专利名称：复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法。
背景技术：
组织工程化皮肤的出现为皮肤创面的修复和愈合提供了一条崭新的治疗途径，但是，目前各种组织工程化皮肤移植存活率明显低于自体断层皮片移植，其中一个主要原因是组织工程化皮肤移植后血管化速度较自体断层皮片慢，所以加快织工程化皮肤血管化速度是提高其存活率的关键因素。目前，应用具有促进血管生成作用的生长因子是促进组织工程化皮肤血管化的一个较好办法。
在众多生长因子中，血管生成素(angiogenin，ANG)是迄今为止唯一一个基于其促进血管新生能力而被发现和分离纯化的血管生成因子，可与肝素结合，它是一个由123个氨基酸组成的分子量为14kDa单链碱性蛋白，其促进血管生成能力非常强，纳克级的量即可起作用。但是血管生成素在体内的半衰期非常短，在数分钟之内即降解而失去生物活性，所以解决其应用的关键就是能获得血管生成素的持续释放系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，可以在体内促进其血管化速度，从而提高移植存活率。
方法的步骤如下1)用0.5mol/l的乙酸溶液分别将牛腱胶原、壳聚糖配制成0.5~5％的溶液，牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为5～30％，-20～-50℃冷冻1～5h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；2)所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下80~130℃处理12～48h后，将其浸泡到含肝素钠的2-N-吗啉乙烷磺酸溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为4～80∶1，浸泡0.5～2h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液处理12～48h，其中1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的摩尔浓度比为0.5～5∶1，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；3)所得肝素化胶原/壳聚糖多孔支架浸泡到血管生成素溶液中，4~25℃浸泡2～24h。
牛腱胶原和壳聚糖混合溶液中壳聚糖溶液含量(按重量)为5～30％。牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为4～10∶1。1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液浓度为20～80mmol/l。1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的浓度比为1～2.5∶1。肝素化胶原/壳聚糖多孔支架和血管生成素溶液的浸泡温度为4～16℃，浸泡时间为8～10h。
本发明制备的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架所具有适宜的孔径和孔隙率，适合皮肤组织工程的真皮替代物。采用血管生成素可以快速促进真皮替代物的血管化，提高移植存活率。本发明制备血管生成素的控释体系方法极其简单、有效，影响因素少，较易推广。
图1(a)是未肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的扫描电镜(SEM)照片；图1(b)是未肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的扫描电镜(SEM)照片局部放大图；图1(c)是肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的扫描电镜(SEM)照片；图1(d)是肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的扫描电镜(SEM)照片局部放大图；图2(a)是不同血管生成素浓度对支架血管生成素结合量的影响图；图2(b)是肝素化对支架血管生成素结合率的影响图；图3是不同壳聚糖溶液含量对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图；图4是不同牛腱胶原与溶液中肝素钠质量比对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图；图5是不同1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液浓度对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图；图6是不同1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液的摩尔浓度比对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图；图7不同浸泡温度对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图；图8是不同浸泡时间对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图；图9是血管生成素的体外释放行为图；图10(a)是复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架兔耳背皮下埋植1周后的组织切片图；图10(b)是未复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架兔耳背皮下埋植1周后的组织切片图；图10(c)是复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架兔耳背皮下埋植2周后的组织切片图；图10(d)是未复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架兔耳背皮下埋植2周后的组织切片图；图10(e)是支架内新生血管计数图。
具体实施例方式
实施例1肝素化对胶原/壳聚糖多孔支架微结构的影响用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，然后将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺溶液(20mmol/l)处理24h，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；图1a、图1c分别为未肝素化和肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的扫描电镜(SEM)照片，图1b、图1d分别为图1a和图1c的局部放大图。
实施例2肝素化对血管生成素结合率的影响用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，然后将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺溶液(20mmol/l)处理24h，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.25mg)浸泡到0.25ml血管生成素溶液中，按血管生成素浓度0、10、20、40、80、和160ng/ml分成六组；同样条件设六组，放入未肝素化支架作为对照组。4℃浸泡9小时后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的支架。结果表明，随着血管生成素浓度的增加，肝素化、未肝素化支架的血管生成素结合量均相应增加，浓度与结合量呈线性关系；胶原/壳聚糖多孔支架与血管生成素结合率甚低，仅为1.7％，而肝素化显著提高了胶原/壳聚糖支架的血管生成素的结合量，其结合率达到36.5％。图2(a)为不同血管生成素浓度对支架血管生成素结合量的影响图，图2(b)为肝素化对支架血管生成素结合率的影响图。
实施例3不同壳聚糖溶液含量对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，然后将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀得到壳聚糖溶胀液含量(按重量)分别为5％、10％、20％、30％的混合液，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺溶液(20mmol/l)处理24h，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.25mg)浸泡到0.25ml血管生成素(40ng/ml)溶液中，4℃浸泡9小时后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架。图3为不同壳聚糖溶液含量对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图。
实施例4不同牛腱胶原与溶液中肝素钠质量比对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，其中牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比分别为4、7、10、20、40和80∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺溶液(20mmol/l)处理24h，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.25mg)浸泡到0.25ml血管生成素(40ng/ml)溶液中，4℃浸泡9小时后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架。图4为不同牛腱胶原与溶液中肝素钠质量比对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图。
实施例5不同1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液浓度对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液处理24h，其中1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液的浓度分别为5、10、20、40和80mmol/l，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.25mg)浸泡到0.25ml血管生成素(40ng/ml)溶液中，4℃浸泡9小时后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架。图5为不同1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液浓度对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图。
实施例6不同1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)～碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液的摩尔浓度比对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液处理24h，其中1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液的浓度为40mmol/l，1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的摩尔浓度比分别为0.5、1、1.5、2、2.5、5∶1，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.25mg)浸泡到0.25ml血管生成素(40ng/ml)溶液中，4℃浸泡9小时后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架。图6为不同1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液的摩尔浓度比对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图。
实施例7不同浸泡温度对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，然后将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺溶液(20mmol/l)处理24h，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.25mg)浸泡到0.25ml血管生成素(40ng/ml)溶液中，分别在4℃、8℃、16℃、25℃下浸泡9小时后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架。图7为不同浸泡温度对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图。
实施例8不同浸泡时间对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，然后将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺溶液(20mmol/l)处理24h，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.25mg)浸泡到0.25ml血管生成素(40ng/ml)溶液中，4℃下分别浸泡2、4、6、8、10、12和14h后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架。图8为不同浸泡时间对肝素化胶原/壳聚糖多孔支架血管生成素结合率的影响图。
实施例9血管生成素的体外释放行为用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，然后将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加l-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺溶液(20mmol/l)处理24h，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.25mg)浸泡到0.25ml血管生成素(160ng/ml)溶液中，4℃下分别浸泡9h后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架。血管生成素结合量为14.6ng/片；同样方法得到复合血管生成素的未肝素化胶原/壳聚糖多孔支架，血管生成素的结合量为0.7ng/片。将复合血管生成素的两种支架分别放入0.5ml释放液(含10％成人血清、100U/ml青霉素、100μg/ml的CS-C内皮细胞培养基，pH7.2～7.4)中，置于37℃恒温细胞培养箱，定时取出释放液测定血管生成素释放量。复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的血管生成素释放呈持续稳定型，见图9。
实施例10复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架体内血管化评价用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5mol/l的乙酸溶液分别将胶原、壳聚糖配制成0.5％的溶液，然后将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量(按重量)为10％，-20℃冷冻2h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下105℃处理24h后，将其浸泡到含肝素钠(购自美国SIGMA公司)的2-N-吗啉乙烷磺酸(50mmol/l)溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为10∶1，浸泡1h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺溶液(20mmol/l)处理24h，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；将肝素化胶原/壳聚糖多孔支架(0.2mg)浸泡到3ml血管生成素(320ng/ml)溶液中，4℃浸泡9小时后取出支架，室温下PBS漂洗2次，每次10min，得到复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架。将此支架埋植于兔耳背皮下，同样埋植未复合血管生成素的肝素化支架作为对照，分别于埋植后第1、2周取材做组织切片观察，取材前兔耳背动脉灌注印度墨汁，组织切片在100倍视野下计数新生血管数(单位个/H，H代表100倍视野)。埋植后1周，复合血管生成素支架可见较多新生血管长入，血管密度(10.1±4.2)个/H，但深部未见血管组织；对照组仅在支架与兔耳组织交界处可见血管组织，。术后2周，实验组支架新生血管已达支架深部，但未完全血管化，血管密度(38.2±6.8)个/H，较第1周明显增加(P＜0.01)；对照组支架新生血管集中在周边，深部未见血管结构，密度为(22.6±6.9)个/H，显著小于同时点实验组。图10(a)是复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架兔耳背皮下埋植1周后的组织切片图；图10(b)是未复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架兔耳背皮下埋植1周后的组织切片图；图10(c)是复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架兔耳背皮下埋植2周后的组织切片图；图10(d)是未复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架兔耳背皮下埋植2周后的组织切片图；图10(e)是支架内新生血管计数图。
权利要求
1.一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于方法的步骤如下1)用0.5mol/l的乙酸溶液分别将牛腱胶原、壳聚糖配制成0.5~5％的溶液，牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液混合均匀注入模具，壳聚糖溶液重量百分子含量为5～30％，-20～-50℃冷冻1～5h后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；2)所得胶原/壳聚糖多孔支架在真空下80~130℃处理12～48h后，将其浸泡到含肝素钠的2-N-吗啉乙烷磺酸溶液中，牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为4～80∶1，浸泡0.5～2h，然后添加1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液处理12～48h，其中1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的摩尔浓度比为0.5～5∶1，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；3)所得肝素化胶原/壳聚糖多孔支架浸泡到血管生成素溶液中，4~25℃浸泡2～24h。
2.根据权利要求1所述的一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所述的牛腱胶原和壳聚糖混合溶液，壳聚糖溶液重量百分子含量为5～30％。
3.根据权利要求1所述的一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所述的牛腱胶原与溶液中肝素钠的质量比为4～10∶1。
4.根据权利要求1所述的一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所述的1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液浓度为20～80mmol/l。
5.根据权利要求1所述的一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所述的1-乙基-3-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的浓度比为1～2.5∶1。
6.根据权利要求1所述的一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所述的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架和血管生成素溶液的浸泡温度为4～16℃。
7.根据权利要求1所述的一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于步骤3)的浸泡时间为8～10h。
全文摘要
本发明公开了一种复合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法。它用乙酸溶液分别将牛腱胶原、壳聚糖配制成0.5~5％的溶液，混合均匀注入模具，壳聚糖溶液含量为5～30％，冷冻后置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；真空处理后，将其浸泡到含肝素钠的2－N－吗啉乙烷磺酸溶液中浸泡，然后添加1－乙基－3－3－(二甲基胺丙基)－碳化二亚胺溶液和N－羟基丁二酰亚胺溶液处理，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；浸泡到血管生成素溶液中。本发明工艺简单、有效，影响因素少，较易推广，制备的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架所具有适宜的孔径和孔隙率，适合皮肤组织工程的真皮替代物。
文档编号A61F2/10GK1748803SQ200510060749
公开日2006年3月22日 申请日期2005年9月13日 优先权日2005年9月13日
发明者韩春茂, 石海飞, 毛峥伟, 陈轶欣, 马列, 高长有 申请人:浙江大学