，由于较大的状态图常常可被分解成较小状态图的组合，较小状态图的结果可 W被存储在存储器中并且该结果用于后续计算中，W使不必要的重算最小化。
[0230] 可W对核屯、算法做出改进，W增强算法的灵活性、能力及效率。可W添加其他重组 酶反应（例如整合或双向反向）或者定义更多调节元件类型。工具可W被改良成使计算效 率最大化同时限制生物学负载的秩排序设计。因为每个状态图通常具有许多潜在的电路实 现方式，可W基于预期性能给各种实现方式评分。例如，由于DNA刚性对DNA成环的影响需 要重组酶活性，相比于较长的序列，非常短的DNA序列较低效率地被反向[54]。另外，不同 的重组酶很可能会显示不同的效率，其可W利用来自例如实施例2的数据并入评分标准。
[0231] 实施例4.合成"干细胞"和活细胞中的分化网络
[0232] 多能干细胞状态是高等生物体的生物学的中屯、，但是不存在于单细胞酿酒酵母 (S.cerevisiae)中。为了构建干细胞与分化网络的模型，使用Gibson和GoldenGateDNA 组装策略来设计具有干细胞行为的酿酒酵母中的合成电路并且在基因组上集成运些电路 或者将运些电路放置在酵母人工染色体（YAC)中（图35)。运些电路通过利用子代特异性 启动子[55, 56](如PSCW11)能够使干细胞特征性的不对称细胞分裂。在子代特异性启动 子的控制下重组酶被表达，W使得重组酶可W在子代细胞中仅不对称地被表达。运些重组 酶引起从酵母菌干细胞状态到下游状态的转变（参见下文）。子代特异性电路被设计成可 诱导用于外部开始并控制"干细胞"实验。运通过将子代特异性启动子的输出设计成控制 下游重组酶表达的诱导型合成转录因子（STF)(例如基于TetR或基于LacI的ST巧，修饰子 代特异性启动子W包含对于诱导型阻遏物的结合位点（例如，TetR或LacI)和/或使用诱 导型重组酶（例如，雌激素诱导型化e)而实现。
[0233] 用巧光蛋白作为输出并且使用显微术监测细胞巧光谱来表征运些子代特异 性电路的动态范围和时间过程。使用图像处理软件[57]，确认子代细胞的巧光范围 (confinement)并且测量其依赖于外部诱导物的浓度和时间。
[0234] 设计合成分化网络。在添加外部诱导物后，上述的不对称电路仅在酵母干细胞的 子代中触发分化级联。合成网络被改造W引导运些"祖"细胞向下至特定分化途径。将下述 两种概念验证分化网络用作模型系统：（1) 2至4多路复用电路，其中两个外部输入的时序 和标识产生四个不同的巧光蛋白输出（图36)W及（2)模拟HSC分化途径的网络（图37)。
[0235] 运些网络的输入是控制重组酶表达的外部诱导物。通过表达中间重组酶水平来获 得随机切换或者通过表达高重组酶水平诱导切换完成。为了微调重组酶表达，在酿酒酵母 中实现宽动态范围（wide-dynamic-range，WDR)正反馈（positivefeeclback，PF')分路模式 (shuntmotif) [5引。具有TetO结合位点的启动子被设计成表达基于TetON的系统（其中 aTc诱导TetR-VPie与启动子结合）。该PF-环被集成或放置到YAC上，W使得其W低拷贝 数存在。对于分路，改造在高拷贝2微米质粒（2-micronplasmid)上表达巧光蛋白的具有 TetO结合位点的启动子。类似的策略用于基于异丙基0-D-I-硫代半乳糖巧（IPTG)控制 LacI调控的基因。使用流式细胞仪来验证WDR电路行为，然后用重组酶替换巧光基因。
[0236] 运些分化网络的输出包括不同的报道基因，如巧光基因、比色基因、巧光素酶基 因W及药物抗性基因。报道分子使得方便对每个状态中的细胞种群的比例进行测量。在 其中使用流式细胞仪对例如具有多于=个同时存在的巧光报道分子的单个电路进行多路 复用成像可能具有挑战性的情况下，使用上面提到的其他报道分子，或者用放置在不同输 出基因位置中的两个或=个报道分子建立相同电路的多种版本。输出还可W是调控内源 途径或合成途径的sTF[59-62]。STF可W由锋指（zincfinger,ZF)、转录激活样效应子 (transcriptionactivator-Ukeeffector,TALE)W及成簇的规律性间隔的短回文重复 (clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR)牵专录因子框架 建造并且允许在每个状态中可调节地调控期望的途径。例如，合成转录因子（sT巧可W用 于有差别地调控每个状态中的内源途径（例如，假菌丝生长、交配型、絮凝作用）。
[0237] 可W使用上述来自算法的重组酶电路的多种不同的实现方式，由此能够在性能不 足的例子中提供多种有效的替选方案。还可W使用手动设计的电路。一些设计可W编码由 用于反向或切除的同一重组酶识别的多个RRS对。为了降低不想要的RRS之间的串扰，可 W设计除了分享相同序列还具有其突变的中央二核巧酸残基的RRS。还示出了包含相同中 央二核巧酸的RRS对优选地相互反应[64-66]。此外，作为经由PF分路WDR对数电路表达 重组酶的替选方案，可W使用经线性化的转录电路[67]。运些负反馈电路使得能够用外部 诱导物线性控制输出基因。还已经开发在LCP上不需要正反馈（P巧组件并且在分开的HCP 上不需要分路组件的大肠杆菌中的WDR对数电路值aniel，Rubens等在制备中的）；然而， 运些组件两者可W在同一载体上。运通过PF和分路的诱变而实现。
[023引表征合成的分化网络。通过诱导具有不同时序的不同重组酶的表达来测试分化网 络（图37)。探索重组酶表达的排列并且用流式细胞术、显微术、PCR及DNA测序来监测状 态及转变。根据电路拓扑W及输入的时间动态确定状态转变的效率如何W及每个状态的稳 定性如何。用WDR电路表达低水平的重组酶、中间水平的重组酶及高水平的重组酶W确定 不同的水平如何影响状态转变的保真性和随机性。中间水平的重组酶表达可导致混合的 群。作为延伸，探索经由表达重组酶加上重组酶定向因子（畑巧恢复反向的方向如何影响 状态机的行为[63]。该工作提供复杂的合成分化网络的第一个示范，同时有可W用于调节 行为的多个旋钮。
[0239] 实例5.状态机电路
[0240] 本文提供了可W用于构建生物学电路的逻辑与存储系统，从而能够用简单的状态 机表示对复杂系统建模（例如根据计算机科学）。例如，本发明的逻辑与存储系统可W用 于根据输入（例如基于化学的输入或基于重组酶的输入）的标识及顺序使细胞在独特的状 态之间转变。关于此的一个非限制性实例是n个输入至化个输出的电路，运使得能够基于 所使用的n个输入的组合选择化个输出中的一个（图38A至38E、图39A至39C)。一般而 言，状态机概念是可扩展的并能够使n个输入一 2"个输出。
[0241] 图38A中图示解了该实例中所使用的逻辑口。逻辑口 1包含两个输出核酸，其中 一个编码蓝色巧光蛋白度F巧而另一个编码黄色巧光蛋白（YFP)。同源地iC31重组酶识别 位点（RR巧用括号表示，而同源BxblRRS用S角形表示。逻辑口 2类似地包含两个输出核 酸，其中一个编码红色巧光蛋白（RF巧而另一个编码绿色巧光蛋白（GFP)。逻辑口 1和逻辑 口 2在本文中被称为"四色系统"。
[0242] 在一个实验中，用包含四色系统和两个重组酶的质粒转化细胞，其中两个重组酶 是分别在阿拉伯糖诱导型启动子和IPTG诱导型启动子的控制下的化iC31重组酶和Bxbl重组酶（图38B)。在没有诱导物的情况下使细胞在培养基中培养过夜然后暴露于仅IPTG、 IPTG然后阿拉伯糖、阿拉伯糖或者阿拉伯糖然后IPTG(图38)。图38示出了暴露于仅IPTG 的细胞中的RFP的巧光、暴露于IPTG然后阿拉伯糖的细胞中的GFP的巧光、暴露于仅阿拉 伯糖的细胞中的BFP的巧光W及暴露于阿拉伯糖然后IPTG的细胞中的YFP的巧光。
[0243] 在另一个实验中，用包含四色系统和两个重组酶的质粒转化细胞，其中两个重组 酶是在核糖核酸调节子控制下的化iC31重组酶和Bxbl重组酶（图39A)。在没有诱导物 (aTc和AHL)的情况下使细胞在培养基中培养过夜，第二天将细胞离屯、、洗涂并按1 : 2000 稀释。细胞分别暴露于50ng/ml、20化g/ml及25化g/ml浓度的一种输入诱导物aTc，持续 2、4、6、8、10、12及14小时。然后使用流式细胞术测量BFP的表达。还通过PCR确认输出核 酸表达（数据未示出）。图40A至40D示出了绘制在多种输入浓度下表达BFP的细胞百分 比随时间的图。
[0244] 然后将用aTC诱导过夜的细胞离屯、、洗涂并按1 : 2000稀释并且分别暴露于 1yM、10yM、50yM及IOOyM浓度的另一种诱导物AHL，持续2、4、6、8、10、12及14小时。 然后使用流式细胞术测量YFP的表达。还通过PCR确认输出核酸表达（数据未示出）。图 41A至41E示出了绘制在各种输入浓度下表达YFP的细胞百分比随时间的图。
[0245] 实验方法
[0246] 在按下述浓度使用适当抗生素的Luria-Bertani(LB)-Miller培养基 (Fisher#BP1426-2)中进行所有的实验：簇节青霉素（50yg/ml)，卡那霉素（30yg/ml)W 及氯霉素（25yg/nd)。
[0247] 基于重组酶的计算质粒构建体
[024引使用基础的分子克隆技术巧7]和Gibson组装巧引构建所有质粒。使用化W化glandBiol油(肥B)限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶W及P扫USION?PCR试剂盒。 利用具有双48/48快速反应模块的Bio-RadS1000?热循环仪度ioRad)进行聚合酶链式反 应（PCR)。由IntegratedDNATechnologies(Coralville，IA)构建包含重组酶识别位点 的定制序列。
[0249]所有质粒均使用标准方案转化到大肠杆菌菌株D册a巧RO(F-1巧80lacZA：M15AQacZYA-ar评）U169deoRrecAlendAlhsdR17(rk-，址+)地oASU祀44thi-1gyrA96 relAlA-，PN25/tetR，Placiq/lacI，Sp;r)并用QIAprep'"SpinMiniprepKits(Qiagen) 分离。通过限制性消化并且由Genewiz(Cambridge,MA)测序确认质粒修饰。
[0巧0] 通过由化Ol和化nl切除来移除PZA31G中存在的启动子化tetO-1和核糖体结合 位点（RB巧并且用相同的RBS和EagI限制位点进行替换。然后将位于识别位点间的启动 子和/或终止子和未定位在识别位点之间的下游奸P组成的基于重组酶的计算设备的所有 组件Gibson组装在PZA31GCmR中的AatII限制位点与化Ol限制位点之间。所有其他设 计（即包括定位在识别位点之间的奸P的那些组件）被Gibson组装在AatII限制位点与 AvrII限制位点之间。
[0巧。Bxb1基因被克隆到来自化11ura等的核糖核酸调节子载体rrjC12y(rii)g之变体 的限制位点化nl与HindIII之间巧9, 30]。该高拷贝数质粒包含卡那霉素抗性W及驱动 taRNA(反式激活RNA)版本taRl巧和Bxbl转录的PLuxI启动子。Bxbl基因具有RBS上游 的CrRl巧顺式抑制序列。
[0巧引 地iC31基因获自Addgene质粒18941 (Cambridge,MA)。将地iC31基因克隆到来 自Callura等的核糖核酸调节子载体rrjcl2y(11)g之变体的限制位点化nl与PstI之间 巧9, 30]。该中拷贝数质粒包含簇节青霉素抗性W及驱动两个taRNA版本taR12和地iC31 转录的化tetO-1启动子。地iC31基因具有RBS上游的crR12顺式抑制序列。
[0巧3] Gibson组装
[0254] Gibson组装用于将启动子（proD) [5]、终止子（Tl) [6]W及输出基因（g巧）[6]模 块连接在一起（表2)W在单步反应中实现集成逻辑与存储的质粒。
[0巧5] 经设计包含提供与相邻片段重叠之序列的"突出物"的PCR引物通过PCR构建序 列重叠约40碱基的DNA片段。遵循Gibson等人所描述的方案巧引。简言之，通过添加W下物质来制备Gibson组装主体混合物（mastermix) :320JiL的5XISO缓冲液、0.64JiL的 IOU/yL巧核酸外切酶、20yL的 2U/yLPHUSIONS谏合酶、160yL的 40U/yLhq 连接酶，并将其用水补足1. 2mL。准备15yL的等分试样并用于单个Gibson反应。接下来， 将10化g的线性载体骨架W及等摩尔量的其他组装件添加到15yL主体混合物，20yL总体 积组装反应混合物。组装反应在50°C解育60分钟，并且5yL的装配反应物转化到100yL 的感受态大肠杆菌中。
[0巧6] 基于重组酶计算流式细胞仪测量结果
[0257] 在进行流式细胞仪测量之前，细胞在无诱导物的培养基中培养过夜并且然后如 所指示的，在具有最终浓度为20ng/mL的诱导物无水四环素（Sigma)和/或最终浓度为IyM的N-酷基高丝氨酸内醋（AHL)的培养基中按1 : 1000稀释。在诱导物作用下培养 细胞4小时，将细胞洗涂，按1 : 1000稀释并且在诱导物作用下在37°C、300rpm下培养过 夜。接下来，在没有诱导物的情况下，细胞在培养基中离屯、并且洗涂。然后，细胞按1 : 100 稀释到包含新鲜的IX憐酸盐缓冲盐水（PBS)的新的96孔板中并且立即使用抓-FACS LSRFortessa-HTS细胞分析仪度Dbiosciences，CA)进行测定。FlowJo(Treestar)OR)用 于数据分析及可视化。用488nm的氣激光器激发W及515nm至545nm发射滤光片测量巧光。 为了确保样品之间的一致性，针对每个样品采集50, 000个细胞并且设口。应用一致的阔值 来确定认为GFP阳性（ON状态）或者GFP阴性（OFF状态）的细胞百分比（图5)。经过S 次独立实验对表达GFP的细胞百分比进行平均。误差条表示均值的标准误差。
[0巧引经过多代的稳定存储维持
[0259] 为了研究我们的基于重组酶的存储设备的时间稳定性，如上面所述的包含AND口 的细胞被从OFF诱导成ON。然后运些细胞在没有诱导物的培养基中每天重复培养并且按 1 : 2000稀释，持续9天，W实现每天约11代。如本文所述的，使用流式细胞术通过测量绿 色巧光蛋白的表达分别监测细胞维持其状态的能力。本发明的逻辑与存储系统保持状态持 续至少约90次细胞倍增。运些数据表明该系统的长期的运行稳定性。
[0260] 细胞死亡之后的稳定存储维持
[0261] 包含NOR口的细胞暴露于没有输入、仅AHL、仅aTcW及AHL和aTc两者过夜，离 屯、、洗涂然后通过使它们暴露于90°C持续30分钟将其杀死。根据制造商的说明书使用 -JPHUSION漫)PCR试剂盒（New化glandBiol油）对从死亡细胞分离的DM进行PCR。利 用具有双48/48快速反应模块的Bio-RadS1000?热循环仪度ioRad)进行PCR。在1%的 琼脂糖凝胶上通过电泳分析PCR产物。
[0262] 图4中所使用的特定引物：
[026引 Pl:GGCGCGTACTCCTAAGAAAC(沈QIDNO:1)
[0264] P2:TCTCCGTCGTCAGGATCATC(沈QIDNO: 2)
[026引 P3:ATTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGC(沈QIDNO : 3)
[0266] P4:AAAGTTAAACAAAATTATTTGTAGAGGG(沈QIDNO:4)
[0267] 表2.用于实现集成逻辑与存储的合成部件 [026引
[0269]
[0270]
[0271] 参考文献：?下参考文献中的每一个均通过引用并入本文。 1 1.Hasty，J.，McMillen,D.feCollins，J.J.Engineeredgenecircuits.Nature
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