专利名称：非酰胺化ω－芋螺毒素M ⅦA 及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程，涉及构建ω-芋螺毒素M VIIA(ω-CTX M VIIA)基因真核表达质粒，制备非酰胺化ω-CTX M VIIA的方法，以及在制备镇痛药物中的应用。
背景技术：
芋螺毒素(conotoxin，CTX)是从海洋腹足纲软体动物芋螺(conus)中得到的一类具有生物活性的肽类毒素，至今已有50000余种。一般含10～30个氨基酸，大多富含二硫键，按其作用靶位及药理学活性，可分为α，ω，μ等家族。ω-芋螺毒素(ω-CTX)是由24～29个氨基酸、3对二硫键构成的刚性小肽，是芋螺毒素中最重要的毒素。由于ω-CTX具有高亲和力、高度专一性的特点，它能特异性地阻断电压敏感型钙离子通道(Voltage sensitive calciumchannel，VSCC)，在离子通道亚型鉴定、神经疾病治疗方面发挥重要作用，已成为神经生物学、分子生物学、多肽化学、药物药理学等领域的研究热点。
目前研究的最多的ω-CTX是M VIIA，由25个氨基酸组成，其中羧基端的Cys为酰胺化的结构，其氨基酸序列为CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC-NH2*(含6个半胱氨酸残基，形成三对交叉二硫键，即二硫键连接方式为C1-C16，C8-C20，C15-C25；*羧基端的Cys为酰胺化)；研究证明它具双重效应，一方面阻断痛觉传递而具镇痛效应，另一方面抑制刺激毒性(excitotoxic)神经递质释放，阻止神经元细胞病理性钙内流而有神经保护作用。因其直接作用于钙通道，无需第二信使或G蛋白，故不成瘾，可用于治疗慢性重症疼痛(如晚期恶性肿瘤和AIDS病等引起的顽痛)。
目前，化学合成的ω-CTX M VIIA，已在美国由FDA批准上市，但由于ω-CTX M VIIA的分子结构复杂，分子中有6个半胱氨酸(Cys)需要准确配对形成二硫键，需要20多步反应，得率很低，工艺十分困难，质量不稳定，而且成本很高。因此，寻找一种合适的方法获得ω-芋螺毒素M VIIA成为需要。
发明内容
本发明的目的是提供多肽有机化合物非酰胺化ω-芋螺毒素M VIIA，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys 25该多肽分子中Cys1与Cys16、Cys8与Cys20、Cys15与Cys25分别形成三对二硫键；C-端为非酰胺化Cys。
本发明的另一个目的是利用基因工程方法构建ω-芋螺毒素M VIIA(ω-CTX M VIIA)基因真核表达质粒，制备非酰胺化ω-CTX M VIIA的方法，直接获得目的小肽，本发明通过以下技术方案实现(1)编码ω-CTX M VIIA的DNA片段的设计与合成根据已知的ω-CTXM VIIA氨基酸序列，按毕赤酵母偏爱密码子设计寡核苷酸片断(CTX1和CTX2)，5’端添加Xho I酶切位点及编码Lys-Arg的序列并磷酸化，3’端添加TAA终止密码子及EcoR I酶切位点；(2)表达载体的构建对毕赤酵母表达载体pPIC9进行Xho I/EcoR I双酶切，将退火生成的编码非酰胺化的ω-CTX M VIIA的基因片段连接到pPIC9上，构建成重组表达质粒pPIC9-CTX。对其分别进行PCR和双酶切，用琼脂糖电泳鉴定(参见图2、3)，对克隆2 pPIC9-CTX测序结果表明编码非酰胺化的ω-CTX M VIIA的DNA序列已正确的插入到pPIC9中。
(3)毕赤酵母中表达载体的转化取5～10μg去除了RNA的重组表达载体，经Sal I单酶切线性化，乙醇沉淀回收后以电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD和MM平板上筛选转化子，所用电转仪为Bio-Rad GenePulser，转化条件为电压1500V，电容25μF，电阻200Ω；(4)基因表达毕赤酵母基因表达宿主菌选用GS115，挑取单克隆Mut+型菌落，按照Invitrogen公司提供的操作手册的GS115(Mut+)所介绍的发酵方法进行摇瓶发酵，定期取样，以18％SDS-PAGE检测目的基因的表达水平。
本发明的又一个目的是提供的非酰胺化ω-CTX M VIIA在制备镇痛药物中的应用。
本发明的特点是用基因工程技术，在毕赤酵母中成功地表达了非酰胺化的ω-CTX M VIIA；这种方法可以生产新型的非酰胺化的ω-CTX M VIIA，制备工艺简单稳定，每升发酵液可得到约36mg非酰胺化的ω-CTX M VIIA，生产成本较低；动物实验证明这种新型的非酰胺化的ω-CTX M VIIA具有很高的镇痛活性，其镇痛效力大概是吗啡的900倍(按摩尔镇痛强度比较)，可用于镇痛药物的开发。
图1、真核表达载体pPIC9-CTX的构建。
图2、PCR产物的琼脂糖电泳分析图。
图3、重组子的双酶切产物的琼脂糖电泳分析图。
图4、克隆2测序结果。
图5、PCR产物的琼脂糖电泳图。
图6、用SDS-PAGE筛选高表达菌株的电泳图。
图7、非酰胺化的ω-CTX M VIIA离子交换纯化图。
图8、非酰胺化的ω-CTX M VIIA纯化组分的SDS-PAGE图。
图9、ELISA鉴定目的蛋白非酰胺化的ω-CTX M VIIA。
图10、MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定非酰胺化的ω-CTX M VIIA。
图11、小鼠热板镇痛试验用药时间-痛域提高百分率折线图。
图12、大鼠热尾试验用药时间-痛域提高百分率折线图。
具体实施例方式
本发明结合实施例及附图作进一步说明。
1.材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌株与质粒毕赤酵母GS115、真核表达载体pPIC9购自Invitrogen公司。
1.1.2工具酶与化学试剂各种限制性内切酶及其他工具酶购自上海生工公司，其他各种试剂均为国产分析纯。
1.1.3动物雌性NIH小鼠、雄性Sprague-Dawley大鼠均购自浙江省医学科学院动物中心。
1.2方法1.2.1编码ω-CTX M VIIA的DNA片段的设计与合成根据已知的ω-CTXMVIIA氨基酸序列，按毕赤酵母偏爱密码子设计寡核苷酸片断(CTX1和CTX2)，5’端添加Xho I酶切位点且磷酸化及编码Lys-Arg的序列，3’端添加TAA终止密码子及EcoR I酶切位点，由上海生工生物工程公司合成(见表1)。
表1、斜体有下划线的序列为Xho I和EcoR I酶切位点，黑体为编码Lys-Arg的序列，taa是终止密码子。
将CTX1与CTX2等摩尔混合，加热至90℃，自然冷却至室温，即形成编码ω-CTX M VIIA的DNA片段。
1.2.2表达载体的构建对毕赤酵母表达载体pPIC9进行Xho I/EcoR I双酶切，将退火生成的编码ω-CTX M VIIA的DNA片段连接到pPIC9上，构建成重组表达质粒pPIC9-CTX(参见图1)，对其分别进行PCR和双酶切鉴定。
1.2.3DNA测序送样上海生工生物工程公司测定。
1.2.4毕赤酵母中表达载体的转化取5～10μg去除了RNA的重组表达载体，经Sal I单酶切线性化，乙醇沉淀回收后以电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD和MM平板上筛选转化子，所用电转仪为Bio-Rad GenePulser，转化条件为电压1500V，电容25μF，电阻200Ω。
1.2.5重组转化子的PCR法鉴定以重组酵母的基因组为模板，用AOX1-up和AOX1-down为引物，按照Invitrogen公司提供的操作手册进行PCR。
1.2.6基因表达及高产菌株的筛选毕赤酵母基因表达宿主菌选用GS115，挑取单克隆Mut+型菌落，按照Invitrogen公司提供的操作手册的GS115(Mut+)所介绍的发酵方法进行摇瓶发酵，定期取样，以18％SDS-PAGE检测目的基因的表达水平。
1.2.7表达产物浓度的测定按照Bradford法测定蛋白质含量。
1.2.8表达产物的纯化发酵液离心取上清，相对分子质量为1000的透析袋对pH6.0的0.02M的乙酸钠透析，透析液采用弱阳离子交换柱层析，收集分离峰进行电泳测定纯度。
1.2.9 ELISA鉴定目的蛋白由于目的蛋白是小肽，分子量较小，故用常规的包被方法不能包被到酶标板上，故我们采用PLL交联的方法包被极性小分子蛋白[4]。共设空白对照组、样品组(高、中、低三个浓度)四组，每组含5个复孔。一抗为本实验室自己制备的特异性抗ω-CTX MVIIA多抗，二抗则是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗血清。TMB显色系统显色10min，0.5mol/LH2SO4终止反应，双波长(450nm，630nm)测定OD值。
1.2.10非酰胺化的ω-CTX M VIIA的质谱鉴定 将纯化收集液冻干送至中科院上海生化细胞所，通过MALDI-TOF-MS做分子量鉴定。
1.2.11生物活性的检测①经典热板镇痛法检测其生物学活性。健康雌性NIH小鼠，体重18～22g，调节恒温水浴55±0.5℃，将小鼠置热板上，挑选5～20s内有舔后足动作或抬后足并回头(痛觉反应)的动物为合格动物，该反应时间为药前正常痛域值，挑选合格动物60只，随机分成6组，采用侧脑室给药。空白对照组给予等量生理盐水，阳性对照组分别给予低剂量的吗啡(25μg/kg)和高剂量的吗啡(125μg/kg)，实验组1、2、3分别给予1.5μg/kg、0.75μg/kg、0.25μg/kg的非酰胺化的ω-CTX M VIIA蛋白。药后0.5h、1h、2h、3h重复上述测定，记录痛觉反应时间。按公式计算痛域提高的百分率痛域提高百分率＝(用药后平均痛域值T2-用药前平均痛域值T1)/用药前平均痛域值T1*100％。
②大鼠热尾法(Hot-tail flick)检测生物学活性。健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250±20g，侧脑室埋管，每日注射青霉素，饲养一周后进行药理试验。调节恒温水浴55±0.5℃，给药半小时测痛域。正常鼠痛域一般为2s，痛域5s为完全镇痛。挑选合格动物30只，随机分成6组，通过套管给药。空白对照组给予等量生理盐水，阳性对照组分别给予低剂量的吗啡(25μg/kg)和高剂量的吗啡(125μg/kg)，实验组1、2、3分别给予2.0μg/kg、1.2μg/kg、0.4μg/kg的非酰胺化的ω-CTX M VIIA蛋白。给药后0.5h、1h、2h、3h重复上述测定，记录痛觉反应时间，按公式计算痛域提高的百分率，计算方法同前。
2结果2.1表达载体的构建对毕赤酵母表达载体pPIC9进行Xho I/EcoR I双酶切，将退火生成的编码非酰胺化的ω-CTX M VIIA的基因片段连接到pPIC9上，构建成重组表达质粒pPIC9-CTX。对其分别进行PCR和双酶切，用琼脂糖电泳鉴定(参见图2、3)，图2中，1代表克隆1 PCR产物，2代表克隆2 PCR产物，3代表克隆3 PCR产物，4代表pPIC9 PCR产物，5代表pPIC9，M、小分子DNA分子量标准。图3中1为克隆1双酶切产物；2为克隆2双酶切产物；3为克隆3双酶切产物；4为pPIC9双酶切产物；M为小分子DNA分子量标准。对克隆2 pPIC9-CTX测序结果表明编码非酰胺化的ω-CTX MVIIA的DNA序列已正确的插入到pPIC9中，参见图4，图4为克隆2测序结果。DNA序列317 to 391，TGT AAA GGT AAA GGT GCT AAA TGT TCT CGT CTT ATGTAT GAT TGT TGT ACT GGT TCT TGT CGT TCT GGT AAA TGT，为编码非酰胺化ω-CTX M VIIA的结构基因。
2.2表达载体的转化和鉴定通过电穿孔的方法共得到107个克隆，先后涂于MM、MD平板筛选Mut+型，有102个克隆在两种平板上长势较好，用来筛选高表达菌株。由PCR结果可知重组转化子1、2均有一条带与质粒pPIC9-CTX一致，且还有一个在2200bp左右处的条带，充分说明目的基因CTX已经同源重组整合到酵母GS115基因组中为Mut+型，但是重组转化子3在2200bp处没有条带，说明在转化过程中，载体中AOX1的存在破坏了野生型AOX1基因，即为Muts型，参见图5，图5是PCR产物的琼脂糖电泳图，左起1为质粒pPIC9-CTX；2为重组转化子1；3为重组转化子2；4为重组转化子3；M为DNA分子量标准。
2.3基因表达及高表达菌株的筛选各Mut+转化子经摇瓶发酵培养96h后的上清经18％SDS-PAGE检测，发现第6号克隆表达产物条带颜色相对较深，初步定为高表达菌株，参见图6，图6是用SDS-PAGE筛选高表达菌株的电泳图，左起1为重组转化子1表达上清；2为重组转化子2表达上清；3为重组转化子3表达上清；4为重组转化子4表达上清；5为重组转化子5表达上清；6为重组转化子6表达上清。采用Bradford法测定表达的非酰胺化的ω-CTXMVIIA蛋白产量，约为每升发酵液36mg。
2.4表达产物的纯化电泳图谱经计算机灰度扫描，非酰胺化的ω-CTXMVIIA表达量约占毕赤酵母分泌总蛋白量的60％左右。表达上清经透析除盐后过弱阳离子交换柱，收集洗脱峰，参见图7，其中——代表280nm的检测曲线，-----为215nm的检测曲线，……代表电导值检测曲线。18％SDS-PAGE鉴定纯化效果参见图8，左起1为纯化的非酰胺化的ω-CTX MVIIA；2为克隆6表达上清穿透液；3为克隆6表达上清；M为小分子蛋白分子量标准。
2.5 ELISA鉴定目的蛋白 纯化产物经ELISA分析其中含有目的蛋白非酰胺化的ω-CTX MVIIA(参见图9)。随着包被非酰胺化的ω-CTX M VIIA浓度的增高(设置低、中、高三种剂量)，OD值呈上升趋势。
2.6 MALDI-TOF-MS分析结果 MALDI-TOF-MS结果显示，通过酵母表达纯化的非酰胺化的ω-CTX M VIIA分子量为2638.89Da(参见图10)，与理论分子量2639.22Da符合，提示非酰胺化的ω-CTX M VIIA的6个巯基均被氧化成二硫键，且没有被糖基化修饰。
2.7生物活性的检测小鼠热板镇痛实验及大鼠热尾法均证实由酵母表达的非酰胺化的ω-CTX M VIIA具镇痛效应(图11，12)，图11中Saline为生理盐水组；Morphine(L)为低剂量吗啡组(25μg/kg)；Morphine(H)为高剂量吗啡组(125μg/kg)；CTX(L)为低剂量非酰胺化的ω-CTX M VIIA组(0.25μg/kg)；CTX(M)为中剂量非酰胺化的ω-CTX M VIIA组(0.75μg/kg)；CTX(H)为高剂量非酰胺化的ω-CTX M VIIA组(1.5μg/kg)。图12中Saline为生理盐水组；Morphine(L)为低剂量吗啡组(25μg/kg)；Morphine(H)为高剂量吗啡组(125μg/kg)；CTX(L)为低剂量非酰胺化的ω-CTX M VIIA组(0.4μg/kg)；CTX(M)为中剂量非酰胺化的ω-CTX M VIIA组(1.2μg/kg)；CTX(H)为高剂量非酰胺化的ω-CTX M VIIA组(2.0μg/kg)，且具有剂量依赖性。从上述动物实验的剂量曲线估计，按摩尔镇痛强度比较，这种非酰胺化的ω-CTX M VIIA的镇痛效力是吗啡的900倍(吗啡分子量为285，非酰胺化ω-CTX M VIIA的分子量为2639)。
ω-CTX M VIIA作用于神经组织N-型VSCC，具“低分子量，高活性，高专一性”特点，是神经科学十分有效的探针，通过调节钙浓度影响许多细胞过程，如神经传递，激素分泌，离子通道与酶活性等。其无瘾镇痛和神经保护的双重效应使之在新一代镇痛药及神经保护药领域具广阔应用前景。
ω-CTX M VIIA是由25个氨基酸组成的小肽，含三对二硫键，人工合成成本高、使三对二硫键正确配对的方法繁琐；若采用基因工程方法直接真核表达则会大大降低成本，由于毕赤酵母存在翻译后的修饰能力，在分泌过程中可以形成正确的二硫键配对。本实验采用毕赤酵母表达体系利用了其相对于原核表达体系所无法比拟的优点①用毕赤酵母体系，可以得到直接分泌的小肽；由于毕赤酵母自身分泌到培养基的蛋白很少，高分泌的外源蛋白易于分离纯化；②具有翻译后的修饰功能，可以直接得到活性产物；③具有完备的发酵方法，可以高密度连续培养，表达蛋白产量高。另外，我们实验中还有一个大胆的尝试将载体pPIC9信号肽切割位点后的GAGGCTGAAGCTTACGTA切掉而直接连接上目的基因，这样表达出来的目的蛋白将不会带任何多余的氨基酸，实践证明该尝试是成功的。
ω-CTX M VIIA在毕赤酵母中的表达至今尚未见报道，因为天然的ω-CTXM VIIA的羧基端是酰胺化的，而目前的基因工程方法所采用的原核或真核表达体系缺乏酰胺化的功能，因而无人进行这方面的尝试。我们的发明表明用毕赤酵母直接分泌表达的非酰胺化的ω-CTX M VIIA，同样具有强烈的镇痛活性，其镇痛效力是吗啡的900倍(按摩尔镇痛强度比较)；而且表达产量高，本研究采用摇瓶发酵已获得较高的表达量，如果采用发酵罐高密度发酵，其表达量将会达到更高的水平。
综上所述，我们用基因工程技术，在毕赤酵母中成功地表达了非酰胺化的ω-CTX M VIIA；这种方法可以生产新型的非酰胺化的ω-CTX M VIIA，制备工艺简单，每升发酵液可得到约36mg非酰胺化的ω-CTX M VIIA，生产成本较低；动物实验证明这种新型的非酰胺化的ω-CTX M VIIA具有很高的镇痛活性，可用于镇痛药物的开发。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.非酰胺化ω-芋螺毒素M VIIA，其特征是具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，分子量为2639，该多肽分子中Cys1与Cys16、Cys8与Cys20、Cys15与Cys25分别形成三对二硫键，C-端为非酰胺化Cys。
2.根据权利要求1所述的非酰胺化ω-芋螺毒素M VIIA的制备方法，其特征是利用基因工程方法构建ω-芋螺毒素MVIIA基因真核表达质粒并发酵表达，通过以下技术方案实现(1)编码ω-CTX M VIIA的DNA片段的设计与合成根据已知的ω-CTXM VIIA氨基酸序列，按毕赤酵母偏爱密码子设计寡核苷酸片断CTX1和CTX2，5’端添加Xho I酶切位点及编码Lys-Arg的序列并磷酸化，3’端添加TAA终止密码子及EcoR I酶切位点；(2)表达载体的构建对毕赤酵母表达载体pPIC9进行Xho I/EcoR I双酶切，将退火生成的编码非酰胺化的ω-CTX M VIIA的基因片段连接到pPIC9上，构建成重组表达质粒pPIC9-CTX，对其分别进行PCR和双酶切，用琼脂糖电泳鉴定，对克隆2pPIC9-CTX测序结果表明编码非酰胺化的ω-CTX M VIIA的DNA序列已正确的插入到pPIC9中；(3)毕赤酵母中表达载体的转化取5～10μg去除了RNA的重组表达载体，经Sal I单酶切线性化，乙醇沉淀回收后以电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD和MM平板上筛选转化子，所用电转仪为Bio-Rad GenePulser，转化条件为电压1500V，电容25μF，电阻200Ω；(4)基因表达毕赤酵母基因表达宿主菌选用GS115，挑取单克隆Mut+型菌落，按照Invitrogen公司提供的操作手册所介绍的发酵方法进行摇瓶发酵，定期取样，以18％SDS-PAGE检测目的基因的表达水平。
3.根据权利要求1所述的非酰胺化的ω-芋螺毒素M VIIA在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明提供非酰胺化ω－芋螺毒素M VIIA(ω－CTX M VIIA)，是根据已知的ω－CTX M VIIA氨基酸序列，设计并合成编码非酰胺化ω－CTX M VIIA的DNA片段，对表达载体pPIC9进行Xho I/EcoR I双酶切，经连接构建成重组表达质粒pPIC9－CTX，用电穿孔法转化毕赤酵母，经筛选得到高产菌株，并由甲醇诱导表达。本发明在毕赤酵母中成功表达了非酰胺化的ω－CTX M VIIA，生产新型的非酰胺化的ω－CTX M VIIA，制备工艺简单稳定，生产成本较低。动物实验证明具有很高的镇痛活性，其镇痛效力是吗啡的900倍，可用于镇痛药物的开发。
文档编号A61K38/17GK1740193SQ20051006078
公开日2006年3月1日 申请日期2005年9月15日 优先权日2005年9月15日
发明者詹金彪, 王峰 申请人:浙江大学