始，到第466个氨基酸结束。编码目标蛋白的基因一共包含1404个核苷酸，编码一个由468个氨基酸组成的多肽，用Blastp分析该ORF氨基酸序列，发现该氨基酸序列和来自于菌株 “Bacillus megaterium WSH-002 (巨大芽抱杆菌 WSH-002)、Exiguobacteriumsp.S17 (微小杆菌 S17)和 Exiguobacterium sp.ATlb (微小杆菌 ATlb))” 的 “glycosylhydrolase family protein (糖基水解酶家族蛋白)、&^111108口110-0-0-8111(308丨(1386 (芳香磷酸化-β-D-葡萄糖苷酶)和β-glucosidase ( β -葡萄糖苷酶)”基因(全基因组测序结果，暂未见有关其功能注释的报道)存在最高的87%—致性，其余比较蛋白的一致性均在74%以下。
[0069]该氨基酸序列编码的唯一保守性假定蛋白没有明显的亲疏水性，没有形成明显的跨膜结构区域，也不存在低复杂度结构。ExPASy网站相关软件分析bglG基因编码的产物的理论等电点/分子量为:5.06/53.1kDa0
[0070]对照图4，bglG基因DNA序列以及目标ORF所编码的氨基酸序列分析。
[0071]实施例2
[0072]bglG基因重组表达质粒的构建。
[0073]利用美国Novagen公司提供的质粒pETBlue_2作为表达载体和E.coliTuner (DE3)pLac?作为宿主细胞进行目标基因的异源高效表达；设计正向引物FMl:5’_CCGGAATTCTATGAAAATGCCAAAAGATTT-3 ’ (加下划线部分为EcoRI酶切位点);设计反向引物FM2:5’ -TAACTGCAGTAGTTCAGCAGCACGTGTCG-3’(加下划线部分为 PstI 酶切位点)，扩增目标 0RF，一共1404个核苷酸。将PCR产物与pETBlue-2载体连接后转化大肠杆菌DH5a并在含X-gal和IPTG的Luria-Bertani固体平板上筛选正确的阳性克隆，将包含重组表达质粒DNA的大肠杆菌细胞命名为pETBG。将pETBG质粒转化至Ε.coli Tuner (DE3) pLacI得菌株Tuner(DE3)pLacI/pETBG。
[0074]重组质粒E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG已在中国普通微生物菌种保藏管理中心完成微生物保存，CGMCC N0.7829，保存日期为2013年6月28日。
[0075]实施例2请参见图5。图5为重组质粒E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG的构建检测结果。泳道I为Ikb ladder标准样,片段大小从大到小依次为:10.0kb, 8.0kb, 6.0kb,5.0kb, 4.0kb, 3.5kb, 3.0kb, 2.5kb, 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp ;泳道 2 为质粒pETBlue-2限制性内切酶EcoRI和PstI酶切后检测结果，跑样量为3 μ L ;泳道3:使用限制性内切酶EcoRI和PstI酶切Ε.coli Tuner (DE3) pLacI/pETBG之后的质粒DNA检测结果，跑样量为3 μ L。
[0076]实施例3
[0077]BglG目标蛋白在大肠杆囷系统中的诱导表达和纯化。
[0078]将已被验证正确的具有活力的重组大肠杆菌转接于IOmL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，培养10-15h。从IOmL LB菌液中取2_3mL加入到盛有200mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基的500mL的三角瓶中，37°C，220rpm振荡培养。2_3h后取出ImL菌液测定0D_，当OD6tltl到0.4-0.6的时候加入IPTG至终浓度为0.8mmo/L, 20°C、220rpm振荡培养6h后，制备粗酶液；采用QIAGEN公司的N1-NTA琼脂糖金属镍亲和层析介质Sepharose CL-6B对重组蛋白进行分离纯化。对制备的对照样品以及分离纯化的目标蛋白进行SDS-PAGE蛋白表达检测。[0079]实施例3请参见图6。图6为重组质粒pETBG所携带bglG基因转化大肠杆菌E.coli Tuner (DE3)pLacI后得到的重组表达克隆的SDS-PAGE分析结果。泳道5和10为蛋白质标准样品带，自上而下大小依次为:116.0kDa, 66.0kDa, 45kDa, 35kDa, 25.0kDa, 18.8kDa ;泳道1-4和泳道6-9为采用镍柱亲和层析技术分离纯化得到的BglG蛋白检测结果，跑样量为5 μ L0
[0080]实施例4
[0081]不同温度和不同pH条件对β -葡萄糖苷酶的酶活影响。
[0082]从20°C到65°C，设置不同的实验温度条件，测定不同温度下重组蛋白BglG的酶活。使用的分析仪器有:Switzerland TECAN集团公司U Quamt TM酶标仪,在410nm波长处监测OD值的变化。
[0083]结果请参见图7，结果发现在35°C时目标蛋白具有最闻的酶活。
[0084]在其它条件相同的情况下设置不同pH值(4.0,5.0,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5、9.0,9.5、10.0)，测定不同pH值下重组蛋白BglG的酶活。
[0085]结果请参见图8，结果显示pH值为7.0的目标蛋白具有最高的酶活。
[0086]实施例5
[0087]薄层层析技术分析甲基葡萄糖苷和正辛基葡萄糖苷的酶法合成。
[0088]酶法合成反应体系为5mL。体系包括:lmL的IOmM的纤维二糖，加入10% -40%的甲醇或正辛醇，又加入500微`克左右的BglG重组蛋白，其余的补充0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.0)至5mL。反应在40°C摇动6h后加入3mL冰醋酸停止反应，将反应管置于乙醇浴2min，零下20°C下过夜静置后，离心后用于薄层层析。
[0089]离心后的反应产物经Silica gel60F254招板点样后,两种展开剂分别将其展开后喷上加有2% H2SO4的乙醇，放于烘箱中，在120°C下加热20min后取出观察结果。展开剂I为:乙酸乙酯:甲醇:水=14:5:1 ;展开剂2为:2_丙醇:乙醇:水=6:2:2。
[0090]结果请参见图9，表明合成体系中有甲基糖苷或正辛基糖苷的生成。泳道1-4:标样依次是葡萄糖，纤维二糖，甲基_β -D-吡喃葡萄糖苷，η-辛基-β -D-吡喃葡萄糖苷；泳道5和6 =BglG重组蛋白催化合成的甲基葡萄糖苷；泳道7和8 =BglG重组蛋白催化合成的正辛基葡萄糖苷。
[0091]含有本发明基因的启动子、开放阅读框及其部分序列的表达载体、细胞系以及产物烷基葡萄糖苷的酶法合成等均属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种编码β-葡萄糖苷酶的基因bglG，其特征在于，其核苷酸序列为序列表N0.1所/Jn ο
2.根据权利要求1所述的编码葡萄糖苷酶的基因bglG，其特征在于，其核苷酸序列从5’端第I个核苷酸开始起始密码子ATG到1407个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个完整的开放阅读框架1-1407，自5’端的第1-3位核苷酸为bglG基因的起始密码子ATG，自5’端的第1405-1407位核苷酸为bglG基因的终止密码子TAA。
3.权利要求1所述基因所编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如序列表N0.2所/Jn ο
4.权利要求3所述`的蛋白质在制备烷基葡萄糖苷中的应用。
【文档编号】C12N15/56GK103525844SQ201310450366
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】蒋承建, 古恒森, 曾蓉, 陈高, 黄琴, 申佩弘, 武波 申请人:广西大学