一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和转基因研究领域，可用于转基因的定向插入和多基因的 定向叠加。更具体地讲，本发明涉及一种36bplox特异性重组位点的表达载体，同时涉及到 含有Iox特异性重组位点表达载体的构建方法，以及该发明在植物转基因和基因工程中的 应用。
【背景技术】
[0002]Cre/lox重组系统包括Cre重组酶和Iox位点两个部分，Cre重组酶由大肠杆菌噬 菌体Pl的Cre基因编码，由343个氨基酸组成，它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似， 识别特异的DNA序列，如：Iox位点，引起重组。
[0003]Lox位点是Cre重组酶作用的特异性重组位点，野生的Iox位点被称为loxP，由 34bp组成，S卩：ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，两个 13bp的反向重复顺序和 8bp 的间隔区域构成。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，作用于多种结构的 DNA底物，如线形、环状，甚至超螺旋（被Cre重组酶解螺旋成为线形结构）。Cre重组酶通 过与DNA上Iox位点的结合，发挥其重组作用（TrinhKR，MorrisonSL2000Site-specific anddirectionalgenereplacementmediatedbyCrerecombinase.Journalof ImmunologicalMethods244(I) :185-193.)。
[0004] 正常IoxP是一种回文序列结构，长34bp，由2个13bp的反向重复序列和8bp的非 对称间隔序列构成。本发明设计的lox66位点包括1段8bp的非对称间隔序列、1段13bp 的反向重复序列、1段13bp的反向重复突变序列及与之相邻的2bp保护序列，杂交实验证明 该位点具有正常的重组功能。Lox71位点也存在一个反向重复序列突变位点（YuWC，Lamb JC,HanFP,BirchlerJA2006Telomere_mediatedchromosomaltruncationinmaize. Proc.Natl.Acad.Sci. 103(46) :17331-17336.)，当lox66 与lox71 发生重组后，形成一个 正常的Ioxp位点和一个具有突变的两个反向重复序列的Iox位点，这样就无法进行可逆过 程，使得重组发生之后不会回复，为多基因的叠加奠定了基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了能够提供一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法 与应用。
[0006] 一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法，以下步骤：
[0007]第一步：MS培养基配方：
[0008]
[0013] 以上溶液均配成IOOX的母液；
[0014]第二步：
[0015]筛选培养基：MS+3mg/L6_BA+0.lmg/LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar+13mg/L卡 那霉素，
[0016]生根培养基：MS+0. 2mg/L NAA+400mg/L Car+15mg/L卡那霉素，
[0017]YEB培养基：牛肉膏（5g/L)，酵母抽提物（lg/L)，蛋白胨（5g/L)，蔗糖（5g/L)，MgS04(2mmol/L)pH7. 2,固体培养基含琼脂 15g/L，
[0018]LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7. 0,再补足水至1L， 固体培养基含琼脂15g/L;
[0019] 第三步：质粒DNA的酶切及其产物的纯化，
[0020] 第四步：DNA的连接；
[0021] 第五步：连接产物的重组子鉴定。
[0022] 本发明的有益效果：含有CRE/loxP位点特异性重组系统的表达载体Cre40的构 建及其转基因油菜植株的获得，为未来在油菜中实施多基因叠加并对油菜进行基因工程改 良、或利用所得材料作为生物反应器生产目的产品等提供了一种新的途径。
【附图说明】
[0023] 为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明描述中所需要使用的附图 作简单地介绍。
[0024] 图1表达载体pBI121质粒图谱。
[0025] 图2表达载体Cre40质粒图谱。
[0026] 图3阳性克隆的酶切鉴定。
[0027] 图4Cre40转基因植株PCR检测结果。
[0028] 图5内标PDS基因表达。
[0029] 图6CRE基因表达。
[0030] 图7Cre40载体重组功能验证
【具体实施方式】
[0031] 1材料与方法
[0032] I. 1试验材料
[0033] I. L 1供试油菜品种
[0034] 甘蓝型油菜品种中油821，该品种油菜及其转基因植株种植于中国农业科学院油 料作物研究所网室。
[0035] I. 1. 2菌株
[0036] 大肠杆菌（Escherichiacoli)DH5a、农杆菌菌株EHA105及LBA4404由本实验室 保存。
[0037]I. 1. 3 载体
[0038]pMD18-T载体购自TaKaRa公司
[0039]pBI121，pBI-GFP由本实验室保存
[0040] I. 1. 4主要试剂
[0041]dNTP、TaqDNA聚合酶和LA-Taq酶。
[0042] 限制性内切酶。
[0043]T4-DNA连接酶。
[0044]CTAB等。
[0045] 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）。
[0046]PCR引物。
[0047]测序。
[0048] 文中提及的其余试剂均为国产分析纯产品。
[0049]第一步：
[0050]MS培养基配方：
[0051]
[0057] 以上溶液均配成IOOX的母液。
[0058]第二步：
[0059]筛选培养基：MS+3mg/L6_BA+0.lmg/LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar+13mg/L卡 那霉素。
[0060]生根培养基：MS+0. 2mg/L NAA+400mg/L Car+15mg/L卡那霉素。
[0061]YEB培养基：牛肉膏（5g/L)，酵母抽提物（lg/L)，蛋白胨（5g/L)，蔗糖（5g/L)，MgS04(2mmol/L)pH7. 2,固体培养基含琼脂 15g/L。
[0062]LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7. 0,再补足水至1L， 固体培养基含琼脂15g/L。
[0063] 1. 2试验方法
[0064] I. 2. 1质粒DNA的酶切及其产物的纯化
[0065] 1.取上述质粒0嫩1.0-2.0 1^，加入相应酶的10\8虹€6^.0 111，最后加入相应 的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37°C酶切2-4小时。
[0066] 2.在1%的琼脂糖凝胶上电泳，分离片段。
[0067] 3.凝胶成像照相后，紫外下切割目的片段，采用凝胶回收试剂盒回收目的片段，同 上。
[0068] 取2 y 1在1%的琼脂糖凝胶上电泳，检测回收目的片段大小和浓度。
[0069] I.2. 2DNA的连接
[0070] 1.按外源片段和载体比为1 : 1-10 : 1的量，加入相应量的片段。取回收的目的 片段20_50ng，进行连接。
[0071] 2?加入IOXT4Ligation BufferL 0 y 1，3U T4DNA Ligase (Promega)，总体积不超 过10 y 1〇
[0072] 3.连接反应程序：KTC3分钟；从KTC经历3分钟升至16°C; 16°C3分钟；18°C1 分钟；17个循环，后65°C5分钟灭活连接酶。
[0073] 4.结束后将反应液取5 y 1至透析膜上加无菌水于4°C透析20分钟，取连接产物 和20 y 1感受态细胞混合，进行电激转化。参数2K Q，330 yF，330-350V。
[0074] 5?电激后将菌体转入ImlSOC中，37°C200rpm培养50分钟。后铺板于含抗生素 的LB培养皿上。
[0075] 1. 2. 3连接产物的重组子鉴定
[0076] 1.挑取单菌落于相应的抗生素LB中，摇菌37°C过夜培养。
[0077] 2.采用碱裂解法提取质粒。
[0078] 3.取上述质粒0嫩1.0-2.0 1^，加入相应酶的10\8虹€6^.(^1，最后加入相应 的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37°C酶切2-4小时。
[0079] 4.在1%的琼脂糖凝胶上电泳，检测分离片段大小。是否和预计插入片段相符。如 有必要，还可测序分析插入序列。
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