一种新生儿总半乳糖检测试剂盒、其使用方法及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新生儿总半乳糖检测试剂盒，包括实验缓冲液，碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉、半乳糖脱氢酶冻干粉、半乳糖滤纸干血片校准品、质控品、铜试剂和白色反应板。本发明还公开了新生儿总半乳糖检测试剂盒的使用方法和制备方法。本发明的新生儿总半乳糖检测试剂盒经济、省时、省工，可用于新生儿半乳糖血症筛查，为新生儿筛查的普及奠定良好的技术基础。
【专利说明】一种新生儿总半乳糖检测试剂盒、其使用方法及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新生儿半乳糖血症的筛查领域，尤其涉及一种利用总半乳糖与氧化型 辅酶II反应生成荧光物质还原型辅酶II的原理，快速检测新生儿总半乳糖的试剂盒、其使 用方法及制备方法。
【背景技术】
[0002] 半乳糖血症是由于半乳糖代谢过程中酶缺陷导致半乳糖利用障碍、有害代谢产物 积累，属于常染色体隐性遗传疾病。在临床上较为少见，不同的地区发病率存在一定的差 异。沙特阿拉伯东部地区的发病率为12/10万，爱尔兰永久居民的发病几率为1/3万，美国 的发病率约为1/5. 9万。据报道我国香港地区的发病率为0. 25/10万。
[0003] 在肝脏中，半乳糖在半乳糖激酶（galactokinase，GALK)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰 转移酶（galactose-1-phosphate uridyl_transferase，GALT)和半乳糖尿苷二憐酸 _4_ 表 异构酶（uridine-diphosphate galactose-4，epimerase，UDPGa-4-E)的作用下，通过 Leloir途径，转变为葡萄糖和能量被组织利用。该代谢过程中任何一种酶的缺陷都将导致 半乳糖的异常堆积，堆积的半乳糖分别在醛糖还原酶和脱氢酶的作用下生成半乳糖醇和半 乳糖酸。半乳糖及其异常代谢产物的沉积导致半乳糖血症的发生。
[0004] (1)经典的半乳糖血症（I型）即半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 (galactose-1-phosphate uridyl_transferase，GALT)缺陷，占 95%。该类型患儿常在 围生期即发病，表现为进食奶类后出现呕吐、拒食、体重不增、腹泻、嗜睡和肌张力减低等症 状，随后出现黄疸及肝脏肿大，如未得到及时诊治，患儿可出现腹水、肝功能衰竭、出血等终 末期症状，多于新生儿期夭折。
[0005] (2) II型半乳糖激酶（GALK)缺陷，较罕见。病情比I型半乳糖血症轻，白内障常见， 智力发育正常或迟缓，血中半乳糖浓度增高，尿中出现半乳糖或半乳糖醇，但无氨基酸和蛋 白。
[0006] (3) III型半乳糖尿苷二磷酸-4-表异构酶（UDPGal-4-E)缺陷，罕见。临床表现不 一，可无症状或类似于I型半乳糖血症。
[0007] 因半乳糖血症的临床表现无特异性，故其诊断多依赖于实验室检查。目前常用的 诊断方法主要为酶学检测、血和尿中半乳糖及其代谢产物的检测和基因诊断。
[0008] (1)酶学检测：主要是针对GALT缺陷的检测。检验原理主要依赖于Beutler试验 中间接检测红细胞中GAIT酶活性的方法。此方法在全血或者血滤纸片中加入混有尿苷-二 磷酸葡糖、1-磷酸半乳糖（Ga-1-P)、三磷酸吡啶核苷酸（TPN)的混合物，孵育一段时间，如 果GAIT活性正常，则Gal-I-P和尿苷二磷酸葡糖可以在GALT的作用下生成α -1-磷酸葡 糖。α-l-磷酸葡糖在变位酶的作用下生成β-l-磷酸葡糖，进而在葡糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PD)存在的情况下可以还原TPN生成还原型的ΤΡΝ，后者被波长为465 μ m的紫外灯激发 可以产生荧光。该测定方法具有季节差异性，容易受到酶活性抑制因素的影响，且反应依赖 G6H)的存在，易造成假阳性结果。同时，半乳糖代谢主要在肝内进行，而目前酶学检测都是 检测红细胞内对GALT的活性，并不能完全反映肝内半乳糖的代谢水平。
[0009] (2)血和尿中半乳糖及其代谢产物的检测：由于半乳糖代谢途径的阻断及旁路代 谢的不完全，人体内可以出现半乳糖、1-磷酸半乳糖、半乳糖醇、半乳糖酸等代谢产物堆积。 由于1-磷酸半乳糖是半乳糖血症的主要致病物质，因此常通过检测半乳糖、1-磷酸半乳糖 的浓度来诊断半乳糖血症。代谢物的检测依赖于半乳糖的摄入，容易产生假阴性。此外，在 保证假阴性率的前提下，通过代谢物检测无法判断属于哪一种酶缺陷。
[0010] (3)基因诊断：目前已经发现了近20种GALK基因突变，160余种GALT基因突变， 近10种UDPGal-4-E基因突变，通过对致病突变的检测可以诊断半乳糖血症。基因突变因 人种而异，具有地域性，而我国人群中尚未有半乳糖血症常见突变的报道。同时由于基因诊 断耗时相对较长，因此主要用于辅助诊断。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于解决现有的新生儿半乳糖血症筛查准确性差，检测速度慢，工 作强度高的问题。
[0012] 因此，本发明提供了一种新生儿总半乳糖检测试剂盒，包括实验缓冲液，碱性磷酸 酶和氧化型辅酶II的冻干粉、半乳糖脱氢酶冻干粉，半乳糖滤纸干血片校准品、质控品，铜 试剂和白色反应板。
[0013] 在上述技术方案中，由于人体中的半乳糖主要是D-半乳糖，这里总半乳糖是指 D-半乳糖和D-半乳糖-1-磷酸。无论是三种酶（GALT、GALK、UDPGal-4-E)中的哪一种的 缺陷引起的半乳糖血症，患者体内的D-半乳糖或者D-半乳糖-1-磷酸的量会升高，换句话 说，其体内总的半乳糖量是升高的，因此通过测量总半乳糖的量，可以筛查新生儿半乳糖血 症。
[0014] 在上述技术方案中，利用试剂盒检测新生儿总半乳糖的原理为：首先，在试剂盒 中的碱性磷酸酶的作用下，D-半乳糖-1-磷酸转化成D-半乳糖，D-半乳糖和氧化型辅酶 II (NADP+)在半乳糖脱氢酶的作用下转化成D-半乳糖酸内酯和还原型辅酶II (NADPH)，还 原型辅酶II (NADPH)在355nm的激发光的作用下会发射出波长为460nm的蓝色荧光，还原 型辅酶II的荧光强度与总半乳糖含量成正比，通过检测蓝色荧光的强度，结合标准曲线，即 可得出总半乳糖的含量。其中，半乳糖脱氢酶又名半乳糖1-脱氢酶。本发明的试剂盒测定 新生儿滤纸干血片中总半乳糖的原理简单概括如下：
【权利要求】
1. 一种新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：包括实验缓冲液，碱性磷酸酶和氧 化型辅酶II的冻干粉、半乳糖脱氢酶冻干粉，半乳糖滤纸干血片校准品、质控品，铜试剂和 白色反应板。
2. 如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述实验缓冲液为 含有KCl的Tris-HCl缓冲液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为5?100mmol/L，KCl的摩尔浓 度为 10 ?100mmol/L。
3. 如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述碱性磷酸酶和 氧化型辅酶II的冻干粉的制备方法为：a)制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶II的混合液，其包 括浓度为〇. 5?5000U/mL的碱性磷酸酶，浓度为10?lOOOmg/mL的氧化型辅酶II，摩尔浓 度为10?20mmol/L的Tris-HCl，摩尔浓度为40?BOmmoI /T,的KC1，摩尔浓度为0. 5? I. 5mmol/L的MgCl2，质量百分比浓度为1?3%的海藻糖，质量百分比浓度为2?4%的甘 露醇；b)将步骤a)中的混合液进行真空冷冻干燥，即得所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶II的 冻干粉。
4. 如权利要求3所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述步骤a)为：制 备碱性磷酸酶和氧化型辅酶II的混合液，其包括浓度为lOOOU/mL的碱性磷酸酶，浓度为 46mg/mL的氧化型辅酶II，摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HCl,摩尔浓度为50mmol/L的KC1， 摩尔浓度为lmmol/L的MgCl 2，质量百分比浓度为2%的海藻糖，质量百分比浓度为3%的甘 露醇。
5. 如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述半乳糖脱氢酶 冻干粉的制备方法为：1)制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为〇. 05?200U/mL的半乳糖 脱氢酶，质量百分比浓度为〇. 5?1. 5%的BSA，摩尔浓度为0. 6?I. Ommol/L的EDTA，摩尔 浓度为1. 3?5. Omol/L的（NH4)2SO4 ;2)将步骤1)中的半乳糖脱氢酶溶液进行真空冷冻干 燥，即得所述半乳糖脱氢酶冻干粉。
6. 如权利要求5所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述步骤1)为： 制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为20U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为1%的 BSA，摩尔浓度为0. 8mmol/L的EDTA，摩尔浓度为3. 2mol/L的（NH4)2S04。
7. 如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述半乳糖滤纸干 血片校准品、质控品的制备方法为：使用无菌生理盐水洗涤脱纤维绵羊全血，调整血细胞比 容至50%?55%，分别向其中加入不同量的D-半乳糖原料以配制不同浓度的校准品和质 控品，将配置好的校准品以50 y L/滴的体积分别滴加在滤纸的A、B、C、D、E、F六个校准位 点，将配置好的质控品以50 y L/滴的体积分别滴加在滤纸的Cl、C2两个质控位点上，经室 温自然干燥后得到半乳糖干滤纸片校准品和质控品，用铝箔袋真空密封。
8. 如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述铜试剂中包括 摩尔浓度为〇. 5?8. 0mmol/L的硫酸铜，摩尔浓度为10?250mmol/L的碳酸钠，摩尔浓度 为0. 5?10mmol/L的酒石酸钾钠。
9. 如权利要求1?8中任一项权利要求所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒的使用方 法，其特征在于：包括以下步骤： 1)准备所需试剂：取出试剂盒，将其中的铜试剂仍于2?8°C下保存，即用即取，试剂 盒中其他试剂平衡至室温；配制质量百分比浓度为80%的乙醇溶液；配制反应工作液：将 碱性磷酸酶和氧化型辅酶II的冻干粉加入到实验缓冲液中，再加入半乳糖脱氢酶，混匀备 用，其中，半乳糖脱氢酶的最终浓度为〇. 0015?6U/mL，碱性磷酸酶的最终浓度为0. OOl? 10U/mL，氧化型辅酶II的最终浓度为0. 13?13mg/mL ; 2) 将半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和采集的滤纸干血片样本用直径3. Omm自动打 孔仪打入塑料排钉上； 3) 向洁净的普通反应板的微孔中分别加入100?150 ii L的质量百分比浓度为80%的 乙醇溶液，将半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本浸入乙醇溶液中约lmin， 然后将挂有半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本的塑料排钉烘干； 4) 向白色反应板每孔中分别加入200?300 ii L反应工作液，将烘干后的半乳糖滤纸 干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本放入白色反应板的微孔中，37°C缓慢震荡0. 5?1 小时； 5) 取出铜试剂，向白色反应管的每孔中分别加入100?200 y L铜试剂，混合均匀，得到 最终反应物； 6) 样本中总半乳糖浓度的测定： (1) 将半乳糖滤纸干血片校准品的不同浓度的校准位点的最终反应物分别放入荧光 分析仪中，检测各个校准位点的最终反应物在波长为355nm的激发光的作用下，发射出的 波长为460nm的蓝色荧光的荧光强度，并根据已知的半乳糖滤纸干血片校准品各个位点的 D-半乳糖的浓度，绘制标准曲线； (2) 用荧光分析仪测定滤纸干血片样本的最终反应物在波长为355nm的激发光的作用 下，发射出的波长为460nm蓝色荧光的荧光强度，并根据标准曲线，得出滤纸干血片样本中 的总半乳糖浓度。
10.如权利要求1?8中任一权利要求所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒的制备方法， 其特征在于：包括以下步骤： 1) 配制实验缓冲液、铜试剂、碱性磷酸酶和氧化型辅酶II混合溶液、半乳糖脱氢酶溶 液； 2) 以不同浓度的D-半乳糖纯品加入基质中混合，然后滴加在滤纸上制备半乳糖滤纸 干血片校准品、质控品； 3) 分装所述实验缓冲液、铜试剂、半乳糖滤纸干血片校准品、质控品；分装所述碱性磷 酸酶和氧化型辅酶II混合溶液并冻成干粉；分装所述半乳糖脱氢酶溶液并冻成干粉； 4) 贴标签； 5) 组装为成品。
【文档编号】G01N33/66GK104316692SQ201410577365
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】冯健明 申请人:广州市丰华生物工程有限公司