一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于枯草芽孢杆菌重组菌株构建技术领域，具体涉及一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。
【背景技术】
[0002]普鲁兰酶是一类由微生物分泌表达的淀粉解枝酶，I型普鲁兰酶能够专一性切开支链淀粉分支中的α -1, 6糖苷键，形成直链淀粉，普鲁兰酶与其他淀粉酶协同作用，在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。因此，世界各国投入大量人力、财力开发普鲁兰酶的生产菌株，迄今为止，已经发现许多微生物能够产生普鲁兰酶，但由于当今工业生产条件(耐酸性，耐高温条件)所限,大多数微生物所产的普鲁兰酶并无太大商业价值，所发现的大多数普鲁兰酶不能同时满足淀粉加工工业中的耐高温耐酸的生产需求，酶学性质存在热稳定性不高、抗酸性不强等缺点。
[0003]来自长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶(Bn PulB)最适温度62.5°C，最适pH在5.0以下，最佳催化温度在60°C左右，非常适合糖化加工，但该酶在原菌中的表达量并不能满足工业放大生产需求，而枯草芽胞杆菌因分泌能力强大，被列为安全微生物(GRAS)之一，十分适于食品级普鲁兰酶的工业生产，它是进行胞外酶发酵生产的首选微生物之一，常用的模式菌株枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis W168(以下简称枯草芽胞杆菌168)不产普鲁兰酶，易于被改造，是进行重组普鲁兰酶生产构建的理想菌株。
[0004]目前对微生物进行改造较为简单直接的方法，是将目的基因构建到质粒中，然后将质粒转入到改造的菌株，因为独立复制的质粒不似基因组的复制稳定，因此，往往需要通过在培养基中添加抗生素来增加菌株中质粒的稳定性。但是在食品工业中，这种重组菌株需要使用抗生素，而携带抗生素基因的重组菌株越来越不被接受。因此，进行外源基因的无痕导入方式成了构建食品工业微生物的主要构建方式，这种方式是通过与微生物进行同源重组，并进行二次重组筛选，得到无抗的生产菌株。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是，提供一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。旨在解决现有技术中微生物所产的普鲁兰酶热稳定性不高、抗酸性不强、产量不高的技术问题。
[0006]本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下:
[0007]一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌通过如下方式获得:将含有表达普鲁兰酶基因的人工操纵子BPB原位替代枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶基因nprE ;所述人工操纵子BPB的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0008]优选地，采用模式菌株枯草芽孢杆菌168作为出发菌株构建所述重组枯草芽孢杆菌。
[0009]所述人工操纵子BPB通过重组质粒pGE-BPB转入枯草芽孢杆菌中，所述重组质粒pGE-BPB的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]所述人工操纵子BPB包含有串联人工启动子Pga2。所述串联人工启动子Pga2的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，它由PyxiE启动子和cry3A RNA稳定因子拼接而成，cry3ARNA稳定因子可以提高mRNA的衰解期，提高蛋白的表达量，启动子Pga2的制备由化学合成法完成。
[0011 ] 所述人工操纵子BPB还包含:经密码子优化获得的PUlB基因，所述PUlB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。所述pulB基因以枯草芽胞杆菌使用频率最高的密码为参照，对原基因进行了优化，其表达的普鲁兰酶蛋白具有耐酸热的特点。
[0012]所述人工操纵子BPB还包含:来自地衣芽胞杆菌淀粉酶分泌的信号肽序列SPamyL,以及来自解淀粉芽孢杆菌aprE基因的终止子序列T_aprE ;所述T_aprE的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0013]所述重组质粒pGE-BPB，除了含有人工操纵子BPB，还同时带有用于枯草芽胞杆菌中性蛋白酶nprE无痕敲除的重组臂，该重组质粒pGE-BPB通过二次重组方式将枯草芽孢杆菌感受态细胞中的中性蛋白酶基因nprE敲除。用于中性蛋白酶基因nprE敲除的重组臂DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0014]本发明还提供了所述高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌发酵生产普鲁兰酶的方法，该方法为:在基础培养基中加入4.5 %的蔗糖及6.0 %的麸皮加豆柏，控制起始发酵pH值为6.2-6.3，在上述培养条件下对所述重组枯草芽孢杆菌进行发酵培养，生产获得普鲁兰酶。
[0015]本发明还提供一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，该方法包括如下步骤:
[0016]步骤1，将用于表达普鲁兰酶的人工操纵子BPB构建重组质粒pGE-BPB ;所述人工操纵子BPB的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；
[0017]步骤2，将前述构建的重组质粒pGE-BPB转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞中，通过二次重组使得所述人工操纵子BPB原位替代枯草芽孢杆菌感受态细胞中的中性蛋白酶基因 nprEο
[0018]所述重组质粒pGE-BPB通过二次重组方式将枯草芽孢杆菌感受态细胞中的中性蛋白酶基因nprE敲除，用于中性蛋白酶基因nprE敲除的重组臂DNA的核苷酸序列如SEQID N0.6 所示。
[0019]所述高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法按下述完成，首先将重组质粒pGE-BPB转入枯草芽胞杆菌168中，通过含有红霉素的培养板筛选获得抗性菌株，以普鲁兰酶基因pulB为模板，设计引物，通过PCR鉴定出阳性克隆后，将前述筛选获得的整合了普鲁兰酶及抗生素基因的抗性菌株接种到不含抗性的培养基中进行连续传代培养，传5-6次后，将菌液稀释到103-104/ml的细胞浓度，然后进行涂板，对获得的单克隆菌落再进行PCR的鉴定，根据重组菌中普鲁兰酶基因的获得确定出人工操纵子BPB序列原位替代了 nprE的无抗重组克隆。
[0020]本发明还提供了一种用于表达普鲁兰酶的基因序列，该基因序列为人工操纵子BPB的核苷酸序列或者与人工操纵子BPB具有90%以上同源性的核苷酸序列，所述人工操纵子BPB的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0021]本发明还提供了一种用于表达普鲁兰酶的重组质粒pGE-BPB，该重组质粒pGE-ΒΡΒ的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0022]本发明还提供了一种普鲁兰酶基因，该普鲁兰酶基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示。
[0023]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0024]本发明从优化原始菌株的耐酸热普鲁兰酶基因开始，利用合成生物学的方法，将多种可以提高基因转录水平的分子元件，包括启动子，mRNA稳定因子，分泌信号肽序列，终止子等组装成一个人工操纵子，并通过将它们构建到重组质粒中，再利用枯草芽胞杆菌自身的中性蛋白酶基因nprE的上下游同源片段，将人工操纵子元件整合到枯草芽胞杆菌168的基因组，再通过无抗培养的方式，结合分子生物学手段进行二次重组后的菌株筛选，最终得到产普鲁兰酶的无抗重组枯草芽胞杆菌CH-1，该重组菌株可发酵高产普鲁兰酶，单位酶活 >300U/ml。
[0025]本发明中，以枯草芽胞杆菌的中性蛋白酶基因nprE为同源重组对象，经过二次重组后，可以将表达普鲁兰酶的人工操纵子原位替代nprE基因，不仅使普鲁兰酶得到重组表达，还将影响外源蛋白表达水平的中性蛋白酶进行了基因敲除。影响芽胞杆菌外源蛋白的胞外表达水平的因素很多，其中包括启动子、mRNA结构、终止子、分泌信号肽的选择等在内的基因操纵子的结构最为关键，对芽胞杆菌的启动子、RNA稳定因子、分泌信号肽等影响转录水平的因素，国内外专家作了大量研究，本发明综合了以上影响因素，设计了双联方式的人工启动子Pga2，包含了高效启动子PyxiA及Cry3A RNA稳定因子。同时，表达不同来源的外源基因时，不同种属特异性的密码子选择倾向有时会严重影响蛋白的翻译效率，从而导致蛋白表达水平的低水平表达，本发明中通过基因合成方式获取基因资源普鲁兰酶基因pulB，通过密码子优化的方式提高普鲁兰酶蛋白的翻译效率。
【附图说明】
[0026]图1为重组枯草芽孢杆菌发酵生产普鲁兰酶时酶活随发酵时间变化的示意图；
[0027]图2为重组枯草芽孢杆菌在优化培养基中发酵生产普鲁兰酶时酶活与初始发酵pH值之间关系的不意图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
[0029]实施例1:重组质粒pGE-BPB的构建
[0030]用于普鲁兰酶表达的基因操纵子BPB包括一个由串联启动子Pga2以及进行了密码子优化的编码Bn PulB (其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示)的基因序列和终止子序列T-aprE,其中Pga2是由启动子PyxiE及RNA稳定因子CryIIIA构成(Pga2的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)，紧随起始密码子ATG后的序列是SPamyL，相关的核苷酸序列由金唯智生物技术公司利用DNA化学合成法生成基因片段，构建获得基因操纵子BPB，然后将基因操纵子BPB克隆到质粒pUC57，生成pUC57-BPB。两端带有Eco RI位点的BPB由PCR获得，PCR由以下方法获得:[0031 ]上游引物:CAAGGAATTCCATGGCCGGCCGACCGGG
[0032]下游引物:AGCAGAATTCTTAITTACCATCAGATGG
[0033]DNA模板的制取方法为:取10ng/μ I的pUC57_BPB溶液，稀释10000倍后，取
1.0μ I为模板。
[0034]PCR反应体系如下:
[0035]1XPfx buffer(购自 Invitrogen 公司，含 Mg 离子、dNTP mixture 等)5.0 μ I ;
[0036]上游引物(10μΜ)，3.0μI ;
[0037]下游引物(10μΜ)，3.0μI
[0038]DNA模板，1.Ομ I;
[0039]Pfx 聚合酶(5υ/μ 1)，0.5μ I ;
[0040]加水至50 μ I。
[0041]在Mastercycler普通PCR仪(Eppendorf)上运行以下程序:
[0042]l)95°C,2min
[0043]2)94°C,20sec
[0044]3)55°C,45sec
[0045]4)68°C,4min
[0046]5)循环从2)到4)，30次
[0047]6)68°C,3min
[0048]7)4°C，保存。
[0049]PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化后，以限制性内切酶Eco RI酶切，与经Eco RI和去磷酸化处理的线性质粒DNA pGENE-nprLR以T4DNA连接酶连接，连接液转入大肠杆菌DH5 α，从大肠杆菌中分离得到