基于重组酶的逻辑与存储系统的制作方法
【专利说明】基于重组酶的還辑与存储系统
[OOCM] 相关申请
[0002] 本申请按照35U.S.C. § 119(e)要求2012年12月13日提交的美国临时申请号 61/736, 792和2013年1月26日提交的美国临时申请号61/757, 113的权益，其各自通过引 用整体并入本文中。
[0003] 联邦政府资助研究
[0004] 本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金No. 0D008435W及空间和海上作战 系统中屯、（Spaceand化valWarfareSystemsCenter)提供的合同No.N66001-12-C-4016 的政府资助下完成的。政府对发明享有一定权利。
【背景技术】
[0005] 合成生物学的一个重要目标是创建整合输入信号W作出决策和采取行动的细胞 网络[1]。近年来，已经独立构建了人工逻辑口 [2-4]和存储设备[5,6]。在之前实现细胞 逻辑的过程中，复杂的口需要多个基因电路的分层巧，7]，因此，需要为电路构建体和调整 做出重大努力。运些复杂的逻辑口仅能实现组合逻辑。
【发明内容】
[0006] 本发明特别提供了用于在活细胞中集成组合逻辑与存储的合成的基于重组酶的 系统。集成逻辑与存储对于执行复杂而持久的状态依赖性计算（如时序逻辑）是至关重要 的巧]。使用所限定的一组编程规则，本发明的逻辑与存储系统能够高效地、一步到位组建 任何布尔逻辑函数，对事件进行稳定的、基于DNA的存储。运些系统利用化学诱导物输入 来驱动正交重组酶（〇：rthogonalrecombinase)从启动子表达。运些重组酶祀向DNA反向 (inversion)或切除的遗传元件，从而导致有条件的核酸表达。运种逻辑与存储系统对于多 种应用（包括编程细胞状态机、用于治疗诊断的行为和途径W及基础科学应用）是有用的。
[0007] 因此，在本发明的一些方面，本文中提供了可在单个细胞中运行的合成逻辑与存 储系统，该系统包括多个核酸序列，所述多个核酸序列编码至少两个启动子和至少两种重 组酶，其中多个编码重组酶的核酸序列中的每一个与不同的启动子有效连接；多个逻辑口， 所述多个逻辑口是与基因调控元件（例如启动子和/或单向终止子）有效连接或者有条件 地有效连接的输出核酸序列的单基因电路构建体（singlegeneticcircuitconstruct), 其中输出核酸和基因调控元件（例如启动子及单向终止子）中的至少一个的侧翼有至少 一种重组酶的正向识别位点和反向识别位点，并且其中除了TR肥逻辑口和FALSE逻辑口之 夕F，逻辑口提供所有的二输入布尔逻辑函数。
[0008] 在本发明的一些方面，本文中提供了可在单个细胞中运行的合成逻辑与存储系 统，该系统包括多个核酸序列，所述多个核酸序列编码至少两个启动子和至少两种重组酶， 其中多个编码重组酶的核酸序列中的每个核酸序列与不同的启动子有效连接；多个逻辑 n，所述多个逻辑口是与基因调控元件（例如启动子和/或单向终止子）有效连接或者有 条件地有效连接的输出核酸序列的单基因电路构建体，其中输出核酸和基因调控元件例如 启动子及单向终止子中的至少一个的侧翼有至少一种重组酶的正向识别位点和反向识别 位点，并且其中逻辑口提供至少两个二输入布尔逻辑函数。在一些实施方案中，逻辑口提供 至少=个二输入布尔逻辑函数、至少四个二输入布尔逻辑函数、至少五个二输入布尔逻辑 函数、至少六个二输入布尔逻辑函数、至少屯个二输入布尔逻辑函数、至少八个二输入布尔 逻辑函数或至少九个二输入布尔逻辑函数。在一些实施方案中，逻辑口提供TR肥逻辑口和 FALSE逻辑口，而在另一些实施方案中，逻辑口不提供TR肥逻辑口和FALSE逻辑口。
[0009] 重组酶的表达与目的信号有效连接，例如外部输入信号或细胞调控信号。在一些 实施方案中，至少两个启动子中的一个或更多个启动子是诱导型启动子。
[0010] 在一些实施方案中，至少两种重组酶是不可逆重组酶。在一些实施方案中，至少两 种不可逆重组酶是丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，丝氨酸重组酶是Bxbl和地iC31。
[0011] 在一些实施方案中，逻辑口为NOR、AND、OR、NAND、A、NOTA、B、NOTB、AIMPLYB、 ANIMPLYB、BIMPLYA、BNIMPLYA、XOR及XNOR。在一些实施方案中，本发明的合成逻辑与 存储系统还包括TR肥逻辑口和/或FALSE逻辑口，其中TR肥逻辑口是与启动子有效连接 的输出核酸序列的单基因电路构建体，W及其中FALSE逻辑口是紧接反向启动子下游的输 出核酸序列的单基因电路构建体。
[0012] 在一些实施方案中，输出核酸编码输出产物。在一些实施方案中，输出产物是报道 蛋白（reporterprotein)、转录阻遏物、转录激活因子、选择标志物、酶、受体蛋白、配体蛋 白、RNA、核糖开关、短发夹RNA或重组酶。
[0013]在一些实施方案中，NOR逻辑口是（a)与启动子有效连接的输出核酸和化）两个 单向终止子的单基因电路构建体，其中每个终止子是反向的并且侧翼有不同的正向和反向 重组酶识别位点并且每个终止子位于启动子与输出核酸之间。
[0014] 在一些实施方案中，AND逻辑口是与启动子有条件地有效连接的输出核酸的单基 因电路构建体，其中输出核酸和启动子各自是反向的并且侧翼有不同的正向和反向重组酶 识别位点。
[0015] 在一些实施方案中，OR逻辑口是与两个启动子有条件地有效连接的输出核酸的 单基因电路构建体，其中每个启动子是反向的并且侧翼有不同的正向和反向重组酶识别位 点。
[0016] 在一些实施方案中，NAND逻辑口是与两个启动子有效连接的输出核酸的单基因电 路构建体，其中每个启动子的侧翼有不同的正向和反向重组酶识别位点。
[0017] 在一些实施方案中，A逻辑口是与启动子有条件地有效连接的输出核酸的单基因 电路构建体，其中输出核酸是反向的并且侧翼有正向和反向重组酶识别位点。
[0018] 在一些实施方案中，B逻辑口是与启动子有条件地有效连接的输出核酸的单基因 电路构建体，其中启动子是反向的并且侧翼有正向和反向重组酶识别位点。
[0019] 在一些实施方案中，NOTA逻辑口是与启动子有效连接的输出核酸的单基因电路 构建体，其中输出核酸的侧翼有正向和反向重组酶识别位点。
[0020] 在一些实施方案中，NOTB逻辑口是与启动子有效连接的输出核酸的单基因电路 构建体，其中启动子的侧翼有正向和反向重组酶识别位点。
[0021] 在一些实施方案中，AIMPLYB逻辑口是与第一启动子有效连接并且与第二启动 子有条件地有效连接的输出核酸的单基因电路构建体，其中第一启动子的侧翼有正向和反 向重组酶识别位点，而且第二启动子是反向的并且侧翼有不同的正向和反向重组酶识别位 点并且位于第一启动子与输出核酸之间。
[0022] 在一些实施方案中，BIMPLYA逻辑口是与第一启动子有条件地有效连接并且与 第二启动子有效连接的输出核酸的单基因电路构建体，其中第一启动子是反向的并且侧翼 有正向和反向重组酶识别位点，而且第二启动子的侧翼有不同的正向和反向重组酶识别位 点并且位于第一启动子与输出核酸之间。
[0023] 在一些实施方案中，ANIMPLYB逻辑口是与启动子有条件地有效连接的输出核酸 的单基因电路构建体，其中启动子的侧翼有正向和反向重组酶识别位点，而且输出核酸是 反向的并且侧翼有不同的正向和反向重组酶识别位点。
[0024] 在一些实施方案中，BNIMPLYA逻辑口是与启动子和单向终止子有条件地有效连 接的输出核酸的单基因电路构建体，其中启动子是反向的并且侧翼有正向和反向重组酶识 别位点，而且终止子是反向的并且侧翼有不同的正向和反向重组酶识别位点并且位于启动 子与输出核酸之间。
[00巧]在一些实施方案中，XOR逻辑口是与启动子有条件地有效连接的输出核酸的单基 因电路构建体，其中启动子是反向的并且侧翼有两个不同的正向和反向重组酶识别位点。
[0026] 在一些实施方案中，XNOR逻辑口是与启动子有效连接的输出核酸的单基因电路构 建体，其中输出核酸的侧翼有两个不同的正向和反向重组酶识别位点。
[0027] 在一些实施方案中，逻辑口可W包含含有至少两个启动子（例如，组成型启动子） 的单基因电路构建体，任选地，其中每个启动子具有不同的强度。在一些实施方案中，逻辑 口可W包含一对启动子，任选地，其中每个启动子具有不同的强度。运样的一对启动子（如 果具有不同的强度）在本文中可W指的是一对变体启动子。在一些实施方案中，启动子选 自proD、proA及proC。
[0028] 在另一些方面，本文提供了包含本发明的合成逻辑与存储系统的细胞。在一些实 施方案中，该细胞包含本发明的至少两个逻辑口。
[0029] 在又一些方面，本文提供了改变基因表达或细胞分化的方法，该方法包括改造细 胞W使其包含本发明的至少两个逻辑口和至少一种重组酶。
【附图说明】
[0030] 附图并不意在按比例绘制。在附图中，在多个图中所示的每个相同或近似相同的 部件用相似附图标记（numeral)表示。出于清楚的目的，没有将每幅附图中的每个部件都 进行标记。
[0031]图1示出了用于建立根据本发明的基于重组酶的集成逻辑与存储系统的平台的 原理图，该平台包含将所需的计算函数转换成[启动子]-[终止子]-[输出]设计的简单 编程语言，运可用简单易懂的Gibson组装构建。N-酷基高丝氨酸内醋（AHL)("输入A") 通过正交核糖调控系统（〇：rthogonalriboregulatedsystem)激活Bxbl重组酶的表达，而 无水四环素（anhy化Otetra巧cline，aTc)("输入B")通过正交核糖调控系统激活地iC31 重组酶的表达。运里所示出的实例口实现了AND功能性。该逻辑口的性能由在暴露于指定 组的输入之后采用流式细胞术所测定的绿色巧光蛋白（GF巧阳性的细胞百分比来表征。通 过=次独立的实验进行测量，并且误差条表示均值的标准误差。
[0032] 图2示出了本发明的逻辑口的原理图，运在不将多个通用口级联在一起的情况下 实现了完整的一组布尔逻辑口。细胞暴露于没有输入，仅AHU仅aTc，或者同时AHL和aTc。 每个逻辑口的性能由采用流式细胞术所测定的GFP阳性的细胞百分比来表征。通过=次独 立的实验进行测量，并且误差条表示均值的标准误差。
[0033] 图3示出了根据本发明的简单编程规则的原理图，其支配基于重组酶的基因电路 的行为，使逻辑口的多种示例具有各个遗传元件的不同组合。除了图1和图2的设计之外， 描述了（a)NOR、化)AND和（C)XOR逻辑口的独特实现方式。通过S次独立的实验进行测量， 并且误差条表示均值的标准误差。
[0034] 图4A示出了证明经过多个细胞世代存储保持的数据的图。包含AND口的细胞在 第0天之后被诱导至ON状态（GFP表达呈阳性/GFP阳性）并且此后9天在没有输入信号 的情况下被不断稀释和培养。维持GFP表达的细胞百分比采用流式细胞术进行测定。通过 =次独立的实验进行测量，并且误差条表示均值的标准误差。
[0035] 图4B示出了聚合酶链式反应（PCR)产物的电泳凝胶图像（右）并且附上了逻辑 口原理图（左）。在细胞死亡之后由PCR(由小箭头指示引物）检测NOR口的状态。通过在 1 %琼脂糖凝胶上进行电泳来分析PCR产物。
[0036] 图5示出了流式细胞术数据的图表。流式细胞术用于测定基于重组酶的逻辑与存 储系统的输出。巧光阔值统一应用于所有系统W确定被视为GFP阳性（ON状态）或GFP阴 性（OFF状态）的细胞百分比。示出了在没有任何输入、仅AHL输入，仅aTc输入W及同时 施加AHL和aTc的情况下针对AND口的代表性流式细胞术数据。
[0037] 图6示出了本发明的AND逻辑口的质粒图谱。
[003引图7示出了本发明的NOR逻辑口的质粒图谱。
[0039] 图8示出了本发明的AND逻辑口的质粒图谱。
[0040] 图9示出了本发明的OR逻辑口的质粒图谱。
[0041] 图10示出了本发明的NAND逻辑口的质粒图谱。
[004引图11示出了本发明的FALSH逻辑口的质粒图谱。
[0043] 图12示出了本发明的TRUE逻辑口的质粒图谱。
[0044] 图13示出了本发明的A逻辑口的质粒图谱。
[0045] 图14示出了本发明的B逻辑口的质粒图谱。
[0046] 图15示出了本发明的NOTA逻辑口的质粒图谱。
[0047] 图16示出了本发明的NOTB逻辑口的质粒图谱。
[004引图17示出了本发明的AIMPLYB逻辑口的质粒图谱。
[0049] 图18示出了本发明的BIMPLYA逻辑口的质粒图谱。
[0050] 图19示出了本发明的ANIMPLYB逻辑口的质粒图谱。
[005。图20示出了本发明的BNIMPLYA逻辑口的质粒图谱。
[0052] 图21示出了本发明的XOR逻辑口的质粒图谱。
[0053] 图22示出了本发明的XNOR逻辑口的质粒图谱。
[0054] 图23示出了本发明的NORV.2 (版本2)逻辑口的质粒图谱。
[0055] 图24示出了本发明的ANDV.2逻辑口的质粒图谱。
[0056] 图25示出了本发明的XORV.2逻辑口的质粒图谱。
[0057] 图26A示出了包含反向的启动子C(proC)和启动子A(proA)的用于实现数字模拟 转换器之逻辑口的原理图（左）并且附上了GFP表达输出的图（右）。细胞暴露于没有输 入，仅AHU仅曰1'(3,或者同时AHL和aTc。每个条的右侧W巧光的任意单位（a.U.)给出了非 归一化均值表达水平，并且在输出（OUT)之下列出了归一化表达水平，其中它们被四舍五 入到最接近的整数而且IX相当于约2700a.U.。
[0058] 图26B示出了包含反向的启动子D(ProD)和启动子A(ProA)的用于实现数字模拟 转换器之逻辑口的原理图（左）并且附上了GFP表达输出的图（右）。细胞暴露于没有输 入，仅AHU仅曰1'(3,或者同时AHL和aTc。每个条的右侧W巧光的任意单位（a.U.)给出了非 归一化均值表达水平，并且在输出之下列出了归一化表达水平，其中它们被四舍五入到最 接近的整数而且IX相当于约2700a.U.。图26C示出了包含反向的启动子D(ProD)和启动 子C(proC)的用于实现数字模拟转换器之逻辑口的原理图（左）并附上了GFP表达输出的 图（右）。细胞暴露于没有输入，仅4田^，仅曰1'(3,或者同时AHL和aTc。每个条的右侧W巧 光的任意单位（a.U.)给出了非归一化均值表达水平，并且在输出之下列出了归一化表达 水平，其中它们被四舍五入到最接近的整数而且1X相当于约2700a.U.。
[0059] 图27示出了数字模拟转换器之对照构建体的GFP巧光的图。包含具有反向的启 动子（proD)之奸P的大肠杆菌细胞和不包含奸P的大肠杆菌细胞表现出了与两种输入均 不存在（当AHL和aTc输入均为'0')的情况下在图26A至26C中的OX输出可比的模拟 输出基因表达水平。
[0060] 图28示出了通过正向散射和反向散射来测试变体启动子和重组酶识别位点对 奸P表达的影响由设口之后的流式细胞术表征的GFP巧光的图。巧光值的测量值基于来自 =次独立实验的几何平均值，并且误差条表示均值的标准误差。
[0061] 图29示出了本发明的逻辑口的质粒图谱。
[0062] 图30示出了本发明的逻辑口的质粒图谱。
[0063] 图31示出了本发明的逻辑口的质粒图谱。
[0064] 图32示出了用于表征相对于重组酶识别位点（RR巧的重组酶正交性 (orthogonality)的方案的一个实例。
[0065] 图33示出了用于测试重组酶的切除效率和正交性的方案的一个实例。
[0066]图34示出了针对生物学状态机的自动化设计算法的概述的一个实例。
[0067] 图35示出了启动下游合成分化网络的基因方案（geneticscheme)的一个实例。 [006引图36示出了通过输入化P)的不同组合和顺序产生四种不同的巧光蛋白肿）的 2至4多路复用电路（multiplexercircuit)的一个实例。
[0069] 图37示出了模拟造血干细胞化SC)分化路径的网络。
[0070] 图38A示出了本发明的"四色系统"的一个实例，其包含具有包含两个核酸输出 (蓝色巧光蛋白度F巧和黄色巧光蛋白（YFP))之逻辑口的基因构建体W及具有包含两个核 酸输出（红色巧光蛋白（RF巧和绿色巧光蛋白（GFP))之逻辑口的另一个基因构建体，由此 使两个细胞输入映射成四个细胞输出（一般可扩展成n个输入一 2"个输出）。
[0071] 图38B示出了包含在异丙基0-D-I-硫代半乳糖巧（IPTG)诱导型化(Iac-Ol)启 动子控制下的Bxbl重组酶和在阿拉伯糖诱导型地AD启动子控制下的地iC31重组酶的质 粒图谱。
[0072] 图38C示出了在暴露于仅阿拉伯糖之后W及在暴露于阿拉伯糖继而暴露于IPTG 之后在四色系统中遗传元件的方向，运导致BFP表达之后YFP表达。
[0073] 图38D示出了在暴露于仅IPTG之后W及在暴露于IPTG继而暴露于阿拉伯糖之后 在四色系统中遗传元件的方向，运导致RFP表达之后GFP表达。
[0074] 图38E分别示出了在暴露于仅IPTG、IPTG然后阿拉伯糖、仅阿拉伯糖或者阿拉伯 糖然后IPTG之后表达RFP、GFP、BFP或YFP的酵母细胞的显微图像；该细胞利用四色系统 的构建体转染。
[00巧]图39A示出了包含核糖调控的Bxbl重组酶和地iC31重组酶的质粒图谱。
[0076] 图39B示出了在暴露于仅aTc之后W及在暴露于aTc继而暴露于AHL之后在四色 系统中遗传元件的方向。
[0077] 图39C示出了在暴露于仅AHL之后W及在暴露于AHL继而暴露于aTc之后在四色 系统中遗传元件的方向。
[007引图40A示出了绘制出在暴露于50ng/mlaTC之后表达BFP的细胞百分比随时间的 图。
[0079] 图40B示出了绘制出在暴露于20化g/mlaTC之后表达BFP的细胞百分比随时间 的图。
[0080] 图40C示出了绘制出在暴露于250ng/mlaTC之后表达BFP的细胞百分比随时间 的图。
[0081] 图40D示出了绘制出在暴露于各种浓度的aTC之后表达BFP的细胞百分比随时间 的图。
[008引图41A示出了绘制出在暴露于aTC继而暴露于100yMAHL之后表达YFP的细胞 百分比随时间的图。
[0083] 图41B示出了绘制出在暴露于aTC继而暴露于50yMAHL之后表达YFP的细胞百 分比随时间的图。
[0084] 图41C示出了绘制出在暴露于aTC继而暴露于IOiiMAHL之后表达YFP的细胞百 分比随时间的图。
[00财图41D示出了绘制出在暴露于aTC继而暴露于1yMAHL之后表达YFP的细胞百 分比随时间的图。
[0086] 图41E示出了绘制出在暴露于aTC继而暴露于多种浓度的AHL之后表达YFP的细 胞百分比随时间的图。 具体实施方案
[0087] 本文提供了用于在单个细胞中组装合成逻辑的高效策略和编程语言，所述合成逻 辑伴有DNA编码的存储装置。本文所描述的模块化DNA组装策略使得能够简单易懂的"即 插即用"编码逻辑函数，伴随有源于重组酶能够将信息"写入"DNA的能力的存储。基于DNA 的存储是长期存储的有用的实现，因为运贯穿细胞世代自然增殖并且甚至在细胞死亡之后 可W是稳定的巧，10]。
[0088] 本发明的集成逻辑与存储系统由逻辑口构成，所述逻辑口是包含与输出核酸（例 如，编码蛋白产物的基因）W及任选地至少一个单向终止子有效连接或者有条件地有效连 接的各种方向的至少一个启动子的单基因电路构建体（图I)。该系统采用化学诱导物输入 来驱动从诱导型启动子的正交重组酶的表达。然后重组酶祀向在基因电路构建体中的启动 子、终止子和/或输出核酸序列侧翼的识别位点用于DNA反向或切除，导致输出核酸序列的 条件性表达。
[0089] 本发明的特征在于逻辑口在输入撤销之后维持稳定的输出存储。该特征可W用于 使用高通量测序技术创建具有W多路复用方式询问状态的生物传感器。此外，本文所提供 的编程语言，其支配基于重组酶之计算的行为，与自动化基因电路设计算法兼容巧2]。
[0090] 逻辑与存储系统W及逻辑口
[0091] 布尔逻辑函数基于可用于组装会实现可想到的任何数字部件的函数之组合的逻 辑口。本发明提供了具有基因（例如重组）事件的稳定的基于DNA之存储的任何布尔逻辑 函数的一步组装。本发明考虑了用于在活细胞中集成逻辑与存储的两个或更多个基于基因 之逻辑口的组装。在表1中列出了逻辑口的基础的"遗传元件"，并且每个逻辑口包含运些 遗传元件中的至少两个的组合。
[0092] 图2示出了一组逻辑口。图2中的每个图（panel)代表了合成逻辑与存储系统 (总共16个系统/图）并且每个系统包括（a)包含与编码Bxbl重组酶的核酸序列有效连 接的N-酷基高丝氨酸内醋（AHL)诱导型启动子的基因构建体（未描绘），化）包含与编码 地iC31重组酶的核酸序列有效连接的无水四环素（aTc)诱导型启动子的基因构建体（未 描绘），W及（C)(所描绘的）十六个逻辑口中的一个。图2中的每个图包括十六个逻辑口 中的一个：NOT、AND、OR、NOT、NOR、NAND、X0R、XN0R、A IMPLY B、B IMPLY A、A NIMPLY B、B NIMPLY A、A、B、FAL沈或TRUE。
[0093] 表I:合成逻辑与存储系统的遗传元件的非限制性实例
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098] 依据输入A和输入B描述了图2中的逻辑口。在本文所描述的示例性实施方案 中，输入A表示将AHL添加到逻辑与存储系统，其诱导Bxbl重组酶的表达，Bxbl重组酶继 而催化互补的BxblattB(正向）和BxblattP(反向）重组识别位点的重组（如图2中S 角形所图示的）。在本文所描述的示例性实施方案中，输入B表示将aTc添加到系统，其诱 导地iC31重组酶的表达，地iC31重组酶继而催化互补的地iC31attB(正向）和地iC31 attP(反向）重组识别位点的重组（如图2中括号所图示的）。应当理解的是，AHL和aTc 是本文所描述的逻辑口的输入的实例。本发明考虑了使用其他输入，其他输入可W由终端 用户选择并且可与AHL和aTc互换使用或者代替AHL和aTc。
[0099] 应当理解的是，重组酶Bxbl和地iC31 (及其同源识别位点）是根据本发明可W使 用的重组酶（及识别位点）的实例。本发明考虑了使用其他重组酶/识别位点，其他重组 酶/识别位点可W由终端用户选择并且可与Bxbl和/或地iC