[0150] 如本文中所使用的，"诱导型启动子"是特征为在诱导物或诱导剂存在，受诱导物 或诱导剂影响或者与诱导物或诱导剂接触时起始或增强转录活性的启动子。"诱导物"或 "诱导剂"可W是内源性的或者通常是W在诱导从诱导型启动子的转录活性中起作用的方 式被施用的外源性化合物或蛋白质。
[0151] 根据本发明使用的诱导型启动子可W在原核宿主生物体和真核宿主生物体两者 中起作用。在一些实施方案中，使用了哺乳动物的诱导型启动子。本文所使用的哺乳动物 诱导型启动子的实例包括但不限于IVt型启动子：PAIK、PAKT、PBIT、PEK5、Pm、P?、PNK、PpiP、PR0P、 PsPA/PsCA、PTET、PTtgR，PRep型启动子：Pcu。、PETR0N8、PNIc、PpIR0N、PscA0N8、PTet。、PL)REX8，PHyb型启动 子：tetOy-ETRs-PhCMViiiin、tetOy-PIRs-ETRs-PhCMViiiin及ScbR^IRs-PhCMViiiin。在一些头施方案中， 可W使用来自其他生物体的诱导型启动子W及设计成在原核宿主或真核宿主中起作用的 合成启动子。本文所使用的非哺乳动物诱导型启动子的实例包括但不限于慢病毒启动子 (例如，EFa、CMV、人突触蛋白IOiSynU、CaMKIIa、hGFAP和TPH-。W及腺相关病毒启动 子（例如，CaMKIIa(AAV5)、hSynI(AAV2)、Mhyl(AAV5)、fSST(AAVl)、hGFAP(AAV5,AAV8)、 MBP(AAV8)、SST(AAV2))。本发明的诱导型启动子的特有的一个重要功能特征是其通过暴露 于外部施加的诱导物的诱导性。
[0152] 诱导物的施用或移除导致有效连接的核酸序列（例如，编码重组酶的核酸）的转 录在"ON"状态或"OFF"状态之间切换。因此，如本文中所使用的，与核酸序列有效连接的 启动子的"ON"状态指的是在启动子有效地驱动核酸序列的转录（即连接的核酸被表达） 时的状态。相反，与核酸序列有效连接或者有条件地有效连接的启动子的"OFF"状态指的 是在启动子未有效地驱动核酸序列的转录（即连接的核酸不被表达）时的状态。
[0153]根据本发明使用的诱导型启动子可W被一个或更多个生理条件诱导（或抑制）， 例如，pH、溫度、福射、渗透压、盐水梯度、细胞表面结合及一种或更多种外部或内部诱导剂 之浓度的变化。外部的诱导物或者诱导剂可包括但不限于氨基酸及氨基酸类似物、糖类及 多糖、核酸、蛋白质转录激活因子和阻遏物、细胞因子、毒素、基于石油的化合物、含金属的 化合物、盐、离子、酶底物类似物、激素或其组合。诱导或抑制诱导型启动子的条件和/或试 剂可W是本文所描述的逻辑口的输入。
[0154] 根据本发明使用的诱导型启动子包括本领域普通技术人员已知的或本文所描述 的任何诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于化学/生物化学调控及物理调控 的启动子，例如醇调控的启动子、四环素调控的启动子（例如，无水四环素（aTc)-响应性启 动子及其他四环素响应性启动子系统，其包括四环素阻遏蛋白（tetR)、四环素操纵子序列 (tetO)及四环素转录活化因子融合蛋白（tTA))、类固醇调控启动子（例如，基于大鼠糖皮 质激素受体的启动子、基于人雌激素受体的启动子、基于蛾蚁皮激素受体的启动子W及来 自类固醇/类视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子）、金属调控的启动子（例如，源于来自 酵母、大鼠及人的金属硫蛋白（结合并馨合金属离子的蛋白质）基因的启动子）、发病机制 调控的启动子（pathogenesis-regulatedpromoter)(例如，由水杨酸、乙締或苯并嚷二挫 度TH)诱导的启动子）、溫度/热诱导型启动子（例如热休克启动子）W及光调控的启动子 (例如，来自植物细胞的光响应性启动子）。
[01巧]在一些实施方案中，根据本发明所使用的诱导物是N-酷基高丝氨酸内醋（AHL)， 运是参与细菌细胞密度感受（quorumsensing)的一类信号传导分子。细胞密度感受是能 够基于种群密度协调基于群体之行为的细菌之间通信的方法。AHL可扩散透过细胞膜并且 在一定抑范围内在生长培养基中是稳定的。AHL可结合到转录激活因子（如LuxR)并且刺 激从同源启动子转录。
[0156]在一些实施方案中，根据本发明所使用的诱导物是无水四环素（aTc)，其是不显示 抗生素活性的四环素的衍生物并且被设计用于受四环素控制的基因表达系统，例如在细菌 中。
[0157] 根据本发明可W使用其他诱导型启动子系统。
[015引 终止子
[0159] 本文提供了在本发明的一些实施方案中使用的终止子序列。如本文所使用的"终 止子"或"终止子序列"是导致转录停止的核酸序列。终止子可W是单向的或双向的。其由 设及特异性终止RNA聚合酶转录RNA的DNA序列构成。终止子序列阻止上游启动子转录激 活下游核酸序列。因此，在某些实施方案中，考虑了使RNA转录物的产生结束的终止子。终 止子对于在体内实现期望的输出表达水平（例如，低输出水平）可W是必需的。
[0160] 最常用类型的终止子是正向终止子。当放置在通常转录的核酸序列的下游时，正 向转录终止子使转录中止。在一些实施方案中，提供了双向转录终止子，其通常使转录在正 向链和反向链上都终止。在一些实施方案中，提供了反向转录终止子，其通常使仅在反向链 上的转录终止。
[0161] 在原核系统中，终止子通常分成两个类别（1)P不依赖型终止子和（2)P依赖型 终止子。P不依赖型终止子通常由形成茎环的富含G-C碱基对的回文序列后接若干T碱基 构成。在不希望受理论约束的情况下，转录终止的常规模型是茎环使RNA聚合酶暂停，并且 聚腺巧酸尾的转录使RNA:DNA双链体解开并且与RNA聚合酶分离。
[0162] 在真核系统中，终止子区可W包含允许新转录物的位点特异性切割W暴露聚腺巧 酸化位点的特定DNA序列。其给特定内源性聚合酶发信号W给转录物的3'端添加约200 个A残基（聚腺巧酸）的段（stretch)。用该聚腺巧酸尾修饰的RNA分子显得更稳定并且 更有效地被翻译。因此，在设及真核细胞的一些实施方案中，终止子可W包含用于RNA切割 的信息。在一些实施方案中，终止子信号促进信使的聚腺巧酸化。终止子和/或聚腺巧酸 化位点元件可W用于增强输出核酸水平和/或使核酸之间的连读减至最低。
[0163] 根据本发明使用的终止子包括本领域普通技术人员已知的或本文所描述的任何 转录终止子。终止子的实例包括但不限于基因的终止序列例如牛生长激素终止子，W及病 毒终止序列例如SV40 终止子、spy、yejM、secG-leuU、t虹LABC、rrnBT1、hisLGDCBHAFI、 metZWV、;miC、xapR、aspA及arcA终止子。在一些实施方案中，终止信号可W是不被转录或 翻译的序列，如由于序列截短所产生的那些序列。
[0164] 根据本发明可W使用其他诱导型启动子系统。
[0165] 输出核酸序列及输出产物
[0166] 提供了根据本发明使用的多种输出核酸序列及输出产物。如本文所使用的"输出 产物"指的是可W用作为本文中所描述的逻辑口和系统的特定状态之标志物的基因产物。 本发明的输出核酸序列可在接收到特定输入后编码用于追踪或标记细胞状态的蛋白质或 RNA。运样的输出产物可用于区分细胞的各种状态（例如，"ON"或"OFF")。本发明的逻辑 与存储系统的代表性输出产物包括但不限于报道蛋白、转录阻遏物、转录激活因子、选择标 志物、酶、受体蛋白、配体蛋白、RNA、核糖开关、短发夹RNA或重组酶。本发明的一些方面设 及包括多个逻辑口（例如，至少两个逻辑口）的逻辑与存储系统。应当理解的是，在运样的 系统中，每个逻辑口可W包括一个或更多个不同的输出核酸（例如，其编码不同的或独特 的输出产物）。因此，单个细胞或系统可W包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的 输出核酸。
[0167] 报道分子Cr巧orter)输出产物
[016引在一些实施方案中，本发明的输出核酸序列可W编码"报道分子"。如本文所使用 的报道分子指的是可用于测量基因表达并且一般产生可测量信号（如巧光、发光或颜色） 的蛋白质。容易观察到细胞或生物体中报道分子的存在。例如，巧光蛋白（例如GFP)在用 特定波长的光激发时导致细胞发巧光，巧光素酶导致细胞催化产生光的反应，并且酶（如 0-半乳糖甘酶）将底物转化成有颜色的产物。在一些实施方案中，报道分子可W用于量化 由本发明的系统所接收的输入的强度或活性。在一些实施方案中，报道分子能够框内融合 至其他蛋白质编码序列，W鉴定蛋白质在细胞体或生物体内的定位。根据本发明使用的报 道分子包括本领域普通技术人员已知的或本文所描述的任何报道分子。
[0169] 取决于具体的报道分子W及想要哪种特征数据，存在测量或量化报道分子的若干 不同方式。在一些实施方案中，显微术可W是用于获得报道分子活性（尤其是在单个细胞 水平）的空间信息和时间信息两者的有用技术。在一些实施方案中，流式细胞仪可W用于 测量跨一大群细胞的报道分子活性的分布。在一些实施方案中，读板仪（platereader) 可W用于获取许多不同的样品随时间的群平均测量结果。在一些实施方案中，可W使用 组合运样的多种功能的仪器，如被设计成流式细胞仪的多孔板检测仪（multiplexplate reader)、W及显微术和流式细胞术仪器的组合。
[0170] 巧光蛋白可W用于目视观察或定量逻辑口 /系统的输出。使用装备的显微镜、读 板仪或流式细胞仪用适当波长的光激发巧光蛋白可W容易地定量巧光。若干不同的巧光蛋 白是可得的，因此可W并行进行多基因表达测量。根据本发明可使用的编码巧光蛋白之基 因的实例包括但不限于通过引用并入本文中的美国专利申请No. 2012/0003630中提供的 那些蛋白（参见表59)。
[0171] 巧光素酶也可W用于目视观察或定量逻辑口 /系统的输出，尤其用于测量低水平 的基因表达，因为在不存在巧光素酶的情况下细胞倾向于具有极低的背景发光至没有背景 发光。使用读板仪或发光计数器（luminescencecounter)可W容易地定量发光。可根据 本发明使用的编码巧光素酶之基因的实例包括但不限于dmMyD88-接头-Rluc、dmMyD88-接 头-Rluc-接头-PEST191化及（来自北美蛋火虫（Photinuspyralis)的）蛋火虫巧光素 酶。
[0172] 产生有颜色的底物的酶（"比色酶"）也可W用于目视观察或定量逻辑口 /系统的 输出。可W使用分光光度计或可获取吸光度测量值的其他仪器（包括读板仪）来定量酶促 产物。与巧光素酶类似，酶（如P-半乳糖巧酶）可W用于测量低水平的基因表达，因为它 们倾向于放大低信号。可W根据本发明使用的编码比色酶之基因的实例包括但不限于IacZ 曰片段、IacZ(编码全长0 -半乳糖巧酶）和巧化。
[0173] 转录输出
[0174] 在一些实施方案中，本发明的输出核酸序列可W编码转录激活因子或阻遏物，由 输出基因生成的转录激活因子或阻遏物可W导致细胞状态的进一步改变，并且给后续的或 另外的逻辑口提供另外的输入信号。转录调节子激活或者抑制从同源启动子的转录。转录 激活因子通常结合在转录启动子附近并且招募RNA聚合酶W直接起始转录。阻遏物结合至 转录启动子并且空间上阻止由RNA聚合酶起始的转录。其他转录调节子根据其结合哪里W 及细胞状况而充当激活因子或者阻遏物。根据本发明使用的转录调节子包括本领域普通技 术人员已知的或者本文中所描述的任何转录调节子。根据本发明可使用的编码转录调节子 之基因的实例包括但不限于在通过引用并入本文的美国专利申请No. 2012/0003630中所 提供的那些调节子（参见表63)。
[01巧]选择标志物输出
[0176] 在一些实施方案中，本发明的输出核酸序列可W编码选择标志物。如本文所使用 的"选择标志物"指的是赋予生物学单位（如细胞）选择优势或选择劣势的蛋白质编码序 列。例如，常见类型的原核选择标志物是赋予对特定抗生素之抗性的选择标志物。因此，尽 管存在抗生素，携带选择标志物的细胞也可W在培养基中生长。例如，大多数质粒包含抗生 素选择标志物，W确保质粒在细胞复制和分裂期间被维持，因为失去质粒拷贝的细胞会很 快死亡或者无法在补充有抗生素的培养基中生长。通常被称为阳性选择标志物的第二常见 类型的选择标志物对细胞是有毒的。在克隆期间经常使用阳性选择标志物来针对用克隆用 载体转化的细胞进行选择并且确保细胞仅被含有插入物的质粒转化。根据本发明所使用的 选择标志物包括本领域普通技术人员已知的或者本文所述的任何选择标志物。可W根据本 发明使用的编码选择标志物之基因的实例包括但不限于在通过引用并入本文的美国专利 申请No. 2012/0003630中所提供的那些标记物（参见表64)。
[0177] 酶输出
[017引在一些实施方案中，本发明的输出核酸序列可W编码酶。在一些实施方案中，酶用 作为对特定输入的响应。例如，响应于由本发明的逻辑与存储系统所接收的特定输入，如环 境中存在的一定范围的毒素浓度，系统可W将包含输出核酸序列的逻辑口调到"0N"，所述 输出核酸序列编码可降解或W其他方式破坏毒素的酶。
[0179] 在一些实施方案中，输出产物可W是催化底物转变成产物的"生物合成酶"。例如， 根据本发明可W使用的此类生物合成酶响应于特定信号组装产生或降解有用的化学物质 或材料的途径。酶的运些组合可W重组自然的生物合成途径或者合成的生物合成途径。运 些酶在特定化学物质、生物燃料和生物除污中有应用。根据本发明使用的酶包括本领域普 通技术人员已知的或者本文中所描述的任何酶。可W根据本发明使用的编码酶之基因的实 例包括但不限于在通过引用并入本文中的美国专利申请No. 2012/0003630中所提供的那 些酶。
[0180] 受体、配体和水解蛋白
[0181] 在一些实施方案中，本发明的输出核酸序列可W编码受体、配体和水解蛋白。受体 倾向于具有=个结构域：用于结合配体（如蛋白质、肤或小分子）的胞外结构域，跨膜结构 域W及胞内或胞质结构域，其经常可W参与某种类型的信号转导事件如憐酸化作用。在一 些实施方案中，转运蛋白、通道或累用作输出产物。转运蛋白是负责跨细胞膜运输物质的膜 蛋白。通道由形成所选择的离子可扩散通过之跨膜孔的蛋白质构成。累是可在称为主动运 输的能量依赖过程中逆物质梯度移动物质的膜蛋白。在一些实施方案中，根据本发明可W 使用编码主要目的是结合其他蛋白质、离子、小分子及其他配体的蛋白质和蛋白质结构域 的核酸序列。根据本发明使用的受体、配体和水解蛋白包括本领域普通技术人员已知的或 者本文中所描述的任何受体、配体和水解蛋白。编码根据本发明可W使用的受体、配体和水 解蛋白之基因的实例包括但不限于在通过引用并入本文的美国专利申请No. 2012/0003630 中所提供的那些受体、配体和水解蛋白（参见表73)。
[0182] 逻辑口和系统的基因工程
[0183] 待改造的用于本发明合成逻辑与存储系统的细胞可W是任何细胞或宿主细胞。如 本文所限定的"细胞"或"细胞系统"是所有已知独立的活生物体的基本结构与功能单元。 它是被分类为生物（livingthing)的生命的最小单元。一些生物体（如大多数细菌）是 单细胞的（由单个细胞组成）。另一些生物体（如人）是多细胞的。
[0184] 在一些实施方案中，根据本发明使用的细胞是原核细胞，其可W包含细胞膜^及 胞质区，所述胞质区含有细胞基因组化NA)和核糖体^及多种内含物。在一些实施方案 中，细胞是细菌细胞。如本文中所使用的术语"细菌"涵盖细菌的所有变体，例如，原核生 物体及蓝细菌（cyanobacteria)。细菌是小的（通常为约1微米的线性尺寸）、非区室 化的、具有环状DNA和70S的核糖体。术语细菌还包括真细菌巧Ubacteria)和古细菌 (Archaebacteria)的细菌细分。真细菌可W根据细胞壁结构的差异进一步细分成革兰氏阳 性真细菌和革兰氏阴性真细菌。本文还包括仅基于整体形态分类的那些细菌（例如，球菌、 杆菌）。在一些实施方案中，细菌细胞是革兰氏阴性细胞，而在一些实施方案中，细菌细胞是 革兰氏阳性细胞。根据本发明可^使用的细菌细胞的实例包括但不限于来自耶尔森氏菌属 (Yersiniaspp.)、埃希氏菌属巧scherichiaspp.)、克雷伯氏菌属化Iebsiellaspp.)、博 德特氏菌属化ordetellaspp.)、奈瑟氏球菌属（Neisseriaspp.)、气单胞菌属（Aeromonas spp.)、弗朗西斯氏菌属（Rranciesellaspp.)、科里氏杆菌属（Corynebacteriumspp.)、 梓樣酸杆菌属（Citrobacterspp.)、衣原体属（QTamydiaspp.)、嗜血菌属（Hemophilus spp.)、布鲁氏菌属化rucelIaspp.)、分支杆菌属（Mycobacteriumspp.)、军团菌属 (Legionellaspp.)、红球菌属（Rhodococcusspp.)、假单胞菌属巧seudomonasspp.)、螺 杆菌属（Helicobacterspp.)、沙口 氏菌属（Salmonellaspp.)、弧菌属（ViLbriospp.)、芽 抱杆菌属化acillusspp.)、丹毒丝菌属（Erysipelothrixspp.)、沙口 氏菌属（Salmonella spp.)、链霉菌属（Stremtomycesspp.)的细胞。在一些实施方案中，细菌细胞来自金黄 色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、枯草芽抱杆菌化acillussubtilis)、拜氏梭菌 (Clostridiumbutyricum)、乳酸发酵短杆菌（BreviLbacteriumIactofermentum)、无乳 链球菌（Streptococcusagalactiae)、乳酸乳球菌（XactococcusIactis)、乳明串珠菌 (XeuconostocIactis)、链霉菌属（Streptomyces)、伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinobycetemcomitans)、拟杆菌属化acteroides)、蓝细菌、大肠杆菌巧scherichia coli)、幽口螺杆菌（}felobacterpylori)、反当月形单胞菌（Selnomonasruminatium)、 索氏志贺氏菌（Shigellasonnei)、运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis)、葦状支原 体（Mycoplasmamycoides)、齿垢密螺旋体（Tr邱onemadenticola)、苏云金芽抱杆 菌(Bacillusthuri打gie打sis)、里昂葡萄球菌(StaphlococcusIugdunensis) > ? ? 球菌（Xeuconostocoenos)、干燥分枝杆菌（Corynebacteriumxerosis)、植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)、粪肠球菌（Streptococcusfaecalis)、凝结芽胞杆菌 化acilluscoagulans)、蜡状芽抱杆菌化acillusceretus)、日本甲虫芽抱杆菌化acillus popillae)、集胞蓝细菌属菌株PCC6803(SynechocystisstrainPCC6803)、液化无色杆 菌化acillusIiquefaciens)、火球菌（Pyrococcusabyssi)、月形单胞菌（Selenomonas nominantium)、希氏季L杆菌（LactobacillushiIgardii)、野生链球菌（Streptococcus ferus)、戊糖乳杆菌(Xactobacilluspentosus)、脆弱拟杆菌化acteroidesfragilis)、表 皮葡萄球菌（Staphylococcus邱idermidis)、运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis)、暗 产色链霉菌（Streptomycesphaechromogenes)、加纳链霉菌（Streptomycesghanaenis)、 盐杆菌属菌株GRB(HalobacteriumstrainGRB)或富盐菌属菌株Aa2. 2(Halobaferax sp.strainAa2. 2)D
[0185] 在一些实施方案中，根据本发明使用的细胞是真核细胞，其包含其中具体代谢活 动发生的膜结合区室，例如细胞核。根据发明使用的真核细胞的实例包括但不限于哺乳动 物细胞、昆虫细胞、酵母细胞（例如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae))及植物细胞。 在一些实施方案中，真核细胞来自脊椎动物。根据本发明使用的脊椎动物细胞的实例包括 但不限于包括生殖细胞和非生殖细胞，所述生殖细胞包括精子、卵和胚胎细胞，所述非生殖 细胞包括肾脏细胞、肺细胞、脾脏细胞、淋己细胞、屯、脏细胞、胃细胞、肠细胞、膜腺细胞、肌 肉细胞、骨细胞、神经细胞、脑细胞及上皮细胞。还可W使用包括胚胎干细胞的干细胞。
[0186] 在一些实施方案中，可W根据本发明使用非细胞系统如病毒或隧菌体。例如，可W 通过直接整合逻辑系统核酸将合成逻辑与存储系统的任意一个或更多个组件引入到例如 病毒基因组中。如本文所述使用的病毒可W是双链DNA(dsDNA)病毒（例如，腺病毒、瘤疹病 毒、痘病毒），单链DNA(ssDNA)病毒（(+)有义DNA)(例如细小病毒）；双链RNA(dsRNA)病 毒（例如，呼肠孤科病毒）；(+)ssRNA病毒（(+)有义RNA)(例如，细小核糖核酸病毒、披膜病 毒）；(-)ssRNA病毒（(-)有义RNA)(例如正粘病毒、弹状病毒）；单链RNA(ssRNA)-逆转录 酶病毒（生命周期中的（+)有义RNA伴有DNA中间体）（例如逆转录病毒）；或者dsDNA-逆 转录病毒（例如嗜肝DNA病毒）。
[0187] 病毒还可W包括植物病毒W及隧菌体化acteriophages)或隧菌体（phages)。可 W根据本发明使用的隧菌体家族的实例包括但不限于肌隧菌体科（Myoviridae) (T4样隧 菌体属（T4-1ikeviruses)、Pl样隧菌体属、P2样隧菌体属、Mu样隧菌体属、SPOl样隧菌 体属、地iH样隧菌体属）；长尾隧菌体科（Siphoviridae) 丫样隧菌体属（Tl样隧菌体属、 巧样隧菌体属、c2样隧菌体属、L5样隧菌体属、.4 .Ml样隧菌体属、地iC31样隧菌体属、 N15样隧菌体属）；短尾隧菌体科（Podoviridae)灯7样隧菌体属、phi29样隧菌体属、P22 样隧菌体属、M样隧菌体属）；复层隧菌体科（Tectiviridae)(覆盖层病毒）；覆盖隧菌体 科（Corticoviridae)(被盖病毒）；脂毛隧菌体科(Xipot虹ixviridae) (a脂毛病毒、P脂 毛病毒、T脂毛病毒、5脂毛病毒）；芽生隧菌体科（Plasmaviridae)(芽生病毒）；古隧菌 体科（Rudiviridae)(古隧菌体属（Rudivirus));微小纺键形隧菌体科（F'uselloviridae) (微小纺键形隧菌体属（化selIovirus));丝状病毒科（Inoviridae)(丝状隧菌体属 (Inovirus)、杆状隧菌体属（Plectrovirus));微小隧菌体科（Microviridae)(微小隧菌体 属、螺旋体微小隧菌体属（Spiromicrovirus)、赔弧