31互换使用或者代替Bxbl 和/或地iC31W催化DNA的反向或切除。下面描述了其他重组酶/识别位点的实例。此 夕F，虽然图2中所描绘的输出核酸序列奸P编码蛋白产物绿色巧光蛋白（GFP)，但应当理解 的是，g巧可W由任何输出核酸序列代替。
[0100]下面描述了本发明的十六个逻辑口（AND、0R、N0TA、N0TB、N0R、NAND、X0R、XN0R、A IMPLYB、BIMPLYA、ANIMPLYB、BNIMPLYA、A、B、FAL沈和TRUE),运提供了所有二输入 布尔逻辑函数。包含"二输入"布尔逻辑函数的逻辑口包含AND、OR、NOR、NAND、XOR、XNOR、 AIMPLYB、BIMPLYA、ANIMPLYB及BNIMPLYA。因此，如果逻辑口或多个逻辑口包含 AND、0R、N0R、NAND、X0R、XN0R、AIMPLYB、BIMPLYA、ANIMPLYB及BNIMPLYA逻辑口， 则逻辑口或多个逻辑口被认为提供所有二输入布尔逻辑函数。然而，本发明的独立逻辑口 不限于图2中所描绘的基因电路构建体。任何数量的表1中的遗传元件可W在逻辑口的给 定的基因电路构建体中W多种位置和方向被布置W获得期望的输出。例如，图3中描绘了 逻辑口NOR、AND及XOR的替选基因电路构建体。
[0101] 在本文中，当启动子相对于其调节的核酸序列处在正确的功能位置及方向W控制 ("驱动"）该序列的转录起始和/或表达时，启动子被认为是"有效连接的"。当在基因重 组事件后启动子相对于其调节的核酸序列被放置在正确的功能位置及方向时，启动子被认 为是"有条件地有效连接的"。
[0102] "反向的"遗传元件（例如，反向的启动子、反向的终止子、反向的输出核酸序列） 是反方向的遗传元件，W使得曾经的编码（有义）链现在是非编码（反义）链。处于其反 向的（反方向）遗传元件是非功能性的（例如，未与另一遗传元件如输出核酸序列有效连 接）。当侧翼的互补识别位点重组W及随后遗传元件变回其正确方向后，遗传元件的功能可 恢复。因此，如果启动子在侧翼的互补识别位点重组后被定向成使得曾经的非编码链现在 是编码链，并且启动子能够控制输出核酸序列的转录起始和/或表达，则侧翼有重组识别 位点的反向启动子可W被认为是与下游输出核酸序列"有条件地有效连接"。同样地，如果 输出核酸序列在侧翼的识别位点的重组后被定向成使得曾经的非编码链现在是编码链，并 且上游启动子能够控制输出核酸的转录起始和/或表达，则侧翼有重组识别位点的反向输 出核酸序列可与上游启动子"有条件地有效连接"。在图2的NOR、NAND、TRUE、NOTA、NOTB 及XNOR逻辑口中示出了与输出核酸序列有效连接的启动子的示例性实例。在图2的AND、 OR、A、B、ANIMPLYB、BNIMPLYA及XOR逻辑口中示出了与输出核酸序列有条件地有效连 接的启动子的示例性实例。逻辑口AIMPLYB和BIMPLYA包含与输出核酸序列有效连接 的启动子和与输出核酸序列有条件地有效连接的启动子两者。
[0103] 在本文中，如果输出核酸序列位于近编码（有义）链的3'端而遗传元件位于近编 码（有义）链的5'端，则输出核酸序列被认为是遗传元件的下游。一个遗传元件被认为是 另一个遗传元件的"紧接下游"，则两个遗传元件彼此接近（例如，没有其他遗传元件（如表 1中所列出的那些遗传元件）位于运两个遗传元件之间）。
[0104]NOT口
[0105] 最简单的布尔逻辑口是指NOT口。该NOT口接受一个输入并且产生与其相反的输 出。本文所公开的是示例性的NOTA逻辑口和NOTB逻辑n，其中A(AHL)和B(aTc)是输 入（图2)。图2中的NOTA口包含与输出核酸序列奸P有效连接的侧翼有互补的重组酶识 别位点BxblattB和BxblattP的组成型启动子（本文中简称为启动子）。当AHL添加到 系统时，表达Bxbl重组酶，并且BxblattB和BxblattP重组，导致奸P反向，使得奸P的 转录不再受启动子控制。相反地，当aTc而非AHL添加到系统时，不表达Bxbl重组酶，Bxbl at巧和Bxblat巧不重组，并且启动子控制奸P转录。因此，仅在不存在AHL时表达GFP。
[0106] 图2中的NOTB口包含侧翼有互补的重组酶识别位点地iC31attB和地iC31attP 并且与奸P有效连接的启动子。当aTc添加到系统时，表达地iC31重组酶，并且地iC31 attB和地iC31attP重组，导致启动子反向，使得启动子不再控制奸P的转录。相反地，当 AHL而非aTc添加到系统时，不表达地iC31重组酶，地iC31at巧和地iC31at巧不重组， 并且启动子控制奸P转录。因此，仅在不存在aTc时表达GFP。
[0107]AND口
[010引AND口是另一种简单的布尔逻辑口。AND口对两个输入A和B进行逻辑"与"运 算。图2中的AND口包含与侧翼有BxblattB和BxblattP的反向奸P有条件地有效连接 的侧翼有地iC31attB和地iC31attP的反向启动子。当仅AHL添加到系统时，表达Bxbl 重组酶，并且BxblattB和BxblattP重组W定向奸P沿着编码链的5'至3'方向；然而， 在没有aTc激活地iC31attB和地iC31attP的重组的情况下，启动子保持反向并且不能 控制奸P转录。类似地，当仅aTc添加到系统时，表达地iC31重组酶，并且地iC31at巧和 地iC31attP重组W定向启动子沿着编码链的5'至3'方向；然而，在没有AHL激活Bxbl attB和BxblattP的重组的情况下，g巧保持反向。因此，仅在AHL和aTc两者都存在的情 况下表达GFP。
[0109] OR口
[0110]OR口对输入A或输入B进行逻辑"或"运算。图2中的OR口包含侧翼有地iC31 attB和曲iC31attP之反向启动子上游的侧翼有BxblattB和化blat巧之反向启动子，各 反向启动子与奸P有条件地有效连接。当AHL添加到系统时，表达Bxbl重组酶，并且Bxbl at巧和Bxblat巧重组W定向启动子沿着编码链的5'至3'方向来控制奸P转录。类似 地，当aTc添加到系统时，表达地iC31重组酶，并且地iC31at巧和地iC31at巧重组W定 向另一启动子沿着编码链的5'至3'方向来控制奸P转录。因此，在AHUaTc或两者都存 在的情况下表达GFP。
[0111]NORn
[011引NOR口是OR口与NOT口的组合。图2中的NOR口包含与奸P有效连接的启动子W及位于其间的两个反向终止子，每个终止子的侧翼有不同的互补重组酶识别位点。当AHL 添加到系统时，表达Bxbl重组酶，并且Bxblat巧和Bxblat巧重组W定向终止子沿着编 码链的5'至3'方向，从而终止奸P转录。类似地，当aTc添加到系统时，表达地iC31重 组酶，并且地iC31at巧和地iC31at巧重组W定向另一终止子沿着编码链的5'至3'方 向，从而再次终止奸P转录。因此，仅在AHL和aTc两者都不存在的情况下表达GFP。
[0113] MND口
[0114] NAND口是AND口与NOT口的组合。图2中的NAND口包含与奸P有效连接的两 个启动子，每个启动子侧翼有不同的互补重组酶识别位点。当仅AHL添加到系统时，表达 Bxbl重组酶，并且BxblattB和BxblattP重组W使上游启动子反向；然而，在没有aTc激 活地iC31attB和地iC31attP的重组的情况下，下游启动子仍然与奸P有效连接并且控 制奸P转录。类似地，当仅aTc添加到系统时，表达地iC31重组酶，并且地iC31at巧和 地iC31attP重组W使下游启动子反向；然而，在没有AHL激活BxblattB和BxblattP的 重组的情况下，上游启动子仍然与奸P有效连接并且控制奸P转录。当AHL和aTc两者都 添加至系统时，两个启动子都反向并且都不控制奸P转录。因此，只要AHL和aTc不同时存 在于系统中，就表达GFP。
[0115] XOR口
[0116] XOR口是"异或"口。图2中的XOR口包含与奸P有条件地有效连接并且侧翼有 Bxblat1:B和Bxblat1:PW及地iC31at1:B和地iC31at1:P的反向启动子。当仅AHL添加 到系统时，表达Bxbl重组酶，并且BxblattB和BxblattP重组W定向启动子沿着编码链 的5'至3'方向来控制奸P转录。类似地，当仅aTc添加到系统时，表达地iC31重组酶， 并且地iC31attB和地iC31attP重组W定向启动子着编码链的5'至3'方向来控制奸P 转录。相对地，当AHL和aTc两者都添加到系统时，发生下述两个重组事件：首先定向启动 子沿着编码链的5'至3'方向，然后使启动子反向回到沿非编码链的无效位置（不能控制 奸P转录）。因此，仅在AHL或aTc存在于系统中时表达GFP，但在AHL和aTc两者都存在时 不表达GFP。
[0117] XNOR口
[0118] XNOR口是"异或非"口。图2中的XNOR口包含与奸P有效连接并且侧翼有Bxbl attB和BxblattPW及地iC31attB和地iC31attP的启动子。当仅AHL添加到系统时， 表达Bxbl重组酶，并且BxblattB和BxblattP重组W使奸P反向沿着非编码链，运种情 况下奸P不受启动子的控制。类似地，当仅aTc添加到系统时，表达地iC31重组酶，并且 地iC31attB和地iC31attP重组W使奸P反向沿着非编码链。相对地，当AHL和aTc两者 都添加到系统时，下述两个重组事件发生：首先使奸P反向沿着非编码链，然后定向奸P回 到沿编码链的有效的位置，现在奸P受启动子控制。因此，在AHL和aTc两者都存在于系统 中时或者在AHL和aTc两者都不存在于系统中时表达GFP。
[0119]IMPLY口
[0120] 本发明还提供了AIMPLYB口（AANDNOTB)和BIMPLYA度ANDNOTA)。图 2 中的AIMPLYB口包含侧翼有BxblattB和BxblattP(与奸P有效连接）的启动子W及 位于所述启动子与奸P之间的侧翼有地iC31attB及地iC31attP(与奸P有条件地有效 连接）的反向启动子。当AHL添加到系统时，上游启动子是反向的并且奸P不转录。当aTc 添加到系统时，下游启动子被定向成沿着编码链的5'至3'方向来控制奸P转录。因此， 在aTc存在，AHL和aTc两者都存在或者AHL和aTc两者都不存在的情况下表达GFP;然而， 在仅AHL存在的情况下不表达GFP。
[0121] 相对地，图2中的BIMPLYA口包含位于侧翼有地iC31attB及地iC31attP(与 奸P有效连接）之启动子上游的侧翼有BxblattB和BxblattP(与奸P有条件地有效连 接）的反向启动子。当AHL添加到系统时，上游启动子被定向成沿着编码链的5'至3'方 向来控制奸P转录。当aTc添加到系统时，下游启动子是反向的并且奸P不转录。因此，在 AHL存在，AHL和aTc两者都存在或者AHL和aTc两者都不存在的情况下表达GFP;然而，在 仅aTc存在的情况下不表达GFP。
[012引NIMPLY口
[0123] 本发明还提供了ANIMPLYB口和BNIMPLYA口。图2中的ANIMPLYB口包含侧 翼有地iC31at1:B及地iC31at1:P并且与侧翼有Bxblat1:B和Bxblat1:P的反向奸P有条 件地有效连接的启动子。当aTc添加到系统时，上游启动子是反向的并且奸P不转录。当 AHL添加到系统时，g巧被定向成沿着编码链的5'至3'方向并且被转录。因此，在仅AHL 存在的情况下表达GFP。
[0124] 相反地，BNIMPLYA口包含侧翼有地iC31attB和地iC31attP并且与奸P有条 件地有效连接的反向启动子W及位于反向启动子与奸P之间的侧翼有BxblattB和Bxbl attP的反向终止子。当aTc添加到系统时，上游启动子被定向成沿着编码链的5'至3'方 向并且奸P被转录。当AHL添加到系统时，终止子被定向成沿着编码链的5'至3'方向并 且奸P不被转录。因此，在仅aTc存在的情况下表达GFP。
[012引A口和B口
[0126] 本发明还提供了A口和B口。图2中的A口包含与侧翼有BxblattB和BxblattP 的反向奸P有条件地有效连接的启动子。在AHL存在于系统中时表达GFP。图2中的B口 包含侧翼有地iC31attB及地iC31attP且有与奸P条件地有效连接的反向启动子。在 aTc添加至系统时表达GFP。
[0127]TRUE口和FALSE口
[0128] 本发明还提供了TRUE口和FALSE口。图2中的TRUE口包含与奸P有效连接的启 动子。GFP独立于系统的输入而被表达。本发明的FALSE口包含紧接反向启动子下游（例 如，与反向启动子相邻）的奸P。GFP从不被表达，并且运也独立于系统的输入。
[0129] 重组酶及重组识别序列
[0130] 本文提供了用于向本发明的逻辑与存储系统赋予稳定的基于DNA之存储的重组 酶。本文所使用的"重组酶"是识别短DNA序列的位点特异性酶，所述短DNA序列通常为约 30碱基对化P)至40bp，并且其介导运些重组酶识别序列之间的重组，运导致重组酶识别序 列之间的DNA片段的切除、整合、反向或交换。本文所使用的"遗传元件"指定是在基因表 达中发挥作用的DM序列。例如，启动子、转录终止子化及编码产物（例如蛋白产物）的核 酸均被认为是遗传元件。
[0131] 重组酶可W基于不同的生化特性被分类成两个不同的家族：丝氨酸重组酶（例 如，解离酶和转化酶）和酪氨酸重组酶（例如，整合酶）。丝氨酸重组酶和酪氨酸重组酶还被 划分成双方向重组酶和单方向重组酶。双方向丝氨酸重组酶的实例包括但不限于P-six、 Ci址、ParA及丫 6,而单方向丝氨酸重组酶的实例包括但不限于BxbUd)C31、TP901、TGl、 巧投Tl、R4、9RV.l、（pFCl、MRll、A118、U153及甜29。双方向酪氨酸重组酶的实例包 括但不限于化e、化P及R，而单方向酪氨酸重组酶的实例包括但不限于A、HK101、HK022及PSAM2。丝氨酸重组酶和酪氨酸重组酶命名源自重组酶用来攻击DNA并且在链交换期间变 成与DNA共价链接的保守的亲核氨基酸残基。重组酶已经用于多种标准生物学应用，包括 创建基因敲除和解决分选问题巧5-38]。
[0132] 重组的结果部分取决于待被重组的通常小于30bp长的两个短重复DNA序列的位 置和方向。重组酶与运些重复序列结合，运些重复的序列对每个重组酶是特异的，并且在本 文中被称为"重组酶识别序列"或"重组酶识别位点"。因此，如本文所使用的，当重组酶可 介导重复DNA序列之间的反向或切除时，重组酶对于重组酶识别位点是"特异的"。如本文 所使用的，还可W认为重组酶识别其"同源重组酶识别位点"，所述同源重组酶识别位点在 间插的遗传元件（例如，启动子、终止子或输出核酸序列）的侧翼。当该元件位于两个重复 的DNA序列之间并且紧邻运两个重复的DNA序列时，遗传元件被认为是"侧翼"有重组酶识 别位点。在一些实施方案中，重组酶识别位点不彼此重叠。然而，在另一些实施方案中，重 组酶识别位点彼此重叠，如下文所描述的（参见，例如，实施例5中所描述的电路），运使得 极大地提高了组合复杂性。
[0133] 反向重组发生在两个短的反向的重复的DNA序列之间。由DNA弯曲蛋白值NA bendingprotein)辅助的DNA环形成将两个重复的序列带到一起，此时发生DNA切割和连 接。运种反应不依赖ATP并且需要超螺旋DNA。运样的反向重组事件的最终结果是重复位 点之间的DNA段（stretch)反向（即DNA段反转方向）使得曾经的编码链现在是非编码链 而曾经的非编码链现在是编码链。在运样的反应中，在没有DNA的净增益或损失的情况下 DNA守恒。
[0134] 相反，整合（切除）重组发生在W相同方向定向的两个短的重复的DNA序列之间。 运种情况下，切离/移除间插的DNA。例如，AND口可如下组装，通过将终止子放置在定向成 用于切除的两个不同的重组酶位点组中的每组之间并且侧翼有启动子和输出如GFP编码 序列。在运个实例中，必须由重组酶的输入依赖的作用来切除两个终止子，W允许从启动子 到GFP编码序列的连读。因此，需要两个输入来切除运两个终止子W产生输出。
[0135] 重组酶还可W被分类为不可逆或可逆的。如本文所使用的，"不可逆重组酶"指的 是可催化两个互补的重组位点之间的重组，但是在没有附加因素辅助的情况下不能催化由 该重组形成的杂交位点之间的重组的重组酶。因此，"不可逆识别位点"指的是可充当不可 逆重组酶的两个DNA识别序列中的第一个并且在该位点重组之后被修饰成杂交识别位点 的重组酶识别位点。"互补性不可逆识别位点"指的是可充当不可逆重组酶的两个DNA识 别序列中的第二个并且在该位点同源重组之后被修饰成杂交重组位点的重组酶识别位点。 例如，下面所描述的at巧和at巧是Bxbl和地iC31重组酶的不可逆重组位点，其中attB 是attP的互补性不可逆重组位点，反之亦然。近年来，已经表明，attB/attP位点可被突变W创建仅彼此相互作用而不与其他突变体相互作用的正交B/P对（odhogonalB/Ppair) [72]。运使得单个重组酶可控制多个正交B/P对的切除、整合或反向。
[0136] 地iC31 (巧€31)整合酶例如在不存在真核细胞中未发现的附加因素的情况下仅 催化attBXattP反应。重组酶不能介导attB与attP之间重组后形成的杂交重组位点attL与attR之间的重组。因为重组酶（如地iC31整合酶）不能单独催化逆反应，phiC31 attBXattP重组是稳定的。
[0137] 在本领域中描述了不可逆重组酶及编码不可逆重组酶的核酸，并且可使用惯用 方法获得不可逆重组酶及编码不可逆重组酶的核酸。不可逆重组酶的实例包括但不限于 地iC31 (蛛€31)'重组酶（SEQIDNO:11)、大肠杆菌隧菌体P4重组酶巧9]、大肠杆菌隧菌体 入整合酶[40]、利斯特菌属A118隧菌体重组酶[41]、放线菌隧菌体R4Sre重组酶[42]、 HK101、HK022、pSAM2、Bxbl、TP901、TGl、q)BTl.、（pRVl、（pFCKMR1UU153 及甜29。
[013引相反，"可逆重组酶"是指运样的酶，其可催化两个互补的重组酶识别位点之间的 重组并且在没有附加因素辅助的情况下能够催化由最初重组事件形成的位点之间的重组 从而逆转最初重组事件。由重组产生的产物位点本身是后续重组的底物。可逆重组酶系统 的实例包括但不限于Cre-Iox和Flp-frt系统、R、06、CinH、ParAW及丫5。
[0139] 本文所提供的重组酶不意味着可在本发明的实施方案中使用的重组酶的实例是 排他性的。本发明的逻辑与存储系统的复杂性可通过挖掘新的正交重组酶的数据库或者设 计具有确定DNA特异性的合成重组酶而扩展巧0, 21]。在本文所描述的合成逻辑与存储系 统中可用的重组酶的其他实例是本领域技术人员所公知的，并且预期发现或产生的任何新 的重组酶能够在本发明的不同实施方案中使用。
[0140] 在一些实施方案中，重组酶是丝氨酸重组酶。因此，在一些实施方案中，重组酶被 认为是不可逆的。在一些实施方案中，重组酶是酪氨酸重组酶。因此，在一些实施方案中， 重组酶被认为是可逆的。
[014。在一些实施方案中，重组酶包含如在沈QIDNO:8(表2)所列出的Bxbl重组酶 的序列W及如在SEQIDNO:9和SEQIDNO: 10中分别所列出的相应的BxblattB和Bxbl attP重组酶识别序列。
[0142] 在一些实施方案中，重组酶包含如在SEQIDNO:11 (表2)所列出的 地iC31 ((pOl)重组酶的序列W及如在沈QIDN0:12和沈QIDN0:13中分别所列出的 相应的地iC31attB和地iC31attP重组酶识别序列。
[0143] 启动子
[0144] 本文提供了在本发明的基于重组酶的合成逻辑与存储系统中使用的启动子序列 ("启动子"）。如本文中所使用的，"启动子"指的是核酸序列的控制区域，在此起始并控制 核酸序列的剩余部分的转录速率。启动子还可W包含亚区，在亚区中，可W结合调节蛋白和 分子，如RNA聚合酶及其他转录因子。启动子可W是组成型的、诱导型的、可激活的、可阻遏 的、组织特异性的或其任何组合。
[0145]启动子驱动其调节的核酸序列的表达或转录。如本文中所使用的，"有效连接"和 "在控制下"表明启动子相对于其调节的核酸序列处在正确的功能性位置和/或方向W控制 该序列的转录起始和/或表达。如上所述的"反向启动子"是其中核酸序列处在反向方向 使得曾经的编码链现在变成非编码链而曾经的非编码链现在是编码链的启动子。在本发明 的多种实施方案中可W使用反向启动子来调节逻辑口的状态（例如，高输出"0N"，或低/无 输出"OFF")。因此，在一些实施方案中，启动子是侧翼有互补的重组酶识别位点的反向启 动子，该反向启动子在位点重组后，反向到正确的方向并驱动有效连接的核酸序列的表达。 在本发明的一些实施方案中，启动子可W或可W不联合"增强子"一起使用，增强子指的是 参与启动子下游核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。增强子可W位于在启动子和/ 或编码核酸之前或之后的任何功能性位置处。
[0146] 根据其对于RNA聚合酶（和/或O因子）的亲和力，启动子被分类为强或弱，运 牵设到启动子序列与聚合酶的理想共有序列类似的密切程度。启动子的强度可W取决于转 录起始在该启动子W高频率还是低频率发生。具有不同强度的不同启动子可W用于构造具 有基因输出表达的不同的数字可设置水平的逻辑口（例如，从弱启动子起始的基因表达的 水平低于从强启动子起始的基因表达的水平）。例如，图26A至26C中所示出的数据证明输 入诱导物的多种数字组合导致多种水平的模拟基因表达输出，所述输出取决于所使用的启 动子的不同强度W及它们各自输出的总和。
[0147] 启动子可W是与基因或序列自然相关的启动子，如可W通过分离位于给定基因或 序列之编码区段和/或外显子之上游的5'非编码序列获得。运样的启动子可W被称为"内 源性的"。类似地，增强子可W与核酸序列自然相关、位于该序列的上游或下游。
[014引在一些实施方案中，可W将编码核酸区段定位成在重组启动子或异源启动子的控 制下，所述重组启动子或异源启动子指的是在其自然环境中通常不与编码核酸序列自然相 关的启动子。重组增强子或异源增强子指的是在其自然环境中通常不与核酸序列相关的 增强子。运样的启动子或增强子可W包括其他基因的启动子或增强子，从任何其他的原核 细胞、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子，W及非"自然存在"的合成启动子或增强子， 例如，包含通过本领域已知的基因工程方法改变表达之突变和/或不同转录调节区域的不 同元件的那些。除了W合成方法产生启动子和增强子的核酸序列，还可W使用重组克隆和 /或核酸扩增技术（包括PCR)来生成与本文所公开的逻辑口连接的序列（参见美国专利 No. 4, 683, 202和美国专利No. 5, 928, 906)。此外，根据本发明可W使用指导无核细胞器（如 线粒体、叶绿体等）内的序列之转录和/或表达的控制序列。
[0149] 诱导型启动子