一种含硒活性多肽及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：：一种含硒活性多肽及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类含硒活性多肽及其制备方法，以及所述多肽在药物制备中的应用。
背景技术：
：芋螺是一类属于软体动物门(Mollusca)芋螺科(Conidae)海洋动物的总称，作为海洋"蜗牛"，其行动缓慢，捕猎食物主要是靠毒液的麻痹作用来征服猎物。芋螺具有进化良好的有毒器官，齿舌囊后方的液腺可分泌毒液。需要时带有毒液从吻部射出，致猎物迅速丧失反抗功能。芋螺毒液的研究始于20世纪50年代，60年代初进行了37种芋螺毒液对人的毒性研究，70年代发现地纹芋螺和织绵芋螺毒液的致死成分是蛋白质，并于1977年从地纹芋螺的毒液中分离出3个纯的多肽毒素。据称，每种芋螺均含50~200种毒素成分，有人推测理论上应有5万多种活性肽组分存在于芋螺毒液中。目前，从各种文献及专利资料中已经可见数百种分离或合成的芋螺毒素。80年代，对芋螺毒液进行了系统的研究结果提示，芋螺毒液中的不同组分在神经系统中具有特定的靶点或是阻断细胞膜中控制神经脉冲的不同的离子通道；或是阻断了在细胞间传递信号的神经递质的受体。芋螺肽毒素大多由10~30(8~42)个氨基酸残基组成，半胱氨酸含量非常高，而且含有2或3对保守的二硫键，据称芋螺毒素是迄今发现的最小的核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的生物肽。芋螺毒素生物学活性极强，已经发现的药理学作用靶点类型主要有电压依赖性离子通道，如Ca2+通道、Na+通道等；受体依赖型离子通道，如nAch受体、NMDA受体；以及其他类型的受体，如NE受体等。根据芋螺毒素成熟肽半胱氨酸残基间的二硫链键桥的特征性框架排列模式和芋螺毒素前体N端区域氨基酸的高度保守的信号肽序列，芋螺毒素可以分成A、M、O、P、S、T等多个超家族。在每个超家族中，再依据其作用靶位以及药理活性又可以划分出不同家族，如根据芋螺肽毒素的作用机制和靶位，可以分为(x、(0、la和5等药理学家族类型。镇痛药是国内外芋螺毒素研发的主要方向之一。据报道，在西方约有1/6的人口承受着疼痛病患的折磨，如脊柱损伤、偏头痛以及与关节炎、糖尿病、癌症相关的疼痛。现有的疼痛治疗药主要限于阿片类药物(吗啡及相关药物)和非甾体类抗炎药(NSAIDs)，前者存在严重的成瘾性副作用，而后者则对中度、重度疼痛无效，因此安全有效的新型镇痛药物的开发具有非常重要的意义。离子通道在痛觉生理机制具有重要作用，与痛觉传导相关的这些离子通道都有可能成为研发新的疼痛治疗药物的靶点。芋螺毒素co-MVIIA就是一类与疼痛相关的、具有高活性的选择性N型Ca2+通道阻断剂，Elan公司开发了合成类似物齐考诺肽(Ziccmotide,商品名Prialt)，分别于04年12月和2005年初获得美国FDA及欧盟(EC)的上市许可，用于治疗重度疼痛(与癌症或艾滋病相关的严重慢性炎症和神经疼痛)，这是第一个也是迄今唯一被FDA批准的芋螺毒素类药物。MVIIA的优点是镇痛效果极强，据称，其镇痛效价较吗啡强1000倍，并且不产生耐受和成瘾。作为第一个N-型VSCC阻断剂药物，MVIIA的出现对于那些无法控制甚至吗啡亦失去作用的疼痛患者是一个福音，对于提高这些患者的生活质量具有非常重要的意义。芋螺毒素co-MVIIA是一个由25个氨基酸组成的短肽，含6个半胱氨酸残基，由3三对二硫键连接形成具有活性的三级结构。氨基酸序列为Cys-Lys-Gly-Lvs-Gly-Ala-Lys-Cvs-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cvs-Cvs-Thr-Glv-Ser-Cvs-Arg墨Ser-Gly匪Lys-Cvs-NH，，三对二硫键的连接为Cysl-Cys16、Cys8-Cys20、Cysl5-Cys25。美国已上市的co-MVIIA采用多肽化学合成方法生产，由于三对半胱氨酸需要正确配对才能形成有活性的终产物，合成步骤多，工艺困难，成本高昂。另外，由于拥有3对二硫键，(D-MVIIA在机体内遇到谷胱甘肽、硫氧还蛋白及蛋白质二硫键异构酶等还原条件下将极不稳定，可能发生二硫键断裂或错配，而导致高级结构改变，活性下降甚至完全丢失，且失去高级结构的肽链更加容易被机体内的其它蛋白酶降解。co-MVIIA在人体内消除半衰期较短(tv2)为(4.6士0.9)h，可被内肽酶和肽链端解酶切开，进人体循环后可被存在于多种器官中的肽酶/蛋白酶溶蛋白性裂解，成为肽类片段或游离氨基酸。提高多肽4药物在机体内的稳定性，对于药物的临床应用十分的重要，也是现代多肽药物研发的一个重点方向。硒代半胱氨酸(Selenocysteine,Sec)是一种天然存在的氨基酸，被称为是第21种生物合成的组成蛋白质的氨基酸，多存在于硒蛋白或含硒酶(特别是抗氧化酶)的活性中心。与半胱氨酸(Cysteine,Cys)类似，也可形成类似于"二硫键"的"二硒键"，且具有类似于Cys的氧化还原性质，成为生物体内多种"氧-还酶"的活性中心。由于二硒键与二硫键的键能存在差异，硒氢基与巯基的氧化还原电动势有所不同，也就是说，二硒键的形成条件以及成键稳定性与二硫键有所不同。利用这一原理，通过控制氧化还原反应条件，可保证合成多肽中所含Sec和/或Cys配对成键的准确性，保证多肽的正确折叠，优化生产工艺。同时采用Sec替代Cys也可能提高多肽在还原条件下的稳定性，从而获得在机体内更加稳定有效的多肽药物。与原型co-MVIIA相比，本发明人惊奇发现，硒代类co-MVIIA肽具有更长的半衰期，因此可以相应地减少维持药效的给药剂量。
发明内容本发明的一个目的是提供一种含硒代半胱氨酸的活性多肽，所述活性多肽是一类芋螺毒素co-MVIIA的合成类似物，即，硒代拟w-MVIIA肽(Sec-MVIIA，简称为拟co-MVIIA肽)，所述拟co-MVIIA肽具有SEQIDNO.l所示的氨基酸序列SEQIDNO.1:XKGKGAKXSRLMYDXXTGSXRSGKX*其中，X所示氨基酸为C(Cysteine)和/或U(Selenocysteine)，且在所述序列中，(1)第l、16位，第8、20位，第15、25位的X，同时成对地为C或成对地为U;(2)第1、16位，第8、20位，第15、25位氨基酸X中，至少有一对同时为U;(3)在肽的三级结构中，第1与16，第8与20，第15与25位氨基酸U和/或C分别成对地形成二硒键和/或二硫键。*表示末端酰胺化或者为游离羧基末端。显然，本发明所述含硒代半胱氨酸的活性多肽是W-MVIIA的合成类似物，相当于以硒代半胱氨酸(Selenocysteine,Sec)取代co-MVIIA肽链中的半胱氨酸(Cysteine,Cys)，所述取代包括芋螺毒素co-MVIIA肽链中的至少一对半胱氨酸被硒代半胱氨酸所取代，由此，在蛋白质的三级结构中形成至少一对二硒健。本发明之拟co-MVIIA肽一般在C末端酰胺化，但也可以具有游离羧基端，或者在C末端连接其他的基团。更优选的是，本发明提供的拟co-MVIIA肽包括选自下列SEQIDNO.2~8序列所示的拟co-MVIIAS太A~G:N0.2:UKGKGAKCSRLMYDCUTGSCRSGKC*;(拟co-MVIIA肽A，[Sec1'16]MVIIA，co-MVIIA氨基酸序列中的第1位和16位半胱氨酸分别被硒代半胱氨酸所取代)N0.3:CKGKGAKUSRLMYDCCTGSURSGKC*;(拟co-MVIIA肽B，[Sec8"]MVIIA，co-MVIIA肽氨基酸序列中的第8位和20位半胱氨酸分别被硒代半胱氨酸所取代)N0.4:CKGKGAKCSRLMYDUCTGSCRSGKU*;(拟co-MVIIA肽C，[Sec15，25]MVIIA，co-MVIIA氨基酸序列中的第15位和25位半胱氨酸分别被硒代半胱氨酸所取代)NO,5:UKGKGAKUSRLMYDCUTGSURSGKC*;(拟co-MVIIA肽D，[Sec1'16'8'20]MVIIA，co-MVIIA氨基酸序列中的第1位和16位、第15位和25位半胱氨酸分别被硒代半胱氨酸所取代)N0.6:CKGKGAKUSRLMYDUCTGSURSGKU*;(拟co-MVIIA肽E，[Sec8'2Q'15'25]MVIIA，to-MVIIA氨基酸序列中的第8位和20位、第15位和25位半胱氨酸分别被硒代半胱氨酸所取代)NO.7:UKGKGAKCSRLMYDUUTGSCRSGKU*;(拟co-MVIIA肽F，[Sec"6'"'25]MVIIA，co-MVIIA氨基酸序列中第1位和16位、第15位和25位半胱氨酸分别被硒代半胱氨酸所取代)N0.8:UKGKGAKUSRLMYDUUTGSURSGKU*。(拟co-MVIIA肽G，[Sec1'16'8'2°'15'25]MVIIA，co-MVIIA氨基酸序列中第1位和16位、第8位和20位、第15位和25位半胱氨酸分别被硒代半胱氨酸所取代)以上多肽序列中，第1和16位、8和20位、15和25位的氨基酸残基之间分别形成三对二硫键和/或二硒键。更为优选的序列是以硒代半胱氨酸取代o)-MVIIA肽的氨基酸序列中一对半胱氨酸所形成的序列，如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDN0.4所示的序列。本发明的另一个目的在于提供含有本发明所述活性肽的药物组合物，其含有本发明的拟a)-MVIIA肽以及药学上可接受的载体和/或稀释剂，本发明的药物组合物可以根据需要制备成适宜的剂型。本发明的也提供拟o)-MVIIA肽的制备方法。本领域技术人员可以理解，在本发明上述氨基酸序列的基础上，可以采用各种本领域已知的方法制备本发明的肽，例如人工合成氨基酸序列、基因工程重组DNA载体的表达等等。优选的制备方法为固相合成方法，包括线性肽的合成、线性肽的折叠和纯化步骤。线性肽的合成采用Boc原位化学固相合成法，基于多肽化学合成原理，由HBTU作为縮合剂，以Boc氨基酸开始合成，合成步骤参考固相合成手册。线性肽的折叠反应在pH4.0~8.5的0.1M甲酸铵溶液中进行，更优选的溶液pH值为4.5禾卩8.3.固相合成硒代芋螺毒素多采用HPLC分析鉴定。圆二色光谱鉴定显示拟co-MVIIA肽的二硫键配对方式及P-折叠与芋螺毒素co-MVIIA相似，表明拟co-MVIIA肽的三级结构保持了近似于芋螺毒素co-MVIIA的活性结构。蛋白质的氧化复性是一个复杂的过程，有可能形成二硫键配对的方式不同的多种类型的分子构像。只有呈正确折叠构象形式时多肽才具有其生物活性。因此合成多肽的氧化复性过程是影响多肽产物活性的关键步骤。本发明利用二硒键与二硫键键能的差异，设计了采用硒取代半胱氨酸(Selenocysteine,Sec)代替硫代半胱氨酸(Cysteine，Cys)而形成的拟co-MVIIA肽。从而通过控制氧化还原反应条件，保证合成多肽中所含Sec和/或Cys配对成键的准确性。本发明的再一目的在于提供上述多肽的用途，本发明获得的硒代拟co-MVIIA衍生物具有生物活性，具有镇痛作用。固相合成的拟co-MVIIA肽作用于瞬时表达L、N、P/Q、R四种亚型电压依赖性钙通道的HEK293细胞，可选择性地抑制N型钙通道电流，显示拟co-MVIIA肽可作为一种潜在的N型电压依赖性钙通道阻断剂发挥镇痛作用。大鼠体内代谢试验显示，拟co-MVIIA肽在大鼠体内的半衰期较芋螺毒素(o-MVIIA明显延长。因此本发明所获得的拟G)-MVIIA肽可以进一步应用于制备无成瘾性镇痛药物。与芋螺毒素co-MVIIA相比，本发明之拟co-MVIIA肽折叠正确率提高，多肽稳定性更好，对N型钙道电流的抑制，其作用更为明显，且具有更长的半衰期，可以相应地减少维持药效的给药剂量。与芋螺毒素co-MVIIA采用的多肽化学合成方法相比较，本发明之拟(o-MVII肽采用多肽固相化学合成的方法制备，质量稳定、成本较低。图1是芋螺毒素o)-MVIIA和拟co-MVIIA肽圆二色光谱鉴定CD图谱；图2是拟co-MVIIA肽对表达的N型通道激活的钙电流的影响分析图；图3是拟co-MVIIA肽对表达的非N型通道的影响分析图。具体实施例方式以下结合实例进一步阐述本发明，将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本
发明内容，但应当理解，列举的实施例仅起说明作用，而不以任何形式限制本发明。实施例1[Sec1，16]MVIIA的合成(拟co-MVIIA肽A)(1)固相合成根据拟①-MVIIA肽[Sec1，16]MVIIA氨基酸序列，应用Boc固相化学合成法，采用HBTU作为偶合试剂及Boc-氨基酸(Sigma)，MBHA(4-methylbenzhy-drylamine)树月旨(AdvancedTechnology&Industrial公司)进行人工合成。Boc-Sec(MeBzl)-OH的合成5g硒代半胱氨酸(Sigma)加入20ml1MNaOH溶液中，0。C搅拌，同时加入20ml0.8M的硼氢化钠溶液，约40分钟。用冰醋酸调节pH至7.0。1.5ga-溴代二甲苯溶解于20ml乙醇，滴加入前步反应液中，0'C反应2.5小时。6M盐酸调节pH至2，得到白色沉淀即得4-苯甲基-L-硒代半胱氨酸。4-苯甲基-L-硒代半胱氨酸4g与K2C034.5g混合溶于30ml水中，加入3.2g叔丁氧羰基-碳酸氢钠室温搅拌1.5小时，后加水150ml。二乙醚洗两次后，水层用柠檬酸调ph为4.0。等体积乙酸乙酯萃取三次，10%柠檬酸溶液洗三次，过滤，真空干燥得Boc-Sec(MeBzl)-OH。肽链树脂的裂解，用HF/对甲(苯)酚/对甲苯硫酚(18:1:1，体积比)溶液作用多肽，(TC反应约2.5小时，真空除去HF，冷乙酸乙酯洗涤沉淀即得粗品。(2)二硒键/二硫键形成及肽链折叠所得粗品溶于400ml0.1M甲酸铵，50%异丙醇溶液中，pH值4.34.8氧化，二硒键形成。此后用0.01MMH4OH溶液调节pH值至8.08.5，进一步氧化，使二硫键形成。定时从反应液中取样，HPLC法分析。氧化结束调节pH值23。真空除去异丙醇，通过RP-HPLC法纯化多肽，可获得纯度98%的正确折叠的拟co-MVIIA肽A，比co-MVIIA复性有效率提高10%以上。实施例2合成[Sec8,2。]、[Sec15,25]、[Sec1，16,8,20]、[SecU6'15'25]、[Sec8,20,15,25]、[Seci,i6,8,20,15,25]MvnA(拟。-MVIIA肽B、C、D、E、F、G)根据拟co-MVIIA肽[Sec8'2°]、[Sec15'25]、[SeC''16，8'2°]、[Sec1'16'15'25]、[Sec8'20'15'25],[Sec"6'8'2o"'25]MVIIA序列，按照实施例l所述合成、成键、折叠步骤制备所述拟①-MVIIA肽。实施例3拟(o-MVIIA肽分子量测定拟co-MVIIA肽纯化冻干，Bruker公司BIFLEX型MALDI-TOF-MS进行分子量测定。结果显示，以硒代半胱氨酸(Sec)取代一对半胱氨酸(Cys)的拟co陽MVIIA肽([Sec1'16]MVIIA、[Sec8'20]MVIIA、[Sec15'25]MVIIA)分子量为2732.61Da，与理论分子量2733.02Da相符。提示构成co-MVIIA的6个半胱氨酸中有两个半胱氨酸被硒代半胱氨酸所取代。实施例4拟oMVIIA肽氨基酸序列的测定采用ABIProcise491型蛋白质测序仪，用标准Edman降解方法测序。本发明之拟co-MVIIA肽氨基酸序列为(A)SecLysGlyLysGlyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspCysSecThrGlySerCysArgSerGlyLysCys*(B)CysLysGlyLysGlyAlaLysSecSerArgLeuMetTyrAspCysCysThrGlySerSecArgSerGlyLysCys*(C)CysLysGlyLysGlyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspSecCysThrGlySerCysArgSerGlyLysSec*(D)SecLysGlyLysGiyAlaLysSecSerArgLeuMetTyrAspCysSecThrGlySerSecArgSerGlyLysCys*(E)CysLysGlyLysGlyAlaLysSecSerArgLeuMetTyrAspCysSecThrGlySerSecArgSerGlyLysSec*(F)SecLysGlyLysGiyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspSecSecThrGlySerCysArgSerGlyLysSec*(G)SecLysGlyLysGiyAlaLysSecSerArgLeuMetTyrAspSecSecThrGlySerSecArgSerGlyLysSec*以上序列中，Sec代表硒代半胱氨酸，*表示肽链末端酰胺化。实施例5拟co-MVIIA肽的圆二色光谱鉴定在25t:下，分别将芋螺毒素co-MVIIA、拟(o-MVIIA肽水溶液置于0.1cm石英比色皿中，日本JASCOJ—810圆二色谱仪190250nm扫描。图1为co-MVIIA、拟co-MVIIA肽A的CD图谱。可见拟co-MVIIA肽A二硫键配对方式及(3-折叠与co-MVIIA相似，拟co-MVIIA肽A的三级结构未发生变化。实施例6拟co-MVIIA肽的^-NMR检测美国VarianINOVA!H-NMR(500MHz，D20)结果如表1所示，co-MVIIA中半胱氨酸(Cys)经硒代半胱氨酸(Sec)取代后([Sec1，16]MVIIA)，与-SeH相连的-CH2中氢化学位移发生改变。表1.拟co-MVIIA的'H-NMR谱图数据<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例7拟co-MVIIA肽的镇痛药效学作用CI)小鼠醋酸扭体法镇痛试验将小鼠随机分为空白对照组和不同剂量用药组。每组10只。采用侧脑室注射给予不同剂量药物，空白对照组给予等体积生理盐水。30分钟后，给各组小鼠腹腔注射新配制的0.6%的醋酸溶液0.4ml。5分钟后，记录随后15分钟内小鼠的扭体次数。扭体判别标准小鼠腹部内凹，躯干与后腿伸张，臀部高起。正常小鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液后，因醋酸对腹膜的刺激而产生腹痛，主要表现为扭体、收腹等症状。阳性对照药与拟a)-MVIIA肽A、B、C、D、E、F(icv)以处理，均能使小鼠扭体发生率减少，有很好的剂量相关性。在0.1、0.2、0.4、0.8、1.6)ug'kg"剂量范围内，①-MVIIA的扭体发生率减少8.5~80.7%，而A、B、C、D、E、F组小鼠扭体发生率减少10.8-90.9%,16.4~89.9%,30.6~95.9%,18.1~86,0%,15.387.9%，13~93.7%。提示拟co-MVIIA肽在小鼠醋酸扭体模型上具有很强的镇痛作用，且镇痛活性高于co-MVIIA。表2.拟co-MVIIA肽对醋酸扭体模型小鼠的镇痛作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>与生理盐水组比较，*P<0.05**P<0.01与w-MVIIA组比较，AP<0.05AAP<0.01(2):小鼠55'C热板法测痛试验昆明种小鼠，雌性。首先测定每只小鼠的基础痛阐，即从小鼠四肢与55'C热板台面接触到小鼠第一次出现舔后足的时间(s)。剔除基础痛闽值小于5秒或大于30秒的小鼠。将符合条件的小鼠随机分为空白对照组和不同剂量的给药组。每组10只。给药组分别侧脑室注射不同剂量的药物，空白对照组给予等体积生理盐水0.5、1、1.5、3、6小时后，再次测痛，比较给药前后小鼠对热板耐受时间的变化，计算出给药后的可能最大镇痛百分率(PMAP)，评价药物的镇痛效果。PMAP(%)K给药后痛阈-基础痛阈)/(60s-基础痛)预先给予盐水后小鼠痛阈无显著差异。阳性对照药与类似物以(O.l、0.2、0.4、0.8、1.6吗'kg-l，icv)处理，小鼠的PMAP均呈剂量依赖性的提高。与盐水组比较，具有显著性差异(表3)。提示拟co-MVIIA肽在小鼠55i:热板测痛模型上具有很强的镇痛作用，且镇痛活性高于co-MVnA。表3.拟oMVIIA肽对55'C热板模型小鼠的镇痛作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与生理盐水组比较，*P<0.05**P<0.01(3):对HEK293细胞瞬时表达的钙通道的影响本实验采用膜片钳全细胞记录方式，通过对瞬时表达各种高电压激活的钙通道的HEK293细胞进行研究，明确了类co-芋螺毒素肽作用的离子通道靶标及选择性。本研究又采用脂质体转染方法，将钙通道al亚基(odC(L)、alB-lN、alA-2(P/Q)或cdE-3(R))分别与a2bS、卩lb亚基同时混合转染HEK293细胞，成功地瞬时表达了L、N、P/Q、R四种钙通道亚型。该部分研究采用5mMBa2+作为负载离子进行钙通道钡电流(IBa)记录。i)质粒转染HEK293细胞用含10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100吗/ml链霉素的DMEM培养基，置于含5%C02的37'C孵箱中培养，采用胰蛋白酶消化法进行细胞传代。混合质粒包括一种钙通道al亚基(alC(L型)、alB-l(N型)、alA-2(P/Q型)或alE-3(R型))、钙道道a2b5、pib亚基以及pEGFP-Cl质粒，四者按摩尔比1:1:1:0.3混合。细胞转染采用脂质体Lipofectamin2000(Invitrogen，Inc.)转染试剂，严格按照转染试剂说明书进行操作。转染后24-72小时的细胞用于膜片钳实验。ii)全细胞膜片钳实验该部分研究采用5mMBa2+作为负载离子进行钙通道钡电流(IBa)记录。所有实验均在室温(20'C)下进行，将培养或急性分散的细胞先用细胞外液漂洗2次，并加入1.5ml细胞外液。在倒置相差显微镜下，通过微操纵仪将充灌电极内液的记录电极轻轻压向细胞表面。当封接阻抗增加时，再使电极稍稍下降，并迅速通过记录电极内部施加适当负压，使电极和细胞表面形成紧密封接。在此基础上继续施加负压或用Zap的短时电脉冲破膜，即形成全细胞记录方式。全部数据采用pCLAMP8.2软件的Clmaptfit程序进行分析处理。实验结果i)拟co-MVIIA肽对HEK293细胞瞬时表达的钙通道的的影响结果如图2所示，与co-MVIIA组比较，*P<0.05**P<0.01。结果表明，在瞬时表达N型电压依赖性钙通道的HEK293细胞上，0.01、0.1、lpM拟co-MVIIA肽A、B、C对表达的N型钙通道高电压激活的钡电流(HVAIBa)均具有抑制作用；随着浓度增加，拟co-MVIIA肽A、B、C对N型HVAIBa的抑制作用增强；在lpM时，N型HVA几乎全部被类似物抑制。在0.1^iM、0.01iaM和时，拟Q)-MVIIA肽A、B、C对N型HVAIBa的抑制率均显著大于齐考诺肽。结果提示，拟co-MVIIA肽A、B、C可抑制N型钙通道电流，对N型钙通道电流的抑制，拟co-MVIIA肽的作用更为明显。ii)拟co-MVIIA肽对表达的非N型钙通道的影响结果如图3所示。结果表明，在lpM时，N型电流几乎完全被类似物抑制，但瞬时表达L、P/Q、R型钙通道的HEK293细胞给予l|iM类似物以后，上述钙通道HVAIBa的电流密度无明显变化(P〉0.05)，说明在lpM时，拟co-MVIIA肽对瞬时表达的L、P/Q、R型钙通道无明显影响。结论通过上述研究，可见拟co-MVIIA肽可选择性地抑制N型,丐通道电流，可作为一种潜在的N型电压依赖性钙通道阻断剂发挥镇痛作用。C4)脑组织中半衰期实验采用氯胺T法以1251分别标记co-MVIIA、拟co-MVIIA肽A、B、C。用C18柱分离纯化^I标记物，收集单碘标记的各种化合物，分别测定放射比活性、放化纯度，标记物中加入5%海藻糖冻干，于-2(TC保存。实验时按一定比例混合1251标记的药物和生理盐水溶解的未标记的药物，配制成一定浓度的溶液供注射用，放射性浓度均为50^iCi/mL。Wistar大鼠60只，雌雄各半，随机分成10组，采用脊髓鞘内套管给药2(ig/kg，给药后于O.l、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24h分别处死一组动物，取脑组织用超纯水按1:5的比例制成匀浆，取400iaL测定总放射性，将放射性计数分别换算成拟co-MVIIA肽A、B、C的含量。每一时间点取6只动物，雌雄各半。将以上浓度-时间实验数据用3P97药代计算程序进行数据处理，计算脑组织中的消除半衰期。结果表明，拟co-MVIIA肽A、B、C单剂量脊髓鞘内套管给药后，在脑组织中的消除半衰期t,/2平均为7.06h、6.2h、8.5h,均比co-MVIIA的消除半衰期t^4.6h有明显的延长。08P103358.ST25.txtSEQUENCELISTING<110>深圳海王药业有限公司〈120〉一种含硒活性多肽及其制备方法与应用〈130〉SZ85-08P103358〈160〉8<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉25〈212〉PRT<213〉Artificial(人工序列)<220>〈221>misc一feature<222>(1)..(25)〈223〉X=Selenocysteine(U)orX=Cysteine(C)〈400〉1XaaLysGlyLysGlyAlaLysXaaSerArgLeuMetTyrAspXaaXaa1''51015ThrGlySerXaaArgSerGlyLysXaa2025<210>2<211>25<212〉PRT<213〉Artificial(人工序列)〈220〉〈221〉misc—feature〈222>(1)..(25)〈223〉X=Selenocysteine(U)〈400〉21508P103358.ST25.txtXaaLysGlyLysGlyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspCysXaa1'51015ThrGlySerCysArgSerGlyLysCys202^<210>3<211〉25〈212〉PRT<213>Artificial(人工序列)<220><221>misc—feature<222>(1)..(25)〈223〉X=Selenocysteine(U)<400〉3CysLysG1yLysGlyAlaLysXaaSerArgLeuMetTvrAspCysCys1'51015ThrGlySerXaaArgSerGlyLysCys2025<210〉4〈211>25〈212>PRT<213〉Artificial(人工序列)〈220〉<221〉misc—feature〈222>(1)..(25)<223〉X=Selenocysteine(U)〈400〉4CysLvsGlyLysGlyAlaLysCvsSerArgLeuMetTvrAspXaaCysr''51015ThrGlySerCysArgSerGlyLysXaa2025〈210〉5<211>25<212>PRT08P103358.ST25.txt<213>Artificial(人工序列)〈220〉<221〉misc一feature<222〉(1)..(25)<223〉X=Selenocysteine(U)<400>5XaaLysGlyLysGlyAlaLysXaaSerArgLeuMetTyrAspCysXaa1''51015ThrGlySerXaaArgSerGlyLysCys20'2^<210〉6<211>25<212>PRT<213>Artificial(人工序列)〈220><221>misc_feature〈222>(1)..(25)<223>X=Selenocysteine(U)〈400〉6CysLysGlyLysGlyAlaLysXaaSerArgLeuMetTyrAspXaaCys151015ThrGlySerXaaArgSerGlyLysXaa2025<210〉7〈211>25〈212>PRT<213〉Artificial(人工序列)<220>〈221>raise—feature〈222〉(1)..(25)<223〉X=Selenocysteine(U)〈400>708P103358.ST25.txtXaaLysGlyLysGlyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspXaaXaa1':51015ThrGlySerCysArgSerGlyLysXaa2b25<210〉8<211〉25<212>PRT<213>Artificial(人工序列)〈220〉<221〉raise—feature<222>(1)..(25)<223>X=Selenocysteine(U)<400〉8XaaLysGlyLysGlvAlaLysXaaSerArgLeuMetTyrAspXaaXaa151015ThrGlySerXaaArgSerGlyLysXaa202518权利要求1、一种含硒活性多肽，其特征在于其具有如SEQIDNO.1所示的序列，并且在所述序列中，(1)第1、16位，第8、20位，第15、25位的X，成对地为半胱氨酸或成对地为硒代半胱氨酸；(2)第1、16位，第8、20位，第15、25位氨基酸X中，至少有一对同时为硒代半胱氨酸；并且(3)当形成肽的三级结构时，第1与16，第8与20，第15与25位的半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸分别成对地形成二硒键和/或二硫键。2、如权利要求1所述的含硒活性多肽，其特征在于所述肽具有选自下述的氨基酸序列SEQIDN0.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7。3、权利要求1所述的含硒活性多肽，其特征在于所述肽链羧基末端酰胺化。4、含有权利要求1所述的含硒活性多肽的药物组合物。5、一种制备权利要求1所述的含硒活性多肽的方法，包括以下步骤1)根据含硒活性多肽的氨基酸序列，合成线性肽；2)将步骤1)所得的线性肽在pH4.08.5的0.1M甲酸铵溶液中进行肽链的折叠，形成二硒键；3)分离并纯化步骤2)获得的肽，得到权利要求l所述多肽。6、如权利要求5所述的制备方法，其中采用固相合成法合成步骤l)中的线性肽。7、权利要求1所述的含硒活性多肽在制备与N型钙通道阻断剂相关的药物中的应用。8、权利要求7所述的应用，其中所述药物为镇痛药物。全文摘要本发明涉及一种含硒代半胱氨酸的活性多肽、其合成方法及其在镇痛药物制备中的用途。所述多肽具有SEQIDNO.1～8的氨基酸序列，采用多肽固相化学合成的方法制备，质量稳定、成本较低，所述肽具有极强的镇痛活性和结构稳定性，作为无成瘾型的镇痛药物具有良好的开发前景。文档编号C07K14/00GK101602796SQ200810067718公开日2009年12月16日申请日期2008年6月13日优先权日2008年6月13日发明者琳于,冯汉林,吴筱昆,张丽娟,徐安龙,丹朱,兵王,赵金华申请人:深圳海王药业有限公司