>[0262] 实施例2
[0263] 使用精制后的酶对D-阿洛酮糖和D-果糖间的差向异构化的平衡进行研宄。其结 果，平衡状态下的D-阿洛酮糖：D-果糖在40 °C下为25:75,在70 °C下为30:70。
[0264] 实施例3
[0265] [AgM30菌株通过全基因组分析的DPE基因碱基序列的特定]
[0266] 根据上述试验的结果，AgM30菌株的DPE与已知的DPE完全不同，认为使用PCR 扩增的方法或已知的蛋白质数据库可以进行分离。因此，确定AgM30菌株的全基因组序 列并进行其蛋白质数据库的构筑。使用Qiagen公司的DNeasy Blood&Tissue试剂盒从 AgM30 菌株中分离、精制 DNA，将其中 19. 58 μ g 委托给 TAKARA BIO INC. Dragon Genomics Center的高速序列分析。其结果，得到了总分析碱基数为513569410bp且22个4kb以上 的重叠群。由于该22个重叠群为约5. 1Mb，因此，认为能够覆盖球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30的全基因组序列。
[0267] [AgM30菌株的蛋白质数据库的构筑]
[0268] 基于得到的约5. IMb的基因序列使用GeneMarkS程序推测4798个0RF，对于各个 ORF推测氨基酸序列。将该4798氨基酸序列作为AgM30菌株的蛋白质数据库。
[0269] [AgM30菌株发现有DPE活性的蛋白质的再鉴定]
[0270] 使用上述的蛋白质数据库，登录作为蛋白质鉴定系统的MASCOT服务器（Matrix Science K.K.)，进彳丁发现有DPE活性的蛋白质的再鉴定。其结果，由下述序列2(序列表序 列号2)构成的氨基酸序列中与带有下划线表示的氨基酸序列发现有52%的相似性，因此， 强烈地启示了本蛋白质为AgM30菌株的DPE。
[0271] [序列 2]
[0273] (序列2使用AgM30菌株的蛋白质数据库鉴定的氨基酸序列下划线部分所示的氨 基酸序列为与用MALDI-T0F MS得到的峰一致的序列。）
[0274] [AgM30菌株的DPE基因的分离]
[0275] 从氨基酸序列中获取基因组基因信息，设计扩增用的PCR引物（AglDPE_F : 5' -ATGAAAATTGGTTGCCATG-3'，AglDPE_R :5' -TTAGTGCAGTTCGATGGT-3'），通过 AgM30 菌株的 基因组对DPE基因进行扩增。进行其PCR产物的序列分析，结果得到了下述的序列11 (序 列表序列号3)所示的870bp的基因序列、以及由序列12(序列表序列号4)的带下划线所 示的第15个的胞嘧啶（C)被置换为胸腺嘧啶（T)的序列构成的基因序列这2个碱基序列。
[0276][序列3 (序列表序列号3)]
[0281] (序列4 (序列表序列号4)通过AgM30菌株的基因组DNA扩增的DPE基因序列由 下划线部分所示的第15个的胞嘧啶（C)被置换为胸腺嘧啶（T)而成的序列构成。）
[0282] [使用了大肠杆菌表达体系的DPE基因产物的分析]
[0283] 基于序列11 (序列表序列号3)的序列进行大肠杆菌表达体系的构筑。在pET载 体（Clontech公司）中嵌入来自AgM30菌株的DPE基因，转化表达用大肠杆菌。其结果，如 图17所示在可溶性组成中确认有衍生蛋白质。另外，也可以确认有DPE活性，但是其活性 在每ImL培养液中与野生型相同程度。
[0284] 进一步，为了提高大肠杆菌表达体系中的活性，在pRSET载体（Invitrogen公司） 和pCold载体（TAKARA BIO INC.)中嵌入来自AgM30菌株的DPE基因，制作大肠杆菌转化 体。测定了在这些体系中生产的DPE的活性，结果为，每ImL培养液中在pRSET载体的体系 中显示与野生型相同程度的活性，在PCold载体的体系中显示野生型的10倍左右的活性。
[0285] [使用了枯草杆菌表达体系的DPE基因产物的分析]
[0286] 构筑了有报告称基因重组蛋白质的生产量多于大肠杆菌体系的枯草杆菌体系。在 作为宿主的枯草杆菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)转化用pHTOl载体(MoBiTec公 司）中嵌入来自AgM30菌株的DPE基因，序列分析之后，进行了转化。其结果，能够得到许 多获取了抗生素耐药性的转化体，因此，进行DPE基因诱导实验，但是没有发现产生DPE基 因产物，也不能测定其活性。
[0287] [使用了大肠杆菌表达体系的DPE基因产物的大量生产]
[0288] 由于在枯草杆菌体系中不能大量生产DPE基因产物，因此，再次使用大肠杆菌体 系尝试大量生产来自AgM30菌株的DPE基因产物。因为在一直以来使用的载体的体系中以 简便地进行重组蛋白质的精制的方式在N末端侧添加有His-tag或添加用于使之增溶的增 溶化tag等，因此，认为会对重组蛋白质的生产量、酶活性有影响。在此使用在重组蛋白质 中没有添加 tag等的pQE载体（Qiagen公司）的体系。在pQE60载体（Qiagen公司）中嵌 入来自AgM30菌株的DPE基因，转化作为其宿主的大肠杆菌M15 [pREP4] (Qiagen公司），并 对其表达产物进行分析。如果通过SDS-PAGE(凝胶浓度12% )进行电泳，则如图18所示， 在显示与野生型的蛋白质大致相同分子量的约30kD附近的可溶性组分中确认有作为表达 产物的蛋白质。另外，测定了 ImL培养液的DPE酶活性，结果为55.2U(ymol/min)。由于从 现有的球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30菌株中粗精制得到的DPE的酶活性为 每ImL培养液为1. 5~I. 8U ( μ mol/min)，因此，发现酶活性上升30~37倍左右。
[0289] 产业上利用的可能性
[0290] 本发明的酮糖3-差向异构酶作用于游离的D-或L-酮糖、D-或L-戊酮糖，将这些 酮糖的3位差向异构化，从而容易地生成对应的D-或L-酮糖、D-或L-酮糖。该反应开拓 了以各种酮糖、尤其是D-果糖为原料大量生产D-阿洛酮糖的道路。进一步，本发明的酮糖 3_差向异构酶可以通过各种的固定化方法来得到活性高的固体化酶，通过使用固定化酶能 够连续地进行大量的差向异构化反应。通过能够工业地进行固定化，从而可以大量生产作 为目标的酮糖。
[0291] 因此，本发明的酮糖3-差向异构酶及其制造方法的确立不仅在制糖产业中，而且 在与其关联的食品、化妆品、医药品产业中的工业意义极大。
[0292] 作为将生产本酶的球形节杆菌用在食品产业中的最大特征在于菌的安全性。该 菌种在美国被FDA收录于EAFUS中，这证明了菌体自身的安全性非常高。作为至今已知的 D-阿洛酮糖的生产酶，有来自假单胞菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属等的酶，但是不仅没有被 收录于美欧的清单中，而且还有作为机会致病菌或植物细胞感染等的报告，是确认安全性 需要很多劳力的微生物。本发明中能够使用菌体本身的安全性非常高的菌是较大的技术进 步。
【主权项】
1. 一种酮糖3-差向异构酶，其中， 所述酮糖3-差向异构酶来自作为球形节杆菌M30的微生物，作为部分氨基酸序列包含 序列表中的序列号1所示的氨基酸序列，具有下述（A)、（B)的底物特异性，并且具有下述 (A)~（B)的物理化学性质，其中，所述球形节杆菌M30的保藏编号为NITEBP-1111， (A) 将D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖； (B) 在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。2. 如权利要求1所述的酮糖3-差向异构酶，其中， 具有下述（a)~（f)的物理化学性质， (a) 分子量： 通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为约32kDa，通过凝胶过滤法测定的分子量为 120kDa，并且为亚单位的分子量为32kDa的同源四聚体结构； (b) 最佳pH: 在30°C下反应30分钟，20mM的镁（Mg2+)存在的条件下为6至11 ; (c) 最佳温度： 在pH7. 5下反应30分钟，20mM的镁（Mg2+)存在的条件下为60至80°C; (d)pH稳定性： 在4°C下保持24小时的条件下至少在pH5至11的范围内稳定； (e) 热稳定性： 在pH7. 5下保持1小时，4mM的镁离子（Mg2+)存在的条件下在约50°C以下稳定，在镁离 子（Mg2+)不存在的条件下，在约40°C以下稳定； (f) 通过金属离子的活化： 通过二价锰离子Mn2+、二价钴离子Co2+、钙离子Ca2+以及镁离子Mg2+活化。3. 如权利要求1或2所述的酮糖3-差向异构酶，其中， 具有下述底物特异性1.~8.，1. 将D-果糖作为底物时的相对活性为43.8% ;2. 将D-阿洛酮糖作为底物时的活性为100% ;3. 将D-山梨糖作为底物时的相对活性为1. 13% ;4. 将D-塔格糖作为底物时的相对活性为18. 3% ;5. 将L-果糖作为底物时的相对活性为0.97% ;6. 将L-阿洛酮糖作为底物时的相对活性为21.2% ;7. 将L-山梨糖作为底物时的相对活性为16. 6% ;8. 将L-塔格糖作为底物时的相对活性为44. 0%， 其中，将D-阿洛酮糖的差向异构化活性作为100,将对各个酮糖的活性作为相对活性 来表示。4. 一种酮糖3-差向异构酶，其中， 所述酮糖3-差向异构酶由序列表中的序列号3或序列号4所示的碱基序列、或者序列 表中的序列号3或序列号4所示的碱基序列中在保持编码的酶的活性的范围内缺失、置换 或加成1个或2个以上的碱基序列而成的碱基序列或者与其互补的碱基序列编码， 该酮糖3-差向异构酶将D-或L-酮糖的3位差向异构化从而生成对应的D-或L-酮 糖。5. 如权利要求7所述的酮糖3-差向异构酶，其中， 酮糖3-差向异构酶是D-阿洛酮糖异构酶。6. -种酮糖的转换方法，其特征在于， 使权利要求1~5中任一项所述的酮糖3-差向异构酶作用于含有选自D-或L-酮糖 中的1种以上的溶液，将该酮糖的3位差向异构化。7. -种酮糖的制造方法，其特征在于， 使权利要求1~5中任一项所述的酮糖3-差向异构酶作用于含有选自D-酮糖或L-酮 糖中的1种以上的溶液，将该酮糖的3位差向异构化，使对应的酮糖生成并采集。
【专利摘要】本发明提供一种能够在食品产业中使用的安全性高的差向异构酶以及酮糖的制造方法。本发明提供一种可以由属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物得到的具有序列表中的序列号1所示的氨基酸序列和下述底物特异性的酮糖3-差向异构酶：(1)将D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖；(2)在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。以及，一种酮糖3-差向异构酶，其将序列表中的序列号3或序列号4所示的D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖。NITE BP-111120110622
【IPC分类】C12N9/90, C12N15/09, C12P19/02
【公开号】CN104919045
【申请号】CN201380069857
【发明人】何森健, P·K·古洛帕利, 新谷知也, 吉川谅
【申请人】松谷化学工业株式会社, 株式会社希少糖生产技术研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年12月26日
【公告号】EP2944691A1, US20150344925, WO2014109254A1