端 Galβ1，4GlcNAc的部分或聚糖的触角的游离半乳糖基残基的C6羟基，从而在聚糖中形成 α2 - 6连接至Galβ1，4GlcNAc部分的半乳糖基残基的末端唾液酸残基。此外，hST6Gal-I 的Λ108截短变体适合于糖工程改造应用以合成改变糖蛋白的聚糖部分的组成。此外， hST6Gal-I的Λ108截短变体非常适合于在不同的宿主生物体中的重组表达，从而允许以高 量和合理成本产生该酶。
[0056] 此外，单独的变体Δ108hST6Gal_I甚至更令人惊讶地表现出关于其唾液酸化活 性是受限的；因此其能够催化仅单一唾液酸残基添加至选自糖蛋白和糖脂的目标分子的 触角聚糖部分中包含的末端受体部分（Galβ1，4GlcNAc)，其中所述末端受体部分能够被 α2, 6唾液酸化。由于还没有观察到单一目标分子的多于一个受体（目标）部分的唾液酸 化，Δ108hST6Gal_I可以有利地用于特定的单唾液酸化。据本发明人所知，此酶促特性到 目前为止是独特的。
[0057] 如本文公开的所有实施方案的第一个方面因此是SEQIDN0:3(Δ108 hST6Gal_I)的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I用于从目标分子特 异性形成单唾液酸化目标分子的用途，其中所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，其中所述目 标分子包含多个（=两个或更多个）触角目标分子，所述触角目标分子具有作为末端结构 的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺 部分，其中所述单唾液酸化目标分子包含单一唾液酸化末端触角目标部分，且其中所述唾 液酸化末端触角目标部分包含一个Ν-乙酰神经氨酰基-α2, 6-β-D-半乳糖基-1，4-Ν-乙 酰基-β-D-葡糖胺残基。一个特定实施方案是用于体外产生具有添加至目标分子的一个 触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 提供组合物，所述组合物包含（i)目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分 子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6 位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；（ii)SEQIDN0:3 (Λ108hST6Gal-I)的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I 胞苷-5' -单磷酸-N-乙酰神经氨酸或其功能等效物，作为用于唾液酸转移酶催化的反应 的供体化合物；(b)在允许糖基转移酶酶促活性的条件下温育步骤（a)的组合物，从而每 个目标分子形成单一末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2, 6-β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰 基-β-D-葡糖胺残基（=α2, 6唾液酸化末端触角残基）；从而体外产生具有添加至目标分 子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子。
[0058] 在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，步骤（a)中提供的目标分子无 α2, 6唾液酸化末端触角残基。获得此目标分子的一种方法是用具有糖苷酶，且具体地唾液 酸酶活性的酶去除任何末端唾液酸残基。这，使用用此"脱唾液酸"目标蛋白（然而其保留 其用于唾液酸化的两个或更多个受体位点）的上述方法，本公开内容，具体地上述用途和 方法使得技术人员能够特异性制备选自糖蛋白和糖脂的单唾液酸化目标分子，所述单唾液 酸化目标分子可通过如本文公开的方法获得。
[0059] Λ108hST6Gal_I与无限制的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I活性的酶 (诸如具体地△ 89hST6Gal-I)的组合，同时使用两种酶变体是特别有利的，因为其可以用 于具有两个或更多个可接近的触角受体部分的目标分子的进一步受控的体外唾液酸化。因 此，发现，尽管A89hST6Gal-I能够催化唾液酸化以形成双唾液酸化的目标蛋白（在本文 中通过人单克隆IgGl和IgG4以非限制性方式例举），但相同条件下，Δ108hST6Gal_I仅 能够催化唾液酸化以形成单唾液酸化的目标蛋白，所述目标蛋白在唾液酸化之前无作为末 端触角部分的唾液酸残基。因此，设想用于定量受控唾液酸化的进一步方法，其中预先确定 Δ89hST6Gal_I和Δ108hST6Gal_I各自的酶促活性的量。
[0060] 值得注意地，具体两种酶Δ89hST6Gal_I和Δ108hST6Gal_I的组合允许以定量 受控的方式唾液酸化，因为可以产生单唾液酸化的IgG目标分子和双唾液酸化的IgG目标 分子的比率受控的体外唾液酸化的IgG目标分子，如本文中以非限制性方式所例举。在本 实施方案中，合适的目标还包括脱唾液酸糖蛋白，即无末端触角唾液酸残基的糖蛋白，例如 获得为在体外唾液酸化之前已经通过唾液酸酶-展示酶的作用从触角聚糖去除末端唾液 酸残基的糖蛋白。其一个例子是神经氨酸酶。
[0061] 作为如本文公开的一个进一步方面，用于应用具有β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸 转移酶I活性的酶的组合，在第一个步骤中，形成组合物，所述组合物包含允许糖基转移酶 酶促活性的水性缓冲剂，所述组合物进一步包含：(a)糖基化目标分子，所述目标分子选自 糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结 构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β-D-葡糖 胺部分；（b)SEQIDΝ0:3(Δ108hST6Gal_I)的末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液 酸转移酶I;(c)具有高于或等于SEQIDΝ0:2 (Δ89hST6Gal-I)的Ν-末端截短的人β-半 乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I的酶促活性的唾液酸转移酶酶促活性的可溶性Ν-末端 截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I变体；(d)胞苷-5' -单磷酸-Ν-乙酰神 经氨酸或其功能等效物，作为用于唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物。在一个特定实 施方案中，（c)的组分是SEQIDΝ0:2 (Δ89hST6Gal-I)的N-末端截短的人β-半乳糖 苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I。
[0062] 据发现，通过改变两种糖基转移酶的比率，可以控制单唾液酸化的IgG目标分子 和双唾液酸化的IgG目标分子的比率。因此，在一个特定实施方案中，Δ89hST6Gal-I和 Δ108hST6Gal_I各自以预定量存在。在另一个特定实施方案中，Δ89hST6Gal_I和Δ108 hST6Gal-I的各量具有预定的酶促活性。也就是说，就两种酶各自而言，组合物中的酶促活 性的绝对量是这样的测量量，其最终决定在何种程度上将形成单唾液酸化的目标分子相比 于双唾液酸化的目标分子或甚至更高唾液酸化的目标分子。因此，单-和二-或更高唾液 酸化的目标分子的可重复比率变得可能产生。
[0063] 因此，如本文公开的一个进一步方面是如本文公开的组合物用于在体外和允许糖 基转移酶酶促活性的条件下产生具有添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的一个 或多个唾液酸残基的唾液酸化目标分子的用途。在一个特定实施方案中，定量确定唾液酸 化，使得一方面单唾液酸化的目标分子，和另一方面二或更高唾液酸化的目标分子通过将 酶促活性同时应用于目标分子的方式来产生。此处重申，如在如本文公开的彼此方面中，脱 唾液酸目标分子是对于本公开的实践者具有特别优势的特定实施方案。
[0064] 本公开的一个进一步方面是用于体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个 或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述目标分子选自糖蛋 白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的 在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺 部分，所述方法包括以下步骤：(a)提供如本文公开的组合物，所述组合物包含测量量的 Δ108hST6Gal-I和Δ89hST6Gal-I或具有高于或等于Δ89hST6Gal-I的酶促活性的 唾液酸转移酶酶促活性的可溶性N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶 I变体，和/或测量酶促活性的Δ89hST6Gal_I或其功能等效物和Δ108hST6Gal_I; (b) 在允许糖基转移酶酶促活性的条件下且持续预定时间间隔温育步骤（a)的组合物，从而形 成末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2, 6-β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残 基[=α2, 6唾液酸化末端触角残基];其中Δ89hST6Gal_I催化双唾液酸化IgG的形成且 Δ108hST6Gal_I催化单唾液酸化IgG的形成，从而体外产生具有受控量的添加至目标分 子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子。
[0065] 在如本文公开的所有方面的一个特定实施方案中，所述目标分子选自糖脂和糖蛋 白。糖蛋白的一个具体实施方案选自细胞表面糖蛋白、糖基化的蛋白信号传导分子、糖基化 的免疫球蛋白和糖基化的病毒来源的蛋白。在一个特定实施方案中，糖基化的免疫球蛋白 选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。在一个又更特定实施方案中，糖基化的免疫球蛋白是单克隆 抗体。
[0066] 在如本文公开的所有方面的一个特定实施方案中，所述目标分子是糖蛋白，且特 别是糖基化的蛋白信号传导分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒来源的蛋白。组合 的Λ89和Δ108hST6Gal_I变体在使用重组产生的人单克隆IgG4抗体作为复合目标（底 物）（作为几个非限制性例子之一）的唾液酸化实验中是有活性的；使用人IgGl单克隆抗 体作为唾液酸化目标获得了类似的发现。
[0067] 显然，IgG-Fc聚糖G2在可以被唾液酸化的触角支链的末端具有两个半乳糖部 分。在合适的反应条件下，N-末端截短的变体Δ89hST6Gal-I优选催化双唾液酸化的聚 糖（G2 + 2SA)的合成。在相同时间和相同条件下，Δ108hST6Gal_I催化形成仅单唾液酸 化（G2 + 1SA)聚糖。且因此，通过以测量量组合两种酶的方式，变得可能以预定比率特异 性合成单-和双-唾液酸化聚糖。
[0068] 如由本公开提供的受控的唾液酸化是体外合成具有期望唾液酸化程度的单、双和 更高的唾液酸化的糖蛋白的新型方式。因此，尽管通过用IgG分子显示期望的技术效果来 例举，根据本文的公开内容的用途也允许以类似方式处理其它糖蛋白，条件是，关于糖基 化转移酶活性，所述糖蛋白包含两个或更多个末端触角的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰 基-β-D-葡糖胺部分。相同的推理以类似方式适用于糖脂。
[0069] 特征在于G2+0SA以及ΕΡ0的重组人源化的IgGl和IgG4单克隆抗体（mAb)用作唾 液酸化实验中的目标（30μg酶/300μg目标蛋白）。在相同反应条件下使用ST6Gal-I (Δ89和Δ108)的两种酶变体，且G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA状态通过质谱进行分析。
[0070] 由于高表达率和有效纯化程序，重组人ST6-Gal_I的两种变体（Δ89和Δ108)可 以大量和高纯度获得。两种变体对于高分子量底物如单克隆抗体是有活性的。使用具有 双触角聚糖的单克隆抗体作为底物，它们在唾液酸化实验中显示了不同的性能。使用变体 A89,优选获得双唾液酸化的聚糖，而在相同条件下使用△ 89,获得单唾液酸化的聚糖。
[0071] 四触角聚糖也被接受作为底物（数据未显示）。结果表明，两种变体可以成功地用 于治疗性抗体的体外糖工程改造。
[0072] 重组人ST6-Gal_I是第一种可大量获得的酶。连同已经可得的供体底物（用作共 底物的活化糖），提供了非常有利的试剂集合，用于蛋白的体外糖工程改造。
[0073] 通过实践如本文提供的教导，人ST6-Gal_I的重组Δ89变体是可大量获得的酶。 连同已经可得的供体底物（用作共底物的活化糖），提供了非常有利的试剂集合，用于蛋白 的定量受控的体外糖工程改造。
[0074] 以下项进一步提供本公开的特定方面和特定实施方案以实践本文提供的教导。
[0075] 1.组合物，其包含允许糖基转移酶活性的水性缓冲液，所述组合物进一步包含： (a) 糖基化的目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触 角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟 基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β-D-