(Agrobacterium)为7~8。另一方面，通过本菌 株得到的酶的最佳pH在6~8之间，在着色少的7以下的pH下也能够生产D-阿洛酮糖。
[0062] 3.根据测定了 30分钟的酶活性的结果，报告了根瘤菌属(Rhizobium)通过Mn2+、 Mg2+会增加活性，土壤杆菌属(ARrobacterium)通过Co2+、Mn2+会增加活性。在本酶的情况 下，确认了通过Mn 2+和Co 2+会增加活性。另外，通过Mg 2+、Ca2+也会增加活性。
[0063] 4.与现有的酶比较可以在宽的温度带进行反应。
[0064] 5.由L-塔格糖向L-山梨糖的反应活性大。
[0065] 6.即使培养基中添加的D-阿洛酮糖少至0. 15%也可以得到具有活性的菌体。
[0066] 7.在水中也有酶活性，进行由果糖向阿洛酮糖的反应。
[0067] 8.繁殖速度大于菊苣假单胞菌。
[0068] 9.包含序列表中的序列号3或序列号4所示的碱基序列的酮糖3-差向异构酶具 有30~37倍左右的酶活性。
[0069] 根据本发明，可以由作为在制造食品时使用被认可的、现有添加物名册收录清单 中收录的菌种的几乎没有毒性的菌种以高收率取得能催化由D-果糖向D-阿洛酮糖的异构 化的新型酮糖3-差向异构酶。进一步，可以提供使用了该酶的制造酮糖的方法。
[0070] 即，本发明可以提供能够由属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物得到的酮糖 3_差向异构酶，并且能够提供利用该酶将D-或L-酮糖的3位差向异构化并制造对应的 D-或L-酮糖的方法。能够由该微生物得到的本发明的酮糖3-差向异构酶尤其能够良好地 催化D-阿洛酮糖和D-果糖之间的相互转换，因此，对于由D-果糖制造 D-阿洛酮糖有用。
【附图说明】
[0071] 图1是表示使用了无机盐培养基的各种碳源对酶生产量的影响的图。
[0072] 图2是表示在各种培养基中对酶生产量的影响的图。
[0073] 图3是表示金属离子对D-PE活性的影响的图。
[0074] 图4是表示最佳温度的图。
[0075] 图5是表示热稳定性的图。
[0076] 图6是表示最佳pH的图。
[0077] 图7是表示pH稳定性的图。
[0078] 图8是表示通过离子交换色谱进行的分离洗脱的图。
[0079] 图9是表示通过疏水色谱进行的分离洗脱的图。
[0080] 图10是用于确认纯度的SDS-PAGE照片。
[0081] 图11是表示最佳pH的范围的图。
[0082] 图12是表示最佳温度的范围的图。
[0083] 图13是表示稳定的pH范围的图。
[0084] 图14是表示稳定的温度范围的图。
[0085] 图15是表示泳动距离（migration distance)与分子量的关系的图。
[0086] 图16是表示标准蛋白质的移动距离的关系图与分子量的关系的图。
[0087] 图17是表示使用了大肠杆菌表达体系的AgM30菌株DPE基因产物的分析结果的 图。
[0088] 图18是表示使用了大肠杆菌表达体系（pQE载体）的AgM30菌株DPE基因产物的 分析结果的图。
【具体实施方式】
[0089] 本发明涉及一种能够由属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物得到的，具有下 述底物特异性的酮糖3-差向异构酶，在能够用于食品工业的菌的安全性、低最佳pH、热稳 定性以及金属要求性方面有特点。
[0090] [安全性]
[0091] 对于本酶，作为在食品产业中使用的球形节杆菌的最大优势在于菌的安全性。该 菌种首先在美国由FDA作为"来自固定化球形节杆菌的葡萄糖异构酶（Glucose isomerase from immobilized arthrobacter globiformis) " 被收录于 EAFUS (Everything Added to Food in the United States):食品添加物数据库（A Food Additive Database)中。该使 用方法是将菌体直接固定化，因此，证明了菌体本身的安全性非常高。
[0092] 另外，在欧洲，由EFFCA(欧洲食品与饲料菌种协会（The European food&feed cultures association))和 IFD(国际屋面联合会(International Federation for the Roofing Trade))在《有文献记载的用于食品的微生物名单（Inventory of Microorganisms with a documented history of use in food)》中记载了其作为"柑橘 发酵以除去朽1 檬苦素并减少苦味（Citrus fermentation to remove limonin and reduce bitterness) "被使用的要点。这显示与酵母等同样，将该菌种用于发酵中，并显示安全性极 高。在日本，节杆菌属作为"α-淀粉酶、异麦芽糖葡聚糖酶（isomaltodextranase)、鹿糖 酶（invertase)、尿素酶、葡聚糖酶、α-葡萄糖基转移酶、果糖基转移酶等酶基原微生物或 者作为海藻糖或维生素 K(甲萘醌）生产菌而被收录于食品添加物清单中。
[0093] 这样尽管在日美欧有很长的使用实际成绩，但是令人惊讶地是还没有发现由该菌 种产生的差向异构酶。
[0094] 另一方面，作为至今已知的D-阿洛酮糖的生产酶，有通过假单胞菌属 (Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)等产生的酶。这些没 有被收录于上述美欧的清单中，也有作为机会致病菌或植物细胞感染等的报告。
[0095] 另外，由作为糖质酶的代表性的酶的葡萄糖异构酶产生的葡萄糖到果糖的生产中 报告有许多的菌株（60种以上），但是实用化的菌株只不过是链霉菌属(Streptomyces) 孢杆菌属(Bacillus)、游动放线菌属(Actinoplanes)、节杆菌属等少数的属中的应用。这 样，节杆菌属是具有食用实际成绩的安全性高的菌种。
[0096] [最佳pH和金属要求性]
[0097] 进一步，作为本发明的优势在于以下的事项。
[0098] 对于D-阿洛酮糖生产菌的最佳pH，假单胞菌属为7~9,根瘤菌属为9~9. 5, 土 壤杆菌属为7~8。另一方面，由本菌株产生的酶的最佳pH在6~8之间，即使在着色少的 7以下的pH也能够生产D-阿洛酮糖。
[0099] 另外，根据测定30分钟的酶活性得到的结果，报告了根瘤菌属时用Mn2+、Mg 2+会增 加活性，土壤杆菌属时用Co2+、Mn2+会增加活性。在本酶的情况下，发现通过Mn 2+和Co 2+会 增加活性。另外，由于通过Mg2+Xa2+也会增加活性，因此，通过使用了 Mg2+等的本菌株而能 够生产D-阿洛酮糖。
[0100] [菌株的来源和鉴定]
[0101] 本发明者们在许多分离的菌种中发现了产生新型酮糖3-差向异构酶的微生物 M30株，M30株通过基于16SrRNA基因碱基序列同源性的系统分析，判定属于球形节杆菌。
[0102] 菌株的鉴定
[0103] (I) 16SrRNA基因碱基序列同源性
[0104] 分析16SrRNA基因区域，并确定碱基数为734。
[0105] (2)同源性检索
[0106] 对于该菌株的16SrRNA基因的碱基序列，通过BLAST检索（日本DNA数据库）进行 与已知菌种的同源性检索。根据相对于上述确定了碱基数为734的碱基序列同源性为97% 以上的菌株名称和同源性（％)的值确定了 M30株的微生物为球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)〇
[0107] 本发明的作为具有酮糖3-差向异构酶活性的菌株的球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30在2011年6月22日保藏在位于千叶县木更津市上总镰足2_5_8的独立 行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，首先以受理编号NITE AP-Illl受 理，再作为保藏编号NITE P-Illl保藏。
[0108] 本发明中所说的酮糖是具有酮糖结构的六碳糖，具体来说，是指果糖、阿洛酮糖、 塔格糖以及山梨糖，D-或L-酮糖是指它们的D-体和L-体。
[0109] 本发明的酮糖3-差向异构酶具有将D-或L-酮糖的3位差向异构化从而生成对 应的D-或L-酮糖的活性，并催化D-或L-果糖与D-或L-阿洛酮糖之间的相互转换、以 及D-或L-塔格糖与D-或L-山梨糖之间的相互转换。本发明的酮糖3-差向异构酶是在 D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高的酶。本发明的酶可以由后述 的属于节杆菌属的微生物得到。
[0110] 本发明的酮糖3-差向异构酶可以通过培养属于节杆菌(Arthrobacter)属并具有 酮糖3-差向异构酶产生能力的微生物，从在培养液中繁殖的菌体中采集酮糖3-差向异构 酶来进行调制。作为属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物，例如可以有利地利用球形 节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30 (保藏编号NITE BP-1111)株以及它们的变异株 等。M30株的酮糖3-差向异构酶的产生能力比较高，在得到本发明的酶方面优选。M30株 于2012年5月2日请求从2011年6月22日原保藏于日本独立行政法人制品评价技术基 础机构专利生物保藏中心（日本千叶县木更津市东上总镰足2-5-8)的NITE P-Illl移管 至基于布达佩斯条约的保藏，并以保藏编号为NITE BP-Ill 1进行国际保藏。
[0111] [精制前的本酶的物理化学性质]
[0112] 精制前的酶、酮糖3-差向异构酶的活性可以通过将D-果糖作为底物并测定 D-阿洛酮糖的生成量来进行测定。具体来说，酶反应液组成使用50mM tris-HCl缓冲液 (ρΗ7· 0) 200ml、0· 2M D-果糖 375 μ 1、酶液 100 μ I、IOmM 氯化锰 75 μ 1，在 55°C 下反应 30 分 钟，煮沸2分钟以停止反应，通过HPLC测定反应后的液体组成。1单位的酶活性定义为在上 述条件下将D-果糖差向异构化，在1分钟内生成1 μ mol的D-阿洛酮糖的酶量。对于作为 逆反应的由D-阿洛酮糖差向异构化为D-果糖的酶单位也在同样的条件下进行测定并同样 地定义。
[0113] 本发明的酮糖3-差向异构酶存在具有下述物理化学性质的情况。
[0114] (a)最佳 pH
[0115] 在55°C下反应30分钟，ImM的二价钴离子（Co2+)存在下的条件下，为6. 0~10。
[0116] (b)最佳温度
[0117] 在pH7. 0下反应30分钟，ImM的二价钴离子（Co2+)存在下的条件下，为约50°C至 约 70°C。
[0118] (C) pH 稳定性
[0119] 在4°C下保持24分钟，至少在pH5. 5至11的范围内稳定。
[0120] (d)热稳定性
[0121] 在pH7. 0下保持10分钟，在ImM的二价钴离子（Co2+)存在的条件下，在约70°C以 下稳定；在ImM的二价钴离子（Co 2+)不存在的条件下，在约60°C以下稳定。
[0122] (e)通过金属