专利名称：成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备治疗高血压的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及成纤维细胞生长因子-21成熟肽的一种新用途，即成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备治疗高血压的药物中的应用。
背景技术：
近年来，随着我国经济的飞速发展，人们生活水平的快速提高和生活方式的改变，高血压的发病率逐年提升的。高血压是一种以动脉压升高为特征，并伴有心脏、血管、脑和肾等器官功能或器质性改变的全身性疾病。高血压是最常见的心血管疾病，是全球范围内的重大公共卫生问题。目前我国18岁及以上居民高血压患病率约19%。目前治疗高血压的药物多为化学制剂，包括利尿剂、中枢神经和交感神经抑制剂、肾上腺素受体阻滞剂等。这些药物虽然起效较快，但持续时间不长，需要长期多次服用，容易使人形成药物依赖性，并且长期服用会造成严重的副作用。2000年，Tetsuya Nishimura等人最先在小鼠胚胎中分离出FGF家族中的一个新成员并将其命名为成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)。FGF-21是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，主要在肝脏中表达，蛋白N端前28个氨基酸为信号肽(去除信号肽后的多肽为成熟肽)，因此FGF21可以分泌到细胞外。
发明内容
本发明的目的是提供成纤维细胞生长因子-21成熟肽的一种新用途，即成纤维细胞生长因子-21在制备治疗高血压的药物中的应用。本发明还保护一种治疗高血压的药物`，其活性成分为成纤维细胞生长因子-21成熟肽。所述药物还包括其它药学上可接受的载体或辅料。所述药物中，除了所述活性成分夕卜，可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂和添加剂等。所述药物的给药形态可为针剂(如粉剂、水剂、油剂)。所述制剂都可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法而获得。所述药物的给药途径可为皮下注射、静脉注射或肌肉注射。以上任一所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽为如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗高血压的功能的由序列I衍生的蛋白质。以上任一所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽具体可采用包括如下步骤的方法制备:(I)表达所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽与分子伴侣的融合蛋白；(2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侣后得到所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽。
所述分子伴侣具体可为分子泛素样修饰蛋白(即分子伴侣SUM0)。所述“表达所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽与分子伴侣的融合蛋白”的实现方法如下:将所述成纤维细胞生长因子-21的编码基因插入原核表达载体pSUMO，得到重组质粒；将所述重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌；发酵所述重组菌并采用IPTG进行诱导，得到所述融合蛋白。所述“切除所述分子伴侣”的实现方式如下:所述融合蛋白，用SUMO蛋白酶KSUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比具体可为1:50)和DTT (所述DTT的初始浓度可为2mmol/L)切割(切割条件具体可为4°C切割过夜)。所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽的编码基因具体可为如下I)或2)或3)的DNA分子:I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。本发明还保护一种制备所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽的方法，包括如下步骤:(I)表达所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽与分子伴侣的融合蛋白；(2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侣后得到所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽。所述分子伴侣具体可为分子泛素样修饰蛋白(即分子伴侣SUM0)。所述“表达所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽与分子伴侣的融合蛋白”的实现方法如下:将所述成纤维细胞生长因子-21的编码基因插入原核表达载体pSUMO，得到重组质粒；将所述重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌；发酵所述重组菌并采用IPTG进行诱导，得到所述融合蛋白。所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽的编码基因具体可为如下I)或2)或3)的DNA分子:I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。本发明发现成纤维细胞生长因子-21成熟肽能够有效调控动物体内的血压水平，具有药效持续时间长的优点，可作为药物治疗高血压及心血管病变等疾病。
图1为实施例1中FGF-21成熟肽溶液的电泳图。图2为实验4周过程中，各组小鼠每周的血压对比。图3为停药后，各组小鼠24小时监测血压的结果对比。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。FGF-21蛋白的成熟肽，简称FGF-21成熟肽，如序列表的序列I所示。FGF-21成熟肽的编码基因如序列表的序列2所示。原核表达载体pSUMO (在文献中被称为“pHisSUMO”):参考文献:姜媛媛，尹成凯，李晋南，任桂萍，张薇，李德山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报，2008, 39(10):57-62 ;李璐，尹成凯，李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUM0.生物技术，2009, 19(3):11-14.。大肠杆菌Rosetta (DE3):北京全式金生物技术有限公司，目录号:0)801。SUMO蛋白酶I (具有His标签):制备方法见文献:傅俊华，王琪，尹杰超，刘铭瑶，李宁，姚文兵，任桂萍，李璐，李德山.融合蛋白GST-Ulplp在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其活性鉴定.生物工程学报，2010，26 (6):837-842.。雄性wistar大鼠:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心。实施例1、FGF-21成熟肽的制备一、重组质粒的构建1、提取离体的人肝脏的总RNA。2、采用M-MLV反转录酶将步骤I得到的总RNA反转录为cDNA。3、以步骤2得到的cDNA为模板，采用Pl和P2组成的引物对，采用rTaq酶，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Pl:5/ -GGTCTCTAGGT CACCCCATCCCTGACTCCAGT-3'；P2:5， -CGCGGATCCTTA GGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGG-3。PCR 扩增程序:95°C预变性 5min ；95°C 30s、56°C 30s,72°C 45s, 25 个循环；72°C延伸 IOmin04、用限制性内切酶BsaI和BamHI双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。5、用限制性内切酶BsaI和BamHI双酶切原核表达载体pSUMO，回收约5700bp的载体骨架。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pSUMO-FGF-21。重组质粒pSUMO-FGF-21中，FGF-21成熟肽的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列(位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成)融合，形成融合基因，表达融合蛋白(融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和FGF-21成熟肽)。FGF-21成熟肽的预期分子量为21KD(推算分子量为21KD，SDS-PAGE电泳显示分子量为25KD左右)，分子伴侣SUMO的预期分子量为12KD (推算分子量为12KD，SDS-PAGE电泳显不分子量为18KD左右)。二、FGF-21成熟肽的制备和纯化1、将重组质粒pSUMO-FGF-21导入大肠杆菌Rossetta(DE3)，得到重组菌。2、将步骤I得到的重组菌的单菌落接种至5mL LB培养基中，37°C、120rpm振荡培养10h，然后取菌液，以1:100的体积比接种于500mL含50mg/mL青霉素的LB培养基中，370C、120rpm 振荡培养 2h，此时 OD6tltlnm 为 0.35 左右。3、向步骤2得到的菌液中加入IPTG并使其浓度为0.25mmol/L以进行诱导(30°C、70rpm振荡培养4h),然后4°C、4000rpm离心30min,收集菌体。4、取步骤3得到的菌体，进行超声破碎(AMP35%，8-12min，工作Is停ls)，4°C、12000rpm离心,分别收集上清液和沉淀。分别将上清液和沉淀进行12%SDS_PAGE电泳分析。结果表明，可溶性表达的目的蛋白占菌体总目的蛋白的90 %以上。5、取步骤4得到的上清液,进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。柱子型号为:柱长0.7cm,柱高2.5cm。上样量为10ml。洗脱过程:先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质:40mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 50mmol/L Na3PO4 ；pH7.4)洗脱以去除杂蛋白，流速为lml/min ;然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液(溶剂为水,含有如下浓度的各个溶质:500mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI /T, Na3PO4 ；pH7.4)洗脱,流速为 lml/min, 280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于SOmAU的峰)，即为融合蛋白溶液。6、采用HiPr印TM26/10Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I (SUM0蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1:50)和终浓度为2mmol/L的DTT4°C切割过夜。8、取步骤7得到的溶液,进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。柱子型号为:柱长0.7cm,柱高2.5cm。上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于30mAU的峰)，即为FGF-21成熟肽溶液。FGF-21成熟肽溶液的聚丙烯凝胶电泳图见图1。回收目的带并进行N端测序，结果表明，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列I自N末端第I至15位氨基酸残基所示。实施例2、FGF-21成熟肽溶液对高血压的治疗作用实验动物为六周龄清洁 剂雄性wistar大鼠。实验动物饮用10g/100mL果糖水溶液，正常饲喂，12h昼夜周期喂养，4周后选取收缩压大于140mm Hg的大鼠，即为成模大鼠。将成膜大鼠分为两组，每组5只，分别进行如下平行处理:
FGF21治疗组:每天的7 =00-8:00时段内注射一次实施例1制备的FGF-21成熟肽
溶液，连续注射28天；每天每只大鼠注射Img FGF-21成熟肽(以总蛋白计)，用生理盐水调
整注射体积为0.5mL。生理盐水组:每天的7:00-8:00时段内注射一次生理盐水，连续注射28天；每天
每只大鼠注射0.5mL。设置正常对照组，即5只正常雄性wistar大鼠，每天的7 =00-8:00时段内注射一
次生理盐水,连续注射28天；每天每只大鼠注射0.5mL。每周(第I周即实验第7天、第2周即实验第14天、第3周实验第21天，第4周即
实验第28天)检测一次血压，三次试验的结果见表I至表3，三次试验的平均值结果见图2。
O周即第一次注射前。FGF21治疗组的血压相对于生理盐水组显著下降，与正常对照组无差异。
表I第一次试验中各组小鼠的血压(mm Hg)
权利要求
1.成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备治疗高血压的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽为如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗闻血压的功能的由序列I衍生的蛋白质。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽为权利要求7至10中任 一所述方法制备得到的成纤维细胞生长因子-21成熟肽。
4.一种治疗高血压的药物，其活性成分为成纤维细胞生长因子-21成熟肽。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于:所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽为如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗闻血压的功能的由序列I衍生的蛋白质。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于:所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽为权利要求7至10中任一所述方法制备得到的成纤维细胞生长因子-21成熟肽。
7.一种制备成纤维细胞生长因子-21成熟肽的方法，包括如下步骤: (1)表达所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽与分子伴侣的融合蛋白； (2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侣后得到所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽； 所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽为如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗闻血压的功能的由序列I衍生的蛋白质。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于:所述分子伴侣为分子泛素样修饰蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于:所述“表达所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽与分子伴侣的融合蛋白”的实现方法如下:将所述成纤维细胞生长因子-21的编码基因插入原核表达载体pSUMO,得到重组质粒；将所述重组质粒导入大肠杆菌Rosetta (DE3),得到重组菌；发酵所述重组菌并采用IPTG进行诱导，得到所述融合蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于:所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽的编码基因为如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
全文摘要
本发明公开了成纤维细胞生长因子-21在制备治疗高血压的药物中的应用。本发明还保护一种治疗高血压的药物，其活性成分为成纤维细胞生长因子-21成熟肽。本发明发现成纤维细胞生长因子-21成熟肽能够有效调控动物体内的血压水平，具有药效持续时间长的优点，可作为药物治疗高血压及心血管病变等疾病。
文档编号C12N15/70GK103191415SQ20131011527
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者李德山, 王文飞, 朱升龙, 张振宇, 任桂萍, 刘铭瑶 申请人:哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司