一种几丁聚糖酶解方法
【专利摘要】本发明公开了一种几丁聚糖酶解方法，包括如下步骤：将蟹壳或虾壳干燥、粉碎；酶解脱钙和脱蛋白；酶解脱乙酰、水洗干燥粉碎即得。本发明的酶解工艺与现有技术制相比，脱钙与脱蛋白在同一步骤中实现，大大提高生产效率，无须使用强酸和强碱，耗能低，无污染，更加环保。
【专利说明】一种几丁聚糖酶解方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及几丁聚糖制备方法，属于制造领域。
【背景技术】
[0002] 甲壳素是一种天然含氮多糖物质，广泛存在与无脊椎动物的外壳或角质层中，尤 其是虾蟹类的外壳中。甲壳素很容易获得，可再生，是仅次于纤维素的天然均聚物，但是因 分子内部有很强的氢键作用，溶解性低，应用范围受到限制。
[0003] 甲壳素脱乙酰后生成壳聚糖。目前壳聚糖的制备多采用化学法和酶解法脱乙酰。 化学法脱乙酰反应中，影响脱乙酰的因素很多，但是主要影响因素包括：碱液浓度、反应温 度和时间。一般来说，提高反应温度和延长反应时间均可提高脱乙酰度，但是会导致甲壳素 主链降解增加，从而影响产品的粘度和分子量。通入氮气可以在一定程度上减缓主链的降 解。由于化学法使用的碱液浓度高，反应时间长，产品质量不稳定，环境污染严重。
[0004] 酶解法不会降解主链，并且无污染，具有重要的研究开发价值。影响酶解的因素很 多，主要包括PH值和温度。文献记载最适宜PH值4-8,最适宜温度30-70°C (《甲壳酶特性 与应用研究》万云洋等《天然产物研究与开发》2003 vol 15 No. 6)。迄今为止发现的真菌 甲壳质脱乙酰酶（CDA)都是糖蛋白，且有良好的热稳定性。但是不同来源CDA的存在位置、 最适宜PH值（PH4. 5-12)、碳水化合物含量、相对分子质量及离子影响等有较大的差异。
[0005] 迄今报道的CDA基本都来源于真菌。真菌来源的CDA主要作用是自身细胞壁的合 成，最适底物一般为甲壳寡糖，对甲壳质的活性较低，不适合用酶法脱乙酰生产壳聚糖。真 菌来源的CDA来源广泛，获取容易，成本相对较低。因此如何能够将真菌来源的CDA用于制 备壳聚糖成为本领域技术人员急需解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种新的几丁聚糖制备方法，所述的方法能够较现有技术 更节能环保。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种用真菌来源的CDA制备几丁聚糖的方法，所述的方 法能够解决现有技术CDA不适于生产几丁聚糖的技术难题。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种安全的几丁聚糖制备方法，所述的方法制得的几丁 聚糖无强酸或强碱残留，产品更安全。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种具有市场竞争力的几丁聚糖，所述的产品不因工艺 的改进而增加生产成本。
[0010] 为达到上述目的，本发明采用下列技术方案实现： 干燥、超微粉碎、酶解脱钙和脱蛋白、脱乙酰、水洗干燥粉碎即得。
[0011] 本发明采用制备方法对脱钙前的蟹壳或虾壳进行预处理，然后再进行酶解脱钙和 脱蛋白。
[0012] 为增强脱钙和脱蛋白效果，本发明优选的将蟹壳或虾壳粉碎至0.5?1.0mm颗 粒，颗粒过小则增加生产成本，颗粒过大效果较差。发明人经过多次试验及经验，最终确定 0. 5?1. Omm颗粒范围达到脱钙和成本的最佳性价比。
[0013] 本发明的酶解采用复合酶解方法，经过筛选后，最终发现用木瓜蛋白酶和中性蛋 白酶进行酶解较其他蛋白酶具有更好的效果。当然，选用其他蛋白酶进行酶解也能够实现 本发明的目的。本发明工艺中最佳酶解方案是将蟹壳或虾壳粉碎后的原料中加入4-8倍重 量体积比的水制成料液，料液加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2?5的复合蛋白酶， 加柠檬酸调PH值至5. 5?6. 5,40?60°C搅拌1?2h ;分离液体，残渣再次重复提取。
[0014] 酶解壳料所用的复合蛋白酶占壳料重量比为0. 05?0. 2%为佳。
[0015] 酶解脱钙和脱蛋白后，过滤，弃滤液，留取残渣，残渣即为甲壳质。将甲壳质加入 含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比（g/1) 1?4:2?5， 30?32°C，48?72h，0. 2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0016] 所述的可以从公开市场上购得，也可以通过构巢曲霉菌发酵后制得。
[0017] 所述的甲壳质脱乙酰酶制备方法如下： (1) 制备发酵培养基：酵母粉8g，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁 lg，二氯化钴（〇· 〇lmol/l) 10ml，水 1000ml ; (2) 发酵条件：发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，30?35°C，PH6. 0?7. 0,72?96h。
[0018] 经过酶解脱钙和脱蛋白后，去除了原料中的钙离子、蛋白质其它有机物质。
[0019] 本发明所述的几丁聚糖脱乙酰度高达94%以上。
[0020] 本发明的产物与任何一种或一种以上药剂学上辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维 素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露 醇、甘氨酸等混合制成的各种剂型，例如，可制成片齐?、缓释片、滴丸、颗粒齐?、胶囊齐?、微粒 齐U。优选剂型为胶囊剂或颗粒剂。
[0021] 本发明的酶解工艺与现有技术制相比，脱钙与脱蛋白在同一步骤中实现，大大提 高生产效率，无须使用强酸和强碱，耗能低，无污染，更加环保。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1 制备甲壳质脱乙酰酶： (1) 制备发酵培养基：酵母粉8g，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁 lg，二氯化钴（〇· 〇lmol/l) 10ml，水 1000ml ; (2) 发酵：发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，35°C，PH6. 0,发酵72h。
[0023] 将蟹壳或虾壳干燥粉碎至0. 5mm颗粒，加入4倍重量体积比的水制成料液，料液加 入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0. 05%，加柠 檬酸调PH值至5. 5,40°C搅拌lh ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣， 加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1:2,30°C，48h， 0. 2MPa，120°C，20min，干燥即得几丁聚糖。
[0024] 实施例2 制备甲壳质脱乙酰酶： (1)制备发酵培养基：酵母粉8g，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁 lg，二氯化钴（〇· 〇lmol/l) 10ml，水 1000ml ; (2)发酵条件：发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，30°C，PH7.0,72h。
[0025] 将蟹壳或虾壳干燥粉碎至1. 0mm颗粒，加入8倍重量体积比的水制成料液，料液加 入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1: 5的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0. 2%，加柠 檬酸调PH值至6. 5，60°C搅拌2h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣， 加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1: 5，32°C， 72h，0. 2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0026] 实施例3 制备甲壳质脱乙酰酶： (1) 制备发酵培养基：酵母粉8g，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁 lg，二氯化钴（〇· 〇lmol/l) 10ml，水 1000ml ; (2) 发酵条件：发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，33°C，PH6. 5,96h。
[0027] 将蟹壳或虾壳干燥粉碎至0. 5mm颗粒，加入8倍重量体积比的水制成料液，料液加 入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1: 5的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0. 1%，加柠 檬酸调PH值至6. 5,60°C搅拌2h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，力口 入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比4: 5,31°C，72h， 0. 2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0028] 实施例4 制备甲壳质脱乙酰酶： (1) 制备发酵培养基：酵母粉8g，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁 lg，二氯化钴（〇· 〇lmol/l) 10ml，水 1000ml ; (2) 发酵条件：发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，32°C，PH6. 6,72h。
[0029] 将蟹壳或虾壳干燥粉碎至1. 0mm颗粒，加入4倍重量体积比的水制成料液，料液加 入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0. 15%，加柠 檬酸调PH值至6,40°C搅拌2h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，加入 含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1:3,32°C，48?72h， 0. 2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0030] 实施例5 制备甲壳质脱乙酰酶： (1) 制备发酵培养基：酵母粉8g，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁 lg，二氯化钴（〇· 〇lmol/l) 10ml，水 1000ml ; (2) 发酵条件：发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，34°C，PH6. l，72h。
[0031] 将蟹壳或虾壳干燥粉碎至0. 8mm颗粒，加入6倍重量体积比的水制成料液，料液加 入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:3的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0. 18%，加柠 檬酸调PH值至5. 5, 50°C搅拌2h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，力口 入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1:5,31. 5°C，64h， 0. 2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0032] 实施例6 制备甲壳质脱乙酰酶：
【权利要求】
1. 一种几丁聚糖酶解方法，包括如下步骤： (1) 将蟹壳或虾壳干燥、粉碎； (2) 蛋白酶酶解脱钙和脱蛋白； (3) 酶解脱乙酰、水洗干燥粉碎即得。
2. 根据权利要求1所述的酶解方法，其特征在于，将蟹壳或虾壳粉碎至0. 5?1. Omm大 小。
3. 根据权利要求1或2所述的酶解方法，其特征在于，将蟹壳或虾壳粉碎后的原料中 加入4-8倍重量体积比的水制成料液，料液加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，调PH值，40? 60°C搅拌1?2h。
4. 根据权利要求3所述的酶解方法，其特征在于，所述的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶重 量比1:2?5。
5. 根据权利要求3或4所述的酶解方法，其特征在于，加柠檬酸调PH值至5. 5?6. 5。
6. 根据权利要求1-5任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，酶解壳料所用的复 合蛋白酶占壳料重量比为〇. 05?0. 2%。
7. 根据权利要求1-6任一权利要求所述的酶解方法，其特征在于，将甲壳质加入含 有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1?4:2?5,30? 32°C，48?72h，0. 2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
8. 根据权利要求7所述的酶解方法，其特征在于，所述的甲壳质脱乙酰酶制备方法如 下： (1) 制备发酵培养基：酵母粉8g，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁 lg，0. 01mol/l 的二氯化钴 10ml，水 1000ml ; (2) 发酵条件：发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，30?35°C，PH6. 0?7. 0,72?96h。
【文档编号】C12P19/26GK104059953SQ201310450586
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】黄永亮, 郁正刚, 崔卜东, 田志同, 白洁, 李雨田 申请人:天津天狮生物发展有限公司