胰岛素-转铁蛋白-硒；LifeTechnologies))。
[0082] 条件化之前在无血清培养基中添加100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1作为生 长因子（添加FGF+TGF)。平行地，使用未添加生长因子的无血清培养基制备另一个条件培 养基。
[0083] 更换培养基，之后在C02培养箱中在37°C和5%C0 2条件下培养24小时后。
[0084] 培养24小时后回收培养基并且1，OOOrpm离心5分钟，将所得到的液体培养基（上 清液）作为MEF-条件培养基。
[0085] 3.无饲养细胞的iPS细胞培养
[0086] 将2ml本实施例第2部分制备的MEF-条件培养基加入接种于本实施例第1部分使 用玻连蛋白（VTN-N)包被的培养皿中的iPS细胞中。在这一阶段，将100yg/L人FGF2和 2μg/LTGF-β1加入已制备但未加入人FGF2或2μg/LTGF-β1作为生长因子的MEF-条 件培养基中。在37°C和5% 0)2条件下在MEF-条件培养基中培养iPS细胞5天。
[0087] 使用碱性磷酸酶对培养细胞染色。通过使用10%的甲醛将细胞固定在培养板上， 在其中加入lml-步NBT/BCIP溶液（Pierce)并使其在室温下避光放置30分钟进行染色。
[0088] 如图1所示，使用无血清培养基A+ITS制备的MEF-条件培养基为iPS细胞提供了 较高的生长能力（图1A和C)。尽管当条件化后加入生长因子使得iPS细胞显示出良好的 生长能力（图1C)，但是当使用利用添加了生长因子的培养基制备的条件培养基时能够进 一步改善iPS细胞的生长能力（图1A)。
[0089] [比较实施例1]
[0090] 如实施例1中所述使用无血清条件培养基培养iPS细胞，不同之处在于使用无血 清培养基A(DMEM/F12培养基、64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁和543mg/L碳酸氢钠）作为 无血清培养基制备MEF-条件培养基，并且不添加生长因子，然后在将其加入用于iPS细 胞培养的培养基中时加入1 %ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒）、100μg/L人FGF2和2μg/L TGF-β1〇
[0091] 图ID显示了碱性磷酸酶染色后观察到的结果。在使用不含ITS和生长因子的无 血清培养基A制备的MEF-条件培养基中，即使在iPS细胞培养过程中加入ITS、人FGF2和 TGF-β1也几乎观察不到iPS细胞的生长。
[0092] [比较实施例2]
[0093] 如实施例1中所述制备iPS细胞。在未使用MEF条件化培养基的情况下，将无血 清培养基A+ITS(DMEM/F12培养基、64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁、543mg/L碳酸氢钠和1 % ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒；LifeTechnologies))加入接种于包被了玻连蛋白（VTN-N) 的培养皿中的iPS细胞中。此外，将100yg/L人FGF2和2yg/LTGF-βΙ加入其中，并且 如实施例1所述培养iPS细胞。
[0094] 图1B显示了碱性磷酸酶染色后观察到的结果。当使用未经MEF条件化的无血清 培养基A+ITS培养iPS细胞时，即使当加入生长因子时iPS细胞的生长能力也较低。
[0095] [比较实施例3]
[0096] 如实施例1中所述使用无血清条件培养基培养iPS细胞，不同之处在于使用无 血清培养基B+ITS(DMEM(经Dulbecco改良的Eagle培养基）、2mML-谷氨酰胺、0.ImM NEAA(非必需氨基酸）、1%ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒）、0.ΙπιΜβ-巯基乙醇）作为无血清 培养基并加入1〇〇μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1作为生长因子（添加FGF+TGF)用于条 件化。此外，作为另一项实验，使用未经MEF条件化的无血清培养基B+ITS培养iPS细胞， 并加入100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1，如同比较实施例2的。
[0097] 图1显示了经碱性磷酸酶染色后观察到的结果。无论是否存在MEF条件化，在使用 无血清培养基B+ITS制备的MEF-条件化培养基（图1Ε)和未使用MEF条件化的无血清培 养基B+ITS(图1F)中均未观察到iPS细胞的生长。该结果表明与使用无血清培养基A+ITS 制备的条件培养基不同，iPS细胞的生长促进因子没有分泌进入使用无血清培养基B+ITS 制备的条件培养基中。
[0098] [实施例2]
[0099] 在这个实施例中，将已在经过丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF;饲 养细胞）中维持培养的非分化人iPS细胞转移至包被了Matrigel、玻连蛋白（VTN-N)或 PCM-DM的不含饲养细胞的培养皿的孔中，然后在经MEF条件化的营养培养基中培养，如下 文所述。PCM-DM是人銳膜来源的间充质细胞的细胞外（细胞周围）基质（D. Kanematsu等， Differentiation, 82, 77-88, 2011)〇
[0100] 1.人iPS细胞的制备
[0101] 使用来自iPS Academia Japan, Inc.的201B7细胞系作为人iPS细胞（非分化的 人iPS细胞）。在塑料培养皿中对人iPS细胞进行维持培养，其中已接种了已经过丝裂霉 素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF;饲养细胞）。使用通过在DMEM/F12培养基（经 Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12Ham ;Sigma D6421)中添加终浓度20% 的KNOCKOUT? SR (KnockOut?血清替代物或KSR ;Gibco)、0· ImM NEAA(非必需氨基酸）、2mM L_谷氨酰胺、5ng/ml人FGF2(称为"碱性FGF"或"bGFG"）和0.ImM 2-巯基乙醇制备的培 养基在C02培养箱中在37°C和5%0)2条件下进行培养。每6或7天传代一次。在传代过 程中，使用分离液（胶原酶溶液）将人iPS细胞集落与饲养细胞层分离，并通过吹打形成约 20至50个细胞的小团，然后接种在新鲜的饲养细胞层上。
[0102] 使用分离液分离如上文所述在饲养细胞上维持培养的人iPS细胞，经吹打形成约 20至50个细胞的小团，并且在300rpm下离心5分钟以回收iPS细胞。在包被了明胶的培 养皿上孵育回收的iPS细胞30分钟，从而使MEF粘附在皿上，收集培养基中悬浮的iPS细 胞，以除去MEF。
[0103] 2.条件培养基的制备
[0104] 使用经丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)由无血清培养基制备条 件培养基（CM)。以每60-mm平皿约500, 000个细胞的细胞密度将经丝裂霉素处理灭活的小 鼠胚胎成纤维细胞（MEF)接种在MEF的培养基中（添加了 10%FBS的DMEM培养基）。在 细胞孵育至少16小时后，先使用PBS(-)再使用添加了 1%几3、100以8/1人？6?2和2以8/ LTGF-β1的无血清培养基A(DMEM/F12培养基，64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁和543mg/L 碳酸氢钠；也将其称为"基础培养基A"）洗涤细胞，并且将培养基换成新鲜的相同无血清培 养基。
[0105] 在C02培养箱中在37°C和5% C02条件下培养24小时后更换培养基。培养24小 时后回收培养基并重复更换新鲜培养基多达6次。将回收的培养基1，OOOrpm呙心5分钟， 并将所得到的液体培养基作为MEF-条件培养基（无血清培养基A+ITS+FGF+TGF)。
[0106] 3.包被基质培养皿的制备
[0107] 根据LifeTechnologies提供的说明，使用经DMEM/F1230倍稀释的MatrigeP (BD)在室温下孵育1小时，用Matnger包被培养皿。
[0108] 根据常规方法制备PCM-DM-包被的培养皿（D.Kanematsu等， Differentiation, 82, 77-88, 2011)。具体地，首先，以 3.5X104个细胞/cm2将人蜕膜 来源的间充质细胞接种在包被了 0. 1 %明胶的塑料培养皿中，并且培养3天同时保持 融合。使用PBS(-)洗涤细胞，然后使用脱氧胆酸（向培养皿中加入0. 5 %脱氧胆酸钠 /lOmMTris-HCl(pH8. 0)4°C处理30分钟）处理细胞后的细胞以裂解细胞成分。随后，使用 PBS(-)洗涤留在培养皿上的细胞外基质成分。
[0109] 采用与实施例1相同的方法制备玻连蛋白（VTN-N)包被的培养皿。
[0110] 4.无饲养细胞的iPS细胞培养
[0111] 将在本实施例第1部分中制备、回收和除去MEF的iPS细胞分成4部分（1/4等 分）并且接种在本实施例第3部分制备的包被了Matrigel、玻连蛋白或PCM-DM的塑料培养 皿中。使用在本实施例第2部分中由无血清培养基A+ITS+FGF+TGF制备的MEF-条件培养 基在5% 0)2和37°C条件下培养5天。
[0112] 平行地，在未使用MEF条件化的相同培养基中培养本实施例第1部分中制备、回收 和除去MEF的iPS细胞。
[0113] 图2显示了碱性磷酸酶染色后观察到的结果。当使用MEF条件培养基进行培养时， 在包被了任意培养基质（即Matrigel、玻连蛋白和PCM-DM)的培养皿中iPS细胞的生长能 力均增强。
[0114] [实施例3]
[0115] 将根据实施例2使用Matrigel-或PCM-DM包被的塑料培养皿在MEF条件培养 基（无血清培养基A+ITS+FGF+TGF)中和未使用MEF条件化的培养基（无血清培养基 A+ITS+FGF+TGF)中培养的iPS细胞持续传五代。图3显示了对在此类培养中细胞生长速率 进行比较的结果。当使用来自无血清培养基A+ITS+FGF+TGF的MEF条件培养基对iPS细胞 进行培养时，其生长效率是使用未条件化培养基所达到的约300倍以上。
[0116] [实施例4]
[0117] 将根据实施例2使用玻连蛋白包被的塑料培养皿在MEF条件培养基（无血清培养 基A+ITS+FGF+TGF)中和未使用MEF条件化的培养基（无血清培养基A+ITS+FGF+TGF)中培 养的iPS细胞持续传四代。作为对照，使用MEF作为饲养细胞培养iPS细胞（饲养培养）， 并且在MEF-CM中培养iPS细胞。通过在DMEM/F12培养基（经Dulbecco改良的Eagle培 养基/营养混合物F-12Ham;SigmaD6421)中添加终浓度20%的KNOCKOUT?SR(KnockOut? 血清替代物或KSR;Gibc