一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外胚胎发育的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵 羊体外胚胎发育的方法。
【背景技术】
[0002] 卵泡抑素（Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡 液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽。它可以通过与activin蛋白的结 合抑制促卵泡激素的分泌。卵泡抑素不仅可以阻碍activin蛋白的作用，还能降低包括 myostatin(MSTN)、GDF_9、bonemorphogeneticproteins(BMPs)在内的其它TGF-0 家族 成员功能的发挥。通过与这些TGF-0家族成员的结合，卵泡抑素广泛参与了生物体多种生 理功能的调控，包括繁殖、生长发育、神经诱导、渗透压调节、肌细胞生成和免疫调节。但目 前，还没有Follistatin对绵羊体外胚胎培养发育影响的报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于：利用卵泡抑素Follistatin对绵羊卵母细胞体外受精后的早 期胚胎进行处理，找到一种促进绵羊体外胚胎发育的方法。
[0004] 实现本发明的目的技术方案如下：一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体 外胚胎发育的方法，该方法步骤如下：（1)在绵羊屠宰场获取宰杀后30分钟以内的绵羊卵 巢，置入温度在30-35°C，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3-5小 时内用生理盐水清洗3-4次；（2)然后，用吸有2ml抽卵液注射器抽吸卵巢表面2-5mm大 小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液 洗涤3-5次，备用；（3)将步骤（2)中选择的卵母细胞，在条件为5%C02,95%空气，温度为 38. 6°C的C02培养箱内培养22-24小时，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴 的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；(4)将解冻后的冻精，放入装有体外受精液的 试管底部，C02培养箱内上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心 4-5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4X106个/ml的密度加入步骤 (3)的体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育；（5)将步骤（4)中受精20-22小时的早期胚胎 取出，移至含有10Ug/LFollistatin的体外培养液IVC1内洗涤3-4次，并再次培养24-26 小时；（6)将步骤（5)中在IVC1内培养24-26小时后的胚胎取出，再用常规的体外培养液 IVC2洗涤3-4次，统计卵裂率，并继续培养，144-168小时后统计囊胚率。
[0005]所述的抽卵液为：TCM199_hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素钠； 体外成熟液（IVM)为：TCM199-HC03+10%FBS+0. 05IU/mlFSH+0. 05IU/mlLH+1yg/ml雌二醇 +24. 2yg/ml丙酮酸钠 +0.ImM/L半胱氨酸 +10ng/mlEGF+lOOIU/ml青霉素 +100IU/ ml链霉素； 体外受精液（IVF)为：S0F+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素； 体外培养液1(IVC1)为：S0F+3mg/mlBSA+lOyg/LFollistatin; 体外培养液 2(IVC2)为：S0F+3mg/mlBSA; 其中所述合成输卵管液（SOF)为：6. 29mg/mlNaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/ml KH2P04+0. 6ul/ml乳酸钠 +0? 089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml丙酮酸钠 +0? 299mg/mlCaCL2 ? 2H20。
[0006] 有益效果：通过卵泡抑素Follistatin对绵羊卵母细胞体外受精后的早期胚胎进 行处理，能显著提高体外胚胎发育囊胚率。为科研生产实践探索出一条新的生物学方法。
【具体实施方式】
[0007] 实施例1 :摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30-35°C，含1000IU/ml青 霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3-4次；用吸有2ml抽卵 液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2-5_大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡 液打在35-60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3次；在条件为5% C02,95%空气，温度为38. 6°C的C02培养箱内培养22-24小时，用体外受精液洗涤2-4次；按 25-30枚/滴的密度加入2小时前平衡好的50-70y1的体外受精液滴内；用水浴解冻精液， 移入2小时前平衡好的装有体外受精液的试管底部，放入C02培养箱，上游20-25分钟，取 上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进 行密度计算，按2-4X106个/ml的密度加入上述放有卵母细胞的体外受精液滴，与卵母细 胞共同孵育；将受精20-22小时的早期胚胎取出，用平衡好的添加了10yg/LFollistatin 的体外培养液IVC1内洗涤3-4次，并用IVC1培养24-26小时；用不含Follistatin的体外 培养液IVC2洗涤3次，统计卵裂率，并继续培养，168小时后统计囊胚率。
[0008] 其中实验液体的配置：抽卵液：TCM199_hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素钠； 体外成熟液（IVM) :TCM199-HC03+ 10%FBS十0? 05IU/mlFSH十0? 05IU/mlLH十 1yg/ml雌二醇+24. 2yg/ml丙酮酸钠+0.ImM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素； 合成输卵管液（SOF) :6. 29mg/mlNaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/mlKH2P04+0. 6y1/ml乳酸纳 +0? 089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml丙酬酸纳 +0? 299mg/ml CaCL2 ? 2H20 ; 体外受精液（IVF) :S0F+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素； 体外培养液 1(IVC1) :S0F+3mg/mlBSA+lOyg/LFollistatin; 体外培养液2(IVC2) :S0F+3mg/mlBSA。
[0009] 实验结果及数据验证：用一组数据验证添加Follistatin的有效性。
[0010] 表 1
【主权项】
1. 一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外胚胎发育的方法，其特征在于：该方 法步骤如下： (1) 在绵羊屠宰场获取宰杀后30分钟以内的绵羊卵巢，置入温度在30-35 °C，含 1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3-5小时内用生理盐水清洗3-4次； (2) 然后，用吸有2ml抽卵液注射器抽吸卵巢表面2-5_大小的卵泡，将注射器内回收 的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，备用； (3) 将步骤（2)中选择的卵母细胞，在条件为5%C02,95%空气，温度为38. 6°C的0)2培 养箱内培养22-24小时，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体 外受精液的液滴内，备用； (4) 将解冻后的冻精，放入装有体外受精液的试管内，CO2培养箱内培养20-25分钟，取 上清液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计 算，按2-4XIO6个/ml的密度加入步骤（3)的体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育； (5) 将步骤（4)中受精20-22小时的早期胚胎取出，移至含有10yg/LFollistatin的 体外培养液IVCl内洗涤3-4次，并再次培养24-26小时； (6) 将步骤（5)中在IVCl内培养24-26小时后的胚胎取出，再用常规的体外培养液 IVC2洗涤3-4次，统计卵裂率，并继续培养，144-168小时后统计囊胚率。
2. 根据权利要求1所述的一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外早期胚胎发育 的方法，其特征在于：所述的抽卵液为：TCM199-hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素钠； 体外成熟液（1雅)为：!111199-110)3+109^85+0.05叨/1111?511+0.05叨/11111^+11^/1111雌 二醇 + 24. 2yg/ml丙酮酸钠 +0.ImM/L半胱氨酸 +10ng/mlEGF+100IU/ml青霉素 +100IU/ ml链霉素； 体外受精液（IVF)为：S0F+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素； 体外培养液I(IVCl)为：S0F+3mg/mlBSA+10yg/LFollistatin; 体外培养液 2 (IVC2)为：S0F+3mg/mlBSA; 其中所述合成输卵管液（SOF)为：6. 29mg/ml NaCL +0.534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ ml KH2P04+0. 6ul/ml 乳酸钠 +0? 089mg/ml MgS04+2. lmg/ml NaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸钠 +0? 299mg/ml CaCL2 ? 2H20。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外胚胎发育的方法，步骤如下：（1）获取宰杀后绵羊卵巢；（2）抽吸卵泡备用；（3）选择的卵母细胞，在CO2培养箱内培养，加入装有体外受精液的液滴内；（4）放入体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育；（5）将早期胚胎取出，移至含有10μg/L Follistatin的体外培养液洗涤3-4次，并再次培养24-26小时；（6）将胚胎取出，用体外培养液洗涤，统计卵裂率，培养144-168小时后统计囊胚率。通过卵泡抑素Follistatin对绵羊卵母细胞体外受精后的早期胚胎进行处理，能显著提高体外胚胎发育囊胚率。
【IPC分类】C12N5-073
【公开号】CN104694463
【申请号】CN201510107124
【发明人】黄俊成, 汪立芹, 吴阳升, 林嘉鹏, 何宗霖, 唐森, 阿米娜·阿布都瓦力
【申请人】新疆畜牧科学院生物技术研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月10日