专利名称：杂交瘤细胞株afm1b7、其单克隆抗体及黄曲霉毒素m1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及杂交瘤细胞株AFM1B7、其单克隆抗体及黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒。
背景技术：
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素Al(AFA1)、B2 (AFB2)、AFG和Ml (AFMl)等。黄曲霉毒素Ml (AFMl)是AFBl的羟基化代谢产物，哺乳动物摄入AFBl污染的饲料后，在体内经羟基化会分泌于乳汁当中。通常当动物摄入了 AFBl污染的食物后，AFMl的排出量为AFBl摄入量的1% 3%。大量的研究者对AFMl的毒性和致癌性进行了深入的研究，研究结果也促使国际癌症研究机构将AFMl的致癌等级由二类致癌物质变为一类致癌物质。AFMl性质稳定，即使经过巴氏杀菌，也几乎完全不能被破坏。在许多乳制品中均含有AFMl。由于乳制品是婴幼儿食物的主要来源，因此AFMl污染问题引起了世界各国的广泛关注，并对AFMl进行了严格的限量。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，因此加强乳及乳制品中黄曲霉毒素Ml的检测、特别是速测，及时了解和掌握乳及乳制品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。
现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析 法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是较早用于检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，该法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法主要包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，这些方法灵敏度高，准确性好，但又有仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测。免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点，已应用于食品、医疗等多个领域。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株AFM1B7、其单克隆抗体及黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒。本发明提供了杂交瘤细胞株AFM1B7，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCN0.C201020。其具有序列表中SEQ ID N0.1所示的单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID N0.2所示的单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC N0.C201020的杂交瘤细胞株AFM1B7分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQID N0.4所示的氨基酸序列。该单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素M1，对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC50为52pg/mL。黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于:它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中:所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线上包被黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA);所述抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC N0.C201020的杂交瘤细胞株AFM1B7分泌产生的单克隆抗体。按上述方案，所述铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是按照以下方法制备得到的:将保藏编号为CCTCC N0.C201020的杂交瘤细胞株AFM1B7分泌产生的单克隆抗体(抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体)用碳酸盐缓冲溶液透析后和铕标记试剂以质量比为0.5 2:1的比例充分混匀后静置过夜，然后经S印hadex G_50层析柱分离铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，洗脱，收集目标产物。按上述方案，所述突光试纸条中的吸水垫长15 20mm,宽3 4mm ;检测垫长25 30mm,宽3 4mm ;样品垫长12 18mm,宽3 4mm,相邻各垫的交叠长度为I 3_。按上述方案，所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15 20mm,质控线和检·测线的间距为5 IOmm ;所述的样品反应瓶为l_5mL的卡口瓶。按上述方案，所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为50 IOOng ;每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为30 IOOg ;所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干品的含量为0.05-0.25 μ g。按上述方案，所述的荧光试纸条是采用以下方法获得的:(I)将吸水纸剪裁得吸水垫；(2)检测垫的制备:将黄曲霉毒素M-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA配制成浓度为0.1 0.4mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿10 15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA的包被量为50 lOOng，然后于37 40°C条件下干燥30 60分钟；将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1 0.4mg/mL的包被液,于距检测线5 IOmm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为30 lOOng，然后于37 40°C条件下干燥30 60分钟；(3)样品垫的制备:将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥3 6小时,得样品垫，然后置干燥器中室温保存；(4)荧光试纸条的组装:在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为I 3mm,即得突光试纸条。按上述方案，所述荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物(AFMl-BSA)包被液中所使用的包被缓冲液为:每IOmL中含有牛血清白蛋白0.lg，叠氮化钠0.002g,氯化钠0.08g,十二水磷酸氢二钠0.029g,氯化钾0.002g,磷酸二氢钾0.002g ；配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为 每IOmL中含有叠氮化钠0.002g,氯化钠0.08g,十二水磷酸氢二钠0.029g,氯化钾0.002g,磷酸二氢钾0.002g ；所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为■ 每IOOmL中含有卵清白蛋白0.5~2g,蔗糖2g，叠氮化钠0.02g,氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g,磷酸二氢钾0.02go按上述方案，所述黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒还包括样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01 0.30%的吐温-20水溶液。上述黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素Ml含量检测中的应用:将待测样品液加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37°C反应6分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线(T)时间分辨荧光强度值和质控线(C)时间分辨荧光强度值的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素Ml浓度的关系曲线，获得待测样品液中黄曲霉毒素Ml的含量。按上述方案，所述的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素Ml浓度的关系曲线是采用以下方法得到的:(I)配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素Ml标准品溶液；(2)将适量上述各浓度的黄曲霉毒素Ml标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37° C反应6分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；(3)经拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素Ml浓度的关系曲线。本发明中的杂交瘤细胞株AFM1B7是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为:将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素Ml完全抗原AFMl-BSA免疫4_6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素Ml完全抗原AFMl-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，待细胞融合后2-3周，用微量移液器将单个细胞集落移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，进行第一次克隆，采用ELISA方法分两步筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素Ml而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素Ml作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株AFM1B7。本发明中单克隆抗体的制备方法，步骤如下:将获得的杂交瘤细胞株AFM1B7注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得。所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作步骤:用双层滤纸过滤小鼠腹水，4°C，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30 35 μ L,室温混合30 60min, 4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.lmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液,用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4,4°C预冷,缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL, 4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.0lmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的单克隆抗体，将抗体置_20°C冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到IOOmL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到IOOmL所得；所述的0.lmol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，
2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到IOOmL所得。本发明的有益效果:(I)本发明提供的杂交瘤细胞株AFM1B7可以用于制备高效价单克隆抗体，鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达2.2X105。(2)本发明提供的单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC5tl为52pg/mL,与黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,呕吐毒素,玉米赤霉烯酮,伏马毒素的交叉反应率均小于0.3%。(4)本发明提供的单克隆抗体制备的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒可用于黄曲霉毒素Ml含量的定量测定，且操作简单，快速，准确度高。
图1为本发 明提供的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒中荧光试纸条的结构示意图。图中:1样品垫、2检测垫、3检测线、4质控线、5吸水垫。
具体实施例方式实施例1:杂交瘤细胞株AFM1B7的筛选1.动物免疫购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的黄曲霉毒素Ml完全抗原AFM1-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素Ml完全抗原与等体积的福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积的黄曲霉毒素Ml完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠80 μ go前3次每次免疫后8 10天,尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。黄曲霉毒素Ml完全抗原AFMl-BSA购于Sigma-Aldrich公司。2.细胞融合于最后一次加强免疫3天后，采用50% (重量百分数)的聚乙二醇即PEG (分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤:无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5:1的个数比混合，用RPM1-1640基础培养液洗混合细胞，用50%PEG融合，融合I分钟，然后缓慢加入RPM1-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用20mL含1%HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37°C二氧化碳培养箱培养。所述的含1%HAT的细胞完全培养基含有20% (体积百分数)胎牛血清，75% (体积百分数)RPM1-1640基础培养液，1% (重量百分数)L-谷氨酰胺，1% (体积百分数)HEPES, 1%(体积百分数)双抗(10000单位每晕升青霉素和10000微克每晕升链霉素),2% (重量百分数)生长因子和1% (重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT ;半固体培养基为含1% (质量百分数)甲基纤维素的细胞完全培养基；RPM1-1640基础培养液、HEPES、双抗、L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤_氨基蝶呤_胸腺11密唳核苷即HAT、甲基纤维素购于Sigma-Aldrich公司。3.细胞株的筛选及克隆待细胞融合后2-3周，细胞集落长到人肉眼可见时，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入I个克隆，待细胞长至满孔底1/2 2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，即进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素Ml而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素Ml作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为O的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC5tl值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后,获得杂交瘤细胞株AFM1B7。实施例2:杂交瘤细胞株AFM1B7抗体可变区序列测定(1)提取总RNA:采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株AFM1B7的总RNA ；(2)合成cDNA:以步骤I获得的总RNA为模板，oligo (dT) 15为引物，按照SuperScriptTM-2 II反转录酶说明书进行反转录,合成cDNA第一链；引物oligo (dT) 15由Invitrogen 购得；(3)PCR法克隆可变区基因:根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为:94°C 30s,58°C lmin、72°C lmin，扩增30个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物经过1% (重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMDlS-T中，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为:重链可变区引物为5，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3，(22mer)和5，-TGAGGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3，(32mer)其中 S、M、R 和 W 为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为 5，-GAC ATT GAG CTCACC CAG CTT GGT GCC-3，(24mer)和 5，-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3， (24mer)。得到的基因序列结果:重链可变区编码基因序列长339bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由113个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长318bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由106个氨基酸组成，序列如 SEQ IDNO: 4 所示。实施例3:单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定
将实施例1获得的杂交瘤细胞株系AFM1B7注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为:用双层滤纸过滤小鼠腹水，4°C，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μ L,室温混合30min，4°C静置2h，然后4°C，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.lmol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4,4°C预冷,缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4°C静置2h，然后4°C，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的单克隆抗体，将抗体置于_20°C冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至IOOmL所得；所述0.lmol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到IOOmL所得。用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株AFM1B7分泌的单克隆抗体的亚型为IgGl。用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得注射AFM1B7杂交瘤细胞株的BALB/c小鼠腹水抗体的效价可达2.2X105,即小鼠腹水抗体稀释2.2X IO5倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC5tl为52pg/mL,与黄曲霉毒素BI, B2, Gl, G2,呕吐毒素,玉米赤霉烯酮,伏马毒素的交叉反应率均小于0.3%ο实施例4:黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，它包括荧光试纸条、含有铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干品的样品反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1_，其中:吸水垫长15mm,宽4mm ;检测垫长25mm,宽4mm ;样品垫长13mm,宽4mm。所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，其包被量为40ng/cm质控线，所述检测线上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)，其包被量为65ng/cm检测线，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15mm,质控线和检测线的间距为5mm。所述荧光试纸条的获得:(I)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长15mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被:将黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA用包被缓冲液配制成浓度为0.15mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需AFMl-BSA的包被量为65ng，然后于37°C条件下干燥30分钟；所述的包被缓冲液为:0.1g牛血清白蛋白，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到IOmL所得；质控线的包被:将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.lmg/mL的包被液；于距检测线6_的位置，用线喷方式将 其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为40ng,然后于37°C条件下干燥I小时；所述的包被缓冲液为0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容至IOmL所得；(3)样品垫的制备:将玻璃纤维膜剪裁成长13mm,宽4mm的规格,放入封闭液中浸湿,取出，于37°C条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；所述的封闭液为Ig卵清白蛋白，2g鹿糖,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；(4)荧光试纸条的组装:在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、荧光标记抗体反应垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得荧光试纸条(见图1)。所述铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的获得:取Img上述实施例3中的单克隆抗体,用100mmol/L pH9.3的碳酸盐缓冲液反复洗涤6次后，将其和0.5mg铕标记试剂充分混匀，于4°C过夜。然后将其加入到1.9cmX60cm的S印hadex G-50层析柱中，用含0.9%NaCl的50mmol/L Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液(lml/管)，逐管测量吸光值(A280nm)，合并峰管，获得目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体。上述铕标记试剂购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。所述含有铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干粉的样品反应瓶的获得:取上述铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体0.05 μ g放于3mL卡口瓶中，采用常规冷冻真空干燥方法抽干后，既得铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干粉，4°C保存，备用。所述的样品稀释液为:体积分数为0.01%的吐温-20水溶液。上述流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在牛奶样品黄曲霉毒素Ml检测中的应用:I荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素Ml浓度的关系曲线的建立:(I)对经高效液相色谱法(HPLC)检测为黄曲霉毒素Ml阴性的牛奶样品进行黄曲霉毒素 Ml 加标，配得 4ng/mL、2ng/mL、lng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.lng/mL、0.05ng/mL、0.02ng/mL和Ong/mL的黄曲霉毒素Ml标准品溶液；(2)取上述各浓度的黄曲霉毒素Ml标准品溶液各200 μ L，分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37°C反应6分钟，用吸水纸吸干样品垫残留液体，即刻用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长:365nm，测定波长:615nm)，得到各荧光试纸条上检测线处(T)和质控线(C)处的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；(3)以AFMl浓度为横坐标，各浓度的黄曲霉毒素Ml标准品溶液相应的检测线时间分辨荧光强度/质控线时间分辨荧光强度即τ/c值为纵坐标，拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素Ml浓度的关系曲线。该方法的有效检测范围为0.05 2ng/mL。II牛奶样品中黄曲霉毒素Ml含量的检测:取待测牛奶样品5份，各200μ L加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37°C反应6分钟后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长:365nm,测定波长:615nm),获得各突光试纸条检测线时间分辨突光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)，然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(Τ/C)与黄曲霉毒素Ml浓度的关系曲线，得:5个牛奶样品的检测结果依次为:〈0.05ng/mL、0.12ng/mL、〈0.05ng/mL、l.2ng/mL 和 0.83ng/mL。
·
将该方法检测结果与ELISA检测结果进行比较，得:该方法检测结果与国家标准高效液相色谱方法检测结果高度一致，符合率高达97.5% ;另，该方法单个样品检测所需时间也仅约为高效液相色谱标准方法的十分之一，显著提高了检测速度。实施例5:黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用所述突光试纸条中的吸水垫长15 20mm,宽3 4mm ;检测垫长25 30mm,宽3 4mm ;样品垫长12 18mm,宽3 4mm,相邻各垫的交叠长度为I 3_。黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，它包括荧光试纸条、含有铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干品的样品反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，其中:吸水垫长18mm，宽3mm ;检测垫长28mm,宽3_ ;样品垫长15mm,宽3_。所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫,硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，其包被量为100ng/cm质控线，所述检测线上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)，其包被量为lOOng/cm检测线，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为20mm，质控线和检测线的间距为ICtam。所述荧光试纸条的获得:(I)吸水垫的制备将吸水纸剪裁成长18mm，宽3mm的规格，即得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被:将黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA用包被缓冲液配制成浓度为0.4mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿20mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需AFMl-BSA的包被量为lOOng，然后于40°C条件下干燥30分钟；所述的包被缓冲液为:0.1g牛血清白蛋白，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，
0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到IOmL所得；质控线的包被:将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.4mg/mL的包被液；于距检测线6_的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为40ng，然后于40°C条件下干燥30min ；所述的包被缓冲液为0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，
0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容至IOmL所得；所述的硝酸纤维素膜长28mm，宽3mm。(3)样品垫的制备:将玻璃纤维膜剪裁成长15mm,宽3mm的规格,放入封闭液中浸湿,取出，于37°C条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；所述的封闭液为Ig卵清白蛋白，2g鹿糖,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；
(4)荧光试纸条的组装:在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、荧光标记抗体反应垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得荧光试纸条(见图1)。所述铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的获得:取Img上述实施例3中的单克隆抗体,用100mmol/L pH9.3的碳酸盐缓冲液反复洗涤6次后，将其和2mg铕标记试剂充分混匀，于4°C过夜。然后将其加入到1.9cmX60cm的S印hadex G-50层析柱中，用含0.9%NaCl的50mmol/L Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液(lml/管)，逐管测量吸光值(A280nm)，合并峰管，获得目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体。上述铕标记试剂购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。所述含有铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干粉的样品反应瓶的获得:取上述铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体0.25 μ g放于3mL卡口瓶中，采用常规冷冻真空干燥方法抽干后，既得铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干粉，4°C保存，备用。所述的样品稀释液为:体积分数为0.30%的吐温-20水溶液。上述流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在牛奶样品黄曲霉毒素Ml检测中的应用:取待测牛奶样品200 μ L加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条,37 °C反应6分钟后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长:365nm,测定波长:615nm),获得各突光试纸条检测线时间分辨突光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)，然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素Ml浓度的关系曲线，得:该牛奶样品中黄曲霉毒素Ml的含量为Ing/mL。
权利要求
1.杂交瘤细胞株AFM1B7，其特征在于:它保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC N0.C201020。
2.单克隆抗体，其特征在于:它由保藏编号为CCTCCN0.C201020的杂交瘤细胞株AFM1B7分泌产生。
3.黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于:它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中:所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线上包被黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA);所述的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体为权利要求1所述的保藏编号为CCTCC N0.C201020的杂交瘤细胞株AFM1B7分泌产生的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于:所述铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是按照以下方法制备得到的:将权利要求I所述的保藏编号为CCTCC N0.C201020的杂交瘤细胞株AFM1B7分泌产生的单克隆抗体用碳酸盐缓冲溶液透析后和铕标记试剂以质量比为0.5 2:1的比例充分混匀后静置过夜，然后经S印hadex G-50层析柱分离铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，洗脱，收集目标产物。
5.根据权利要求3所述的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于:所述突光试纸条中的吸水垫长15 20mm,宽3 4mm ;检测垫长25 30mm,宽3 4mm ;样品垫长12 18mm,宽3 4mm,相邻各垫的交叠长度为I 3mm ;所述检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15 20mm，质控线和检测线的间距为5 IOmm ;所述的样品反应瓶为l_5mL的卡口瓶。
6.根据权利要求3所述的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于:所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为50 IOOng ;每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为30 IOOg ;所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体冻干品的含量为0.05-0.25 μ g。
7.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于:所述的荧光试纸条是采用以下方法获得的: (1)将吸水纸剪裁得吸水垫； (2)检测垫的制备: 将黄曲霉毒素M-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA配制成浓度为0.1 0.4mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿10 15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA的包被量为50 lOOng，然后于37 40°C条件下干燥30 60分钟； 将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1 0.4mg/mL的包被液,于距检测线5 IOmm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为30 lOOng，然后于37 40°C条件下干燥30 60分钟； (3)样品垫的制备:将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥3 6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； (4)荧光试纸条的组装: 在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为I 3mm,即得突光试纸条。
8.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于:所述荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物(AFMl-BSA)包被液中所使用的包被缓冲液为:每IOmL中含有牛血清白蛋白0.lg，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g,十二水磷酸氢二钠0.029g,氯化钾0.002g,磷酸二氢钾0.002g ； 配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为:每IOmL中含有叠氮化钠0.002g,氯化钠0.08g,十二水磷酸氢二钠0.029g,氯化钾0.002g,磷酸二氢钾0.002g ； 所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为:每IOOmL中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g,氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g,磷酸二氢钾0.02go
9.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于:它还包括样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01 0.30%的吐温-20水溶液。
10.根据权利要要求3所述的黄曲霉毒素Ml流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素Ml含量检测中的应用，其特征在于:它是将待测样品液加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37°C反应6分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线时间分辨荧光强度值和质控线时间分辨荧光强度值的比值；基于预先获得的时间分辨荧光试纸条检测 线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值与黄曲霉毒素Ml浓度的关系曲线，获得待测样品液中黄曲霉毒素Ml的含量。
全文摘要
本发明涉及杂交瘤细胞株AFM1B7、其单克隆抗体及黄曲霉毒素M1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒。杂交瘤细胞株AFM1B7，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C201020。其分泌产生的单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度为52pg/mL，与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素的交叉反应率均小于0.3%。由该单克隆抗体获得的黄曲霉毒素M1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒可用于黄曲霉毒素M1含量的定量测定，操作简单，快速，准确度高。
文档编号C12N5/20GK103215230SQ20131011587
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者李培武, 李冉, 张奇, 丁小霞, 张文, 张兆威 申请人:中国农业科学院油料作物研究所