一种用于细胞培养的微载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种用于细胞培养的微载体及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 动物细胞是疫苗等蛋白质药物所借助的主要生产载体。在疫苗的生产过程中，动 物细胞的培养和表达决定了疫苗的产量和生产效率。在动物细胞的大规模培养技术中，微 载体培养法具有多种优势：其比表面积大，单位体积培养液的细胞产率高；采用均匀悬浮 培养，无营养物或产物梯度；易于观察微载体表面的生长情况；细胞收获过程相对简单，劳 动强度小；培养基利用率高，占地面积小以及放大容易等，是目前公认的最有发展前途的一 种培养模式。由于对该技术的重视，国外已开发了大量微载体，部分已经商品化，其主要的 基质材料有交联葡聚糖、纤维素、蛋白质、高分子合成材料、无机玻璃材料以及液膜微载体 等。以交联葡聚糖为基质材料的微载体是目前使用最广的一类，大家熟悉的Cytodex系列 (GE公司）就是这类微载体，其中Cytodexl(即DEAE-交联葡聚糖）是当前用途最广的一 种微载体，是以交联葡聚糖微球为基质，再偶联上DEAE制备的带有正电荷的微载体。还有 CytodeX3,它是将一层变性胶原（来自猪皮I型胶原）用化学偶联的方式连接到交联葡聚 糖基质上。
[0003] 微载体的性能和结构，尤其是微载体的基质材料、亲水性、表面化学结构、电荷性 质和表面形状、基质结构等对细胞的贴附、生长和增殖都有重要影响。在细胞培养微载体的 实际应用中，人们发现带有正电荷的微载体与蛋白/多肽覆层微载体相比，前者细胞贴附 更快，而后者细胞生长速率更高，如果能将二者结合，将是性能更为优越的微载体，这对于 一些粘附力低、又对电荷比较敏感的细胞系更为关键。粘附力低需要较强的细胞_载体间 的相互作用，以促进细胞在微载体上的贴附，对电荷敏感又限制了电荷密度不应过高，否则 在电荷的"毒性"作用下会抑制细胞的生长，而电荷-蛋白或电荷-多肽双重作用微载体则 能很好的解决这个问题。目前，有关电荷和蛋白/多肽双重作用微载体的研究报道并不多， 一般使用带电荷的材料与蛋白/多肽共混后，再形成膜或者制备成微球。其带电荷的材料 一般为壳聚糖和聚氨酯，这种微载体是基质材料与蛋白/多肽的共混制备而成，或者是先 制成微球后再偶联蛋白/多肽；无论哪种方法蛋白/多肽都由于分子扩散作用而均匀分散 在微球内部。实际上，细胞与微载体的作用主要发生于微载体的表面，分散于微球内部的蛋 白/多肽并不能起到太大的作用，尤其是一些多肽的价格昂贵，大量进入微球内部而没有 发挥作用会造成巨大浪费，产品成本因此提高，限制了电荷-蛋白/多肽双重作用微载体的 广泛应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种蛋白/多肽覆层厚度可控、且具有正电荷和蛋白/多 肽双重作用的用于细胞培养的微载体及其制备方法和应用。
[0005] -方面，本发明提供一种用于细胞培养的微载体，所述微载体带有正电荷和蛋白/ 多肽覆层。
[0006] 优选地，所述蛋白/多肽覆层的厚度可控；
[0007] 优选地，所述蛋白/多肽覆层的厚度为微载体基质半径的5~50%，例如可以是 微载体基质半径的 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或 50%;优选为 10 ~ 30 %。在限定的层厚内，微载体既能充分发挥蛋白、多肽的作用，又不会完全遮蔽电荷，能够 发挥电荷和蛋白、多肽的双重作用。
[0008] 蛋白/多肽的层厚使用激光共聚焦显微镜进行测定，优选使用异硫氰酸荧光素 (FITC)为荧光指示剂，由于FITC能够很容易地与蛋白/多肽结合，而不吸附到多糖微球上， 因此可以观察到蛋白/多肽覆层上明亮的绿色荧光，以确定蛋白/多肽层的厚度。
[0009] 优选地，所述蛋白为纤维连接蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、 软骨粘连蛋白或明胶中的一种或其中至少两种的混合物；所述明胶为猪明胶、鱼明胶或牛 明胶中的一种或其中至少两种的混合物，例如猪明胶、或牛明胶、或猪明胶和鱼明胶的混合 物、鱼明胶和牛明胶的混合物、或猪明胶、鱼明胶和牛明胶三者的混合物；
[0010] 优选地，所述蛋白的分子量为3,000~50,000，例如可以是3,000、4,000、5,000、 6, 000、7, 000、8, 000、9, 000、10, 000、20, 000、30, 000、40, 000 或 50, 000 ;优选为 5, 000 ~ 50, 000,进一步优选 5, 000 ~20, 000 ;
[0011] 优选地，所述多肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝 氨酸-精氨酸、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脱氢视黄醇、多聚赖氨酸、多鸟氨酸 或含有上述多肽片段的蛋白；
[0012] 优选地，所述微载体的电荷密度为0. 1~10mmol/g干球，例如可以是0.lmmol/g 干球、0? 2mmol/g干球、0? 3mmol/g干球、0? 4mmo1/g干球、0. 5mmol/g干球、0?Bmmol/g干球、 0. 7mmo1/g干球、0. 8mmo1/g干球、0. 9mmo1/g干球、lmmol/g干球、2mmol/g干球、3mmol/g干 球、4mmol/g干球、5mmol/g干球、6mmol/g干球、7mmol/g干球、8mmol/g干球、9mmol/g干球 或lOmmol/g干球；优选为0. 5~5mmol/g干球，进一步优选0. 8~3mmol/g干球；基质微 球偶联正电荷或者由自身带有电荷的材料制备的微球，在进一步偶联蛋白和多肽后，由于 蛋白多肽的遮蔽作用，原有的电荷密度会有所下降，因此其最终的电荷密度控制在0.1~ 10mmol/g干球；
[0013] 电荷密度通过测定所述双重作用微载体的全交换容量来表征，具体方法参考CN 102732475A。
[0014] 优选地，所述微载体的基质为天然高分子或合成高分子，所述天然高分子为多糖 类，优选为魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖或纤维素，进一步优选为魔芋 葡甘聚糖或葡聚糖；所述合成高分子为聚苯乙烯、聚氨酯或聚乙烯；
[0015] 优选地，所述微载体的粒径为50~800iim，例如可以是50iim、100iim、150iim、 200um>250um>300um>350um>400um>450um>500um>550um>600um>650um>700um> 750iim或 800iim;优选为 100 ~300iim。
[0016] 另一方面，本发明提供如第一方面所述微载体的制备方法，包括如下步骤：
[0017] (1)将微载体的基质与正电荷修饰剂化学交联；
[0018] (2)步骤（1)得到的带正电荷的基质微球再与蛋白/多肽交联。
[0019] 优选地，步骤（1)包括如下步骤：
[0020] a)在基质微球中加入活化剂，进行活化反应，得到活化微球；
[0021] b)步骤a)反应完成后，洗去未反应的活化剂，抽干；
[0022] c)将步骤b)反应完成的体系加入Na2C03-Na2HC0^冲液中，再加入正电荷修饰剂 与活化后的微球进行交联反应；
[0023] d)步骤c)反应完成后，洗去未反应的物质，即得带正电荷的基质微球；
[0024] 优选地，步骤（2)包括如下步骤：
[0025] e)将洗净抽干后的带正电荷的基质微球与蛋白/多肽一起加入缓冲液中，搅拌反 应；
[0026] f)冷凝步骤e)反应后的产物，清洗抽干；
[0027] h)依次用去离子水和缓冲液清洗，抽干，即得蛋白/多肽覆层的带正电荷微载体；
[0028] 任选地，步骤（2)还可以采用如下步骤：
[0029] 2-1 :带正电荷基质微球的活化；
[0030] 2-2 :活化后的带正电荷基质微球与蛋白/多肽的结合；
[0031] 其中，步骤2-1包括如下步骤：
[0032] i)将带正电荷的基质微球洗净抽干；
[0033] j)在步骤i)所得的基质微球中加入活化剂，搅拌反应；
[0034]k)步骤j)结束后，将所得料液抽干，清洗后再次抽干，即得活化后的带正电荷基 质微球；
[0035] 其中，步骤2-2包括如下步骤：
[0036] 1)将带正电荷的基质微球洗净抽干；
[0037] m)将步骤1)所得基质微球，以及蛋白/多肽加入缓冲液中，搅拌反应；
[0038] n)冷凝步骤m)所得产物，清洗并抽干后，加入缓冲液和蛋白/多肽分子的交联剂， 恒温搅拌反应；
[0039] 〇)抽干步骤n)所得料液，清洗并再次抽干，即得蛋白/多肽覆层的带正电荷微载 体。
[0040] 在带正电荷的基质微球与蛋白/多肽发生交联反应时，所述反应体系的pH值高于 蛋白/多肤的等电点。
[0041] 优选地，所述活化剂和蛋白/多肽分子的交联剂为带有双官能团或多官能团取代 的化合物；所述官能团选自卤素、胺基、环氧基、取代的缩水甘油醚基、胍基、烯烃基或羧基； 所述双官能团或多官能团取代的化合物选自卤素和环氧基取代的烷烃、烯基取代的缩水甘 油醚基或氨基取代的烯烃；优选为环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷或 1，4- 丁二醇醚；所述蛋白/多肽分子的交联剂具有能够与蛋白/多肽反应的官能团；所述 交联剂上的双官能团或多官能团分别与微球、正电荷修饰剂或蛋白/多肽覆层物连接，或 所述交联剂上的双官能团或多官能团经过活化后分别与微球、修饰剂或覆层物连接。
[0042] 优选地，步骤a)中所述活化剂的用量为0. 1~100mmol/g微球，例如可以是 0.lmmol/g微球、0? 5mmol/g微球、lmmol/g微球、2mmol/g微球、3mmol/g微球、4mmol/g微 球、5mmol/g微球、6mmol/g微球、7mmol/g微球、8mmo