胞进行无饲 养培养。
[0060] 将要在所述条件培养基中培养的多能干细胞可以事先采用常规技术维持培养。优 选地，使用分离液如胶原酶溶液将已进行维持培养的所述多能干细胞从培养容器中分离， 并且其形成由约几十个细胞例如约20至50个细胞形成的小团后回收所述细胞。当在维持 培养中使用饲养细胞时，优选地采用常规技术将饲养细胞从回收的多能干细胞中除去。当 使用MEF作为饲养细胞进行维持培养时，例如可以通过在明胶包被的培养容器中孵育回收 的多能干细胞以使得MEF附着在所述培养容器上并收集在培养基中悬浮的多能干细胞除 去MEF。
[0061] 将这样制备的多能干细胞优选地接种在包被了作为细胞支架的培养基质的 培养容器中。在此处也可以使用条件培养基的制备部分描述的培养容器。对培养 基质没有特别的限制，只要其能够用于细胞培养即可。培养基质的示例包括明胶、 由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)的小鼠肉瘤生产的Matrigel、层粘连蛋白（例如层 粘连蛋白-511、层粘连蛋白-111和层粘连蛋白-332)、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋 白、E-钙粘蛋白、合成肽、合成聚合物和来源于MEF的细胞外基质、人血清或来源于蜕 膜的间充质细胞（PCM-CM)。能够作为培养基质的合成聚合物的示例是水凝胶，例如 包含2-(二乙基氨基）丙烯酸乙酯作为骨架的温度敏感性水凝胶（Zhang等，Nature Communications, 2013, 4,articlenumber: 1335)。可以采用本领域技术人员熟知的常规技 术使用此类培养基质包被培养容器。例如，可以通过将培养基质溶液（例如玻连蛋白溶液） 加入培养容器并且孵育一段给定的时间（例如1小时）包被所述培养容器。
[0062] 多能干细胞可以在所述条件培养基中优选地在20°C至40°C(例如35°C至40°C) 下培养1小时至7天（例如1至24小时），但是培养条件不限于此。多能干细胞可以在所 述条件培养基中优选地在4%至10%的C02(例如5%C02)下培养。多能干细胞的培养可 以包括传代培养。
[0063] 与使用未条件化培养基获得的生长能力相比，这样培养的多能干细胞的生长能力 显著改善。在一个优选的实施方式中，在所述条件培养基中生长的所述多能干细胞的数量 与在未条件化培养基中生长的细胞数量相比优选地是其10倍或更多、更优选地100倍或更 多和更优选地200倍或更多，例如250至300倍。细胞数量的增加可以参照例如第五次传 代后计数的细胞数量评估。此外，可以将在所述条件培养基中培养的多能干细胞维持在非 分化状态。可以根据非分化标记物（例如SSEA3、SSEA4、Tral-60、Tral-81、0ct4、NAN0G、 S0X2等的基因或蛋白）的表达情况验证所述多能干细胞的非分化状态。
[0064] 这样制备的条件培养基含有能够促进多能干细胞在非分化状态下生长的物质 (即多能干细胞的生长促进因子），其由饲养细胞如MEF分泌。因此，根据本发明，可以对所 述条件培养基进行进一步筛选，以鉴定此类生长促进因子。在筛选中，可以在所述条件培养 基中检测多能干细胞生长促进因子，从而鉴定生长促进因子。因此，本发明还提供了一种筛 选多能干细胞生长促进因子的方法，所述方法包括回收这样产生的所述条件培养基并检测 在回收的条件培养基中含有的多能干细胞生长促进因子。多能干细胞的生长促进因子可以 是蛋白或核酸（例如RNA)、氨基酸、肽、糖链或低分子量化合物如代谢产物。
[0065] 在本发明的筛选方法中，优选地采用任意适宜的技术对回收的条件培养基进行 分离和/或纯化，随后鉴定生长促进因子。例如，可以使用电泳如二维电泳、等电电泳或 SDS-PAGE，层析技术如高效液相色谱（HPLC)、离子交换色谱或亲和层析，或质谱如基质辅助 激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI/T0FMS)或液相色/串联质谱（LC-MS/MS)分离和/ 或纯化和鉴定生长促进因子。将在所述条件培养基中的成分分析结果与在进行条件化之前 的无血清培养基中的培养基成分分析结果进行比较，可以将检测得到的在所述条件培养基 中含有的不同的成分作为多能干细胞生长促进因子候选物。因此，用于这种筛选目的时，优 选地用于条件化的无血清培养基的所有成分是已知的。
[0066] 对于检测在所述条件培养基中含有的多能干细胞生长促进因子而言，可以将从所 述条件培养基中分离或纯化或鉴定的成分（特别是多能干细胞生长促进因子的候选成分） 加入使用多能干细胞培养基培养的多能干细胞培养系统中，然后进行培养。可以对在培养 系统中的多能干细胞的生长能力（特别是非分化生长能力）进行考察并与对照进行比较， 即未加入相同成分的培养系统，以确定生长能力是否增强。如果生长能力（生长细胞数） 增强，例如10倍或更多，和优选地100倍或更多，则表明所述成分是多能干细胞的生长促进 因子。本发明的筛选方法可以包括检测条件培养基中的成分对多能干细胞生长促进活性的 步骤。可以通过进一步验证非分化标记物（例如SSEA3、SSEA4、Tral-60、Tral-81、0ct4、 NANOG、SOX2等的基因或蛋白）表达水平的保持情况确定多能干细胞在非分化状态下的生 长促进情况（即非分化生长）。
[0067] 可以将通过本发明的筛选方法获得的多能干细胞生长促进因子加入多能干细胞 的培养系统以促进所述多能干细胞的非分化生长。
[0068] 本发明还提供了一种多能干细胞的生长方法，所述方法包括使用能够用于多能干 细胞培养的无血清培养基将在饲养细胞上培养的多能干细胞转变成无饲养细胞的培养，并 且实现所述多能干细胞的无饲养培养。在所述多能干细胞生长方法的一个特别优选的实施 方式中，将使用含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠但不含血清或血清替代 物的无血清培养基在饲养细胞上培养的多能干细胞转变成无饲养细胞的培养，并且进行所 述多能干细胞的无饲养培养。即，根据所述方法，对多能干细胞进行维持培养，同时使用饲 养细胞条件化所述无血清培养基，然后对经培养的多能干细胞进行无饲养培养。根据该方 法，在无饲养培养中的多能干细胞的生长能力能够进一步被增强。
[0069] 在这种方法中使用的多能干细胞、饲养细胞、培养条件、程序和其他条件与上文所 述的相同。优选使用与上文所述的在所述条件培养基的制备中使用的相似的无血清培养 基。
[0070] 在一个实施方式中，通过使用含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠 并且不含精氨酸、血清或血清替代物的无血清培养基在饲养细胞上培养多能干细胞，然后 进行所培养的多能干细胞的无饲养培养可以使多能干细胞高效生长。根据这种方法，可以 特别优选地使用例如大分子化合物如Matriger或合成聚合物培养基质进行无饲养培养。 能够作为培养基质的合成聚合物的示例是水凝胶，例如包含2-(二乙基氨基）丙烯酸乙酯 作为骨架的温度敏感性水凝胶。例如，可以使用培养容器进行无饲养培养，如内部包被了所 述培养基质的培养皿。在饲养细胞上培养多能干细胞，从其中除去所述饲养细胞，并将所述 多能干细胞转变成在不含饲养细胞的培养容器中的培养基中培养。这样，可以优选地实现 无饲养培养。
[0071] 在这种方法中，可以使用由含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并 且不含血清或血清替代物的无血清培养基制备的条件培养基实现无饲养培养。或者，可以 使用任意其他无血清培养基代替条件培养基实现无饲养培养。根据这种方法，甚至在后者 改变的情况下，多能干细胞在无饲养培养中的生长（即非分化生长）也能够显著增加。 实施例
[0072] 在下文中，结合实施例对本发明进行更加详细的描述，但是本发明的技术范围不 限于这些实施例。
[0073] [实施例1]
[0074] 在这个实施例中，将已在经过丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF;饲 养细胞）中维持培养的非分化人iPS细胞转移至包被了玻连蛋白（VTN-N)的不含饲养细胞 的培养皿的孔中，然后在经MEF条件化的营养培养基中培养，如下文所述。
[0075] 1.人iPS细胞的制备
[0076] 使用来自iPSAcademiaJapan,Inc.(日本京都）（TakahashiK.等，Cell 131，1-12, 2007)的201B7细胞系作为人iPS细胞（非分化的人iPS细胞）。在塑料培养皿 中对人iPS细胞进行维持培养，其中已接种了经过丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细 胞（MEF;饲养细胞）。使用通过在DMEM/F12培养基（经Dulbecco改良的Eagle培养基/ 营养混合物F-12Ham;SigmaD6421)中添加终浓度20%的KNOCKOUT?SR(KnockOut?血清替 代物或KSR;Gibco)、0.ImMNEAA(非必需氨基酸）、2mML-谷氨酰胺、5ng/ml人FGF2 (称为 "碱性FGF"或"bGFG"）和0.ImM2-巯基乙醇制备的培养基在C02培养箱中在37°C和5% 〇)2条件下进行培养。每6或7天传代一次。在传代过程中，使用分离液（胶原酶溶液）将 人iPS细胞集落与饲养细胞层分离，并通过吹打形成约20至50个细胞的小团，然后接种在 新鲜的饲养细胞层上。
[0077] 使用分离液分离如上文所述在饲养细胞上维持培养的人iPS细胞，经吹打形成约 20至50个细胞的小团，并且在300rpm下离心5分钟以回收iPS细胞。在包被了明胶的培 养皿上孵育回收的iPS细胞30分钟，从而使MEF粘附在皿上，收集培养基中悬浮的iPS细 胞，以除去MEF。随后，将回收的iPS细胞分成4部分（1/4等分），并将细胞接种在经玻连 蛋白（VTN-N;Gibco)包被的塑料培养皿中。通过使用0. 5yg/cm2的玻连蛋白溶液在室温 下孵育1小时使用玻连蛋白（VTN-N)包被培养皿。
[0078] 2.条件培养基的制备
[0079] 使用经丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)由无血清培养基制备条 件培养基（CM)。以每60-mm平皿约500, 000个细胞的细胞密度将经丝裂霉素处理灭活的小 鼠胚胎成纤维细胞（MEF)接种在MEF的培养基中（添加了 10%FBS的DMEM培养基）。在 细胞孵育至少16小时后，先使用PBS(-)再使用无血清培养基洗涤细胞，并且将培养基换成 新鲜的相同无血清培养基。所使用的无血清培养基的成分如下所示。
[0080] -无血清培养基A(DMEM/F12培养基、64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁和543mg/L碳 酸氢钠）。
[0081] -无血清培养基A+ITS(DMEM/F12培养基、64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁、543mg/L 碳酸氢钠和1%ITS(